梭羅草AFLP體系優(yōu)化及指紋圖譜構(gòu)建

王曉醒　李淑娟　謝永麗

摘要：利用梭羅草（Kengyilia thoroldiana）基因組DNA優(yōu)化并建立的梭羅草擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，簡(jiǎn)稱(chēng)AFLP）反應(yīng)體系。預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系25 μL：連接產(chǎn)物1 μL，10×PCR Buffer 25 μL，dNTP 0375 μL，Mg2+ 1 μL，Taq DNA聚合酶05 μL，EcoRⅠ預(yù)擴(kuò)引物1 μL，MseⅠ預(yù)擴(kuò)引物12 μL，ddH2O加至 25 μL；選擴(kuò)增反應(yīng)體系25 μL：預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物（稀釋20倍）20 μL，10×PCR Buffer 25 μL，dNTP 060 μL，Mg2+2 μL，TaqDNA聚合酶01 μL，EcoR Ⅰ選擴(kuò)引物15 μL，Mse I選擴(kuò)引物25 μL，ddH2O加至25 μL。利用優(yōu)化后的AFLP體系，從梭羅草、大穎草（K grandiglumis）、疏花以禮草（K laxiflora）共10份供試材料中篩選出216對(duì)選擇性擴(kuò)增引物，從中篩選出38對(duì)具有多態(tài)性的引物并從中選出6對(duì)條帶清晰、鑒別效率高的引物，其中E16C4、E4C10的擴(kuò)增條帶中均有梭羅草的特征條帶，為梭羅草的種質(zhì)鑒定及利用提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：梭羅草；指紋圖譜；AFLP體系；以禮草屬；預(yù)擴(kuò)增；選擴(kuò)增；引物；種質(zhì)鑒定

中圖分類(lèi)號(hào)： Q755文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號(hào)：1002-1302（2017）16-0037-05

收稿日期：2016-04-14

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31360578）。

作者簡(jiǎn)介：王曉醒（1991—），女，河北石家莊人，碩士研究生，研究方向?yàn)槟敛蒿暳祥_(kāi)發(fā)利用。E-mail：694840579@qqcom。

通信作者：李長(zhǎng)慧，博士，教授，研究方向?yàn)槟敛蒿暳祥_(kāi)發(fā)利用。E-mail：746886595@qqcom。

梭羅草（Kengyilia thoroldiana）屬禾本科（Poaceae）以禮草屬（Kengyilia），是亞洲中部高寒草原特有種，抗逆性強(qiáng)，具下伸或橫走根莖，固土能力強(qiáng)、抗旱、耐寒，返青早、分蘗能力強(qiáng)，適應(yīng)寒冷干旱的高寒草原和高寒荒漠生境，對(duì)三江源區(qū)的環(huán)境保護(hù)和小麥的品種改良有重要意義[1-4]。目前，