任麗莉　劉超　王一曌

[摘要] 目的 研究活化的蛋白激酶C受體（Receptor for activated protein kinase C，RACK1）與蛋白激酶WEE1互作調(diào)控胃癌細(xì)胞株HGC27生長(zhǎng)增殖及其作用機(jī)制。 方法 采用LipofectAMINE 2000在HGC27細(xì)胞中過表達(dá)RACK1，Western blotting檢測(cè)HGC27細(xì)胞中WEE1蛋白表達(dá)；免疫共沉淀驗(yàn)證RACK1和WEE1在HGC27細(xì)胞內(nèi)存在相互作用；細(xì)胞內(nèi)免疫熒光觀測(cè)RACK1與WEE1在HGC27細(xì)胞中的表達(dá)定位情況。 結(jié)果 過表達(dá)RACK1后WEE1在胃癌細(xì)胞HGC27中的表達(dá)降低，RACK1與WEE1在HGC27細(xì)胞內(nèi)存在相互作用且共定位在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。結(jié)論 RACK1與WEE1共同作用調(diào)控胃癌的發(fā)生發(fā)展過程，為RACK1成為臨床上胃癌治療的潛在靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 活化的蛋白激酶C受體；WEE1；胃癌；HGC27細(xì)胞

[中圖分類號(hào)] R735.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2017）23-0029-04

[Abstract] Objective To study the regulatory role of the interaction of scaffolding protein RACK1 with protein kinase WEE1 in the proliferation of gastric cancer cell line HGC27 and the mechanism. Methods RACK1 was overexpressed in HGC27 cells by LipofectAMINE 2000. Western blotting was used to detect the expression of WEE1 protein in HGC27 cells. Immunoprecipitation showed that RACK1 interacted with WEE1 in HGC27 cells. Immunofluorescence was used to observe the expression and positioning of RACK1 and WEE1 in HGC27 cells. Results After expression of RACK1， the expression of WEE1 in gastric cancer cells HGC27 was decreased， and RACK1 interacted with WEE1 in HGC27 cells， and they co-localized in cytoplasm. Conclusion The interaction of RACK1 with WEE1 regulates the development and progression of gastric cancer， and it provides the theoretical basis and experimental basis for RACK1 to be a potential target for clinical treatment of gastric cancer.

[Key words] Activated protein kinase C receptor； WEE1； Gastric cancer； HGC27 cells

胃癌是最常見的惡性消化道腫瘤之一，在中國(guó)胃癌發(fā)病率位于惡性腫瘤第二名。尤其在中國(guó)的農(nóng)村地區(qū)，更位于各種惡性腫瘤之首[1]。因此，對(duì)胃癌進(jìn)行早期診斷和治療十分必要。所以，尋找胃癌的分子標(biāo)記物對(duì)研究胃癌發(fā)生發(fā)展就顯得非常有意義?；罨牡鞍准っ窩受體（Receptor for activated protein kinase C，RACK1）作為支架蛋白，可介導(dǎo)多種蛋白的性質(zhì)和功能。如和激活的PKC相互作用，調(diào)節(jié)其在細(xì)胞內(nèi)定位；作為JNK或HIF1α的錨定蛋白，調(diào)節(jié)其蛋白的穩(wěn)定性；和核糖體蛋白相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)蛋白的翻譯；結(jié)合并整合多種信號(hào)通路的蛋白分子，調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物的發(fā)育[2]。因而RACK1可調(diào)節(jié)體內(nèi)各種生物學(xué)過程，包括信號(hào)傳導(dǎo)、免疫應(yīng)答、細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和分化以及MAPK活化、血管生成、腫瘤生長(zhǎng)、神經(jīng)元反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、染色質(zhì)重塑和生物鐘的正常功能[3-6]。最近研究表明，RACK1在細(xì)胞周期進(jìn)程中起著重要調(diào)節(jié)作用，因而備受大家關(guān)注。酵母（S.pombe）遺傳學(xué)分析表明，RACK1/Cpc2調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程進(jìn)而調(diào)節(jié)減數(shù)分裂，RACK1/Cpc2負(fù)調(diào)控WEE1蛋白水平進(jìn)而正調(diào)控有絲分裂的進(jìn)程[7]。很多研究證實(shí)，腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程與RACK1在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平高低有著密切的聯(lián)系，例如RACK1可通過激活蛋白激酶C（PKC）進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[8]；相關(guān)研究已表明RACK1在乳腺癌、肺癌、宮頸癌、口腔鱗癌、腸癌等多種腫瘤組織中高表達(dá)，并跟腫瘤的分期和預(yù)后有著密切的相關(guān)性[9]。雖然RACK1的高表達(dá)已經(jīng)在其他多種癌組織中被證實(shí)，但RACK1在胃癌中的表達(dá)情況及其對(duì)預(yù)后的影響還不清楚。本研究旨在通過過表達(dá)RACK1蛋白后檢測(cè)蛋白激酶WEE1的表達(dá)情況，并采用免疫共沉淀和免疫熒光方法檢測(cè)RACK1與WEE1在胃癌細(xì)胞中的定位與相互作用，進(jìn)而分析RACK1與WEE1共同作用調(diào)控胃癌的發(fā)生發(fā)展，從而為RACK1作為胃癌臨床治療的靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器

胃癌細(xì)胞株HGC-27由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)李豐教授惠贈(zèng)。重組質(zhì)粒pcDNA3.1A-flag-rack1由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存。LipofectAMINE 2000（Invitrogen公司，美國(guó)），Protein A/G Plus beads（Santa Cruz公司，美國(guó)），RACK1抗體（BD公司，美國(guó)），WEE1抗體（Abcam公司，美國(guó)），F(xiàn)ITC和TRITC標(biāo)記的山羊抗鼠和山羊抗兔二抗（北京中杉金橋生物公司），HRP標(biāo)記的山羊抗鼠和山羊抗兔二抗，RIPA Buffer Western細(xì)胞裂解液、PMSF蛋白酶抑制劑及BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（北京碧云天生物公司）。BB16UV CO2培養(yǎng)箱（德國(guó)Heraeus），水浴式電轉(zhuǎn)印槽DYY-Ⅲ 40B型（北京六一儀器廠），凝膠自動(dòng)成像儀（UVP，美國(guó)），電泳儀及電泳槽（Bio-Rad公司，美國(guó)），激光共聚焦掃描顯微鏡（Leica公司，德國(guó)）。endprint

1.2 HGC27細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

HGC27細(xì)胞生長(zhǎng)于含有10%滅活胎牛血清的1640培養(yǎng)基中（含有100 U/mL青霉素和50 μg/mL鏈霉素），37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染按照Lipo 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行操作。實(shí)驗(yàn)分為未處理組、pcDNA3.1空載體轉(zhuǎn)染組、pcDNA3.1A-flag-RACK1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組三組。細(xì)胞培養(yǎng)48 h后收集，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 Western-blotting檢測(cè)HGC27細(xì)胞中WEE1蛋白表達(dá)

收集并提取各組細(xì)胞總蛋白，測(cè)蛋白濃度后煮沸，冷卻離心，10% SDS-PAGE電泳分離后，將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，3%BSA的TBS（pH7.4）封閉2 h，分別與anti-WEE1抗體（1∶500稀釋）和β-Actin（1∶1000稀釋）4℃過夜溫育。TTBS洗膜3次，HRP偶聯(lián)的山羊抗鼠IgG（1∶5000稀釋）室溫溫育2 h，洗膜3次，ECL發(fā)光法進(jìn)行顯色，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 免疫共沉淀驗(yàn)證在HGC27細(xì)胞內(nèi)RACK1和WEE1存在相互作用

收集培養(yǎng)48 h后HGC27細(xì)胞，加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液（含蛋白酶抑制劑）離心后，取上清進(jìn)行蛋白定量，取等量蛋白沉淀煮沸，-20℃保存。取適量預(yù)冷混懸的蛋白A/G瓊脂糖珠子，加入細(xì)胞上清液孵育后離心，取上清，一部分加入l μg RACK1抗體，另一部分加入1 μg IgG后，4℃孵育2 h后，加蛋白A/G瓊脂糖珠子繼續(xù)孵育過夜，離心棄上清，PBS清洗剩余的珠子后離心，重復(fù)5次，保留沉淀，煮沸，離心，取上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳和轉(zhuǎn)膜，以下方法同1.4，實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

1.5 細(xì)胞間接免疫熒光觀察HGC27細(xì)胞RACK1和WEE1共定位情況

接種適量HGC27細(xì)胞于6孔培養(yǎng)板中，內(nèi)放蓋玻片，培養(yǎng)48 h后，PBS清洗，4%多聚甲醛固定，PBS清洗3次，0.2%TritonX-100打孔，1%BSA室溫封閉l h，PBS清洗3次，RACK1和WEE1抗體4℃過夜，PBS洗滌清洗，F(xiàn)ITC和TRITC標(biāo)記的山羊抗鼠和山羊抗兔IgG（1∶100）37℃避光孵育45 min，PBS清洗后，加DAPI室溫復(fù)染細(xì)胞核10 min，甘油封片后，激光共聚焦顯微鏡下觀察、成像。本組實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用Graphpad prism 5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，WEE1蛋白表達(dá)量的變化情況以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)2～3次。

2 結(jié)果

2.1 過表達(dá)RACK1后WEE1在胃癌細(xì)胞HGC27中表達(dá)降低

轉(zhuǎn)染后提取蛋白進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)，與未轉(zhuǎn)染組（0.35±0.06）的蛋白表達(dá)量相比，pcDNA3.1空載轉(zhuǎn)染組WEE1的蛋白表達(dá)量（0.38±0.07）無明顯區(qū)別，pcDNA3.1-flag-Rack1轉(zhuǎn)染組WEE1蛋白表達(dá)量（0.14±0.02）明顯降低，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見封三圖6。

2.2 免疫共沉淀證實(shí)RACK1與WEE1在胃癌細(xì)胞HGC27內(nèi)存在相互作用

HGC27細(xì)胞裂解提取蛋白，加入beads與RACK1抗體共孵育后，洗脫beads結(jié)合的蛋白，再用WEE1抗體進(jìn)行免疫沉淀檢測(cè)，結(jié)果Input組與IP組在90 kDa附近檢測(cè)到條帶，IgG組沒有檢測(cè)到條帶，并且IP組Wee1蛋白的表達(dá)量明顯低于Input組。見封三圖7。

2.3 免疫熒光檢測(cè)RACK1與WEE1在胃癌細(xì)胞HGC27中共定位

細(xì)胞用相應(yīng)抗體標(biāo)記后，熒光顯微鏡觀察，RACKI與WEE1主要共定位于HGC27細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)。見封三圖8。

3 討論

支架蛋白R(shí)ACK1是因?yàn)榕c有活性的蛋白激酶C（PKC β Ⅱ）相互作用而得名，具有七個(gè)螺旋槳結(jié)構(gòu)的Trp-Asp（WD）重復(fù)序列，與G蛋白β亞單位具有同源性，又名GNB2L1[guanine nucleotide binding protein（G protein），beta polypeptide 2-like 1]，在真核生物間高度保守[10]。RACK1是細(xì)胞內(nèi)的穿梭蛋白，可位于胞漿、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞核內(nèi)。RACK1可通過與PKC結(jié)合調(diào)控核糖體翻譯，來促進(jìn)與侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)因子表達(dá)。實(shí)驗(yàn)室前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果已表明，RACK1在胃癌組織中的表達(dá)水平要明顯低于癌旁組織，且與胃癌分期緊密相關(guān)[11]，RACK1的mRNA及蛋白在胃癌細(xì)胞HGC27中的表達(dá)顯著低于正常胃黏膜細(xì)胞GESY，過表達(dá)RACK1可明顯抑制HGC27細(xì)胞生長(zhǎng)增殖。

為探討RACK1表達(dá)上調(diào)抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的可能機(jī)制，本研究首先通過Western bloting檢測(cè)在HGC27細(xì)胞中過表達(dá)RACK1后細(xì)胞周期蛋白WEE1的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組WEE1的表達(dá)水平明顯降低，顯著低于未轉(zhuǎn)染組和空載對(duì)照組。MPF是細(xì)胞周期中極其關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子。在細(xì)胞分裂間期，直到G2期結(jié)束時(shí)，WEE1蛋白激酶可通過磷酸化MPF的重要組分-Cdc2上的Thr14和Tyr15殘基使MPF處于失活狀態(tài)。WEE1是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與末端磷酸化，還可失活細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1（Cyclin dependent kinase 1，CDK1），從而導(dǎo)致DNA損傷應(yīng)答而阻滯G2期細(xì)胞周期，負(fù)性調(diào)控細(xì)胞有絲分裂的進(jìn)行[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，WEE1在惡性黑色素瘤、乳腺癌、骨肉瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤等一些腫瘤中高表達(dá)[13-16]，但在胃癌中如何表達(dá)還不清楚。

目前僅有Kim HY等[12]報(bào)道WEE1在胃癌組織中高表達(dá)且與伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的男性胃癌患者不良預(yù)后密切相關(guān)，同時(shí)檢測(cè)WEE1在12種胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)，7株高表達(dá)，5株表達(dá)很少或不表達(dá)，文中沒有檢測(cè)WEE1在HGC27細(xì)胞中的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)室前期的研究中已發(fā)現(xiàn)WEE1在HGC27細(xì)胞中的表達(dá)水平要明顯低于正常胃黏膜細(xì)胞GESY，本研究中過表達(dá)RACK1抑制WEE1蛋白的表達(dá)，具體的機(jī)制還不清楚。正常細(xì)胞修復(fù)損傷的DNA主要在G1期阻滯，然而癌細(xì)胞經(jīng)常在G1期阻滯有缺陷，很大程度上取決于G2期阻滯，因此，與正常細(xì)胞相比，癌細(xì)胞在G2期檢查點(diǎn)增加了DNA損傷的程度[12]，本研究中在HGC27細(xì)胞中過表達(dá)RACK1可能破壞了G2/M期檢查點(diǎn)的平衡，抑制了細(xì)胞增殖。既然RACK1的改變影響了WEE1蛋白的表達(dá)，兩者是如何相互作用的呢？我們又應(yīng)用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證在胃癌HGC27細(xì)胞中RACK1與WEE1存在相互作用。endprint

為了進(jìn)一步研究RACK1與WEE1在胃癌細(xì)胞中的關(guān)系，我們進(jìn)行了免疫熒光共定位觀察到了這兩個(gè)蛋白在胃癌的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的共定位情況，證實(shí)二者共定位于HGC27細(xì)胞胞質(zhì)中。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分說明RACK1與WEE1在胃癌細(xì)胞HGC27中能夠共定位，有著十分緊密的互作關(guān)系，對(duì)胃癌的發(fā)生發(fā)展有著一定的影響作用。由此可推測(cè)，RACK1與WEE1在細(xì)胞中的相互作用可能是調(diào)控胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的主要機(jī)制之一。但RACK1與WEE1是如何互作以及如何調(diào)控胃癌發(fā)生的具體機(jī)制還需進(jìn)一步的研究探討。

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（收稿日期：2017-05-06）endprint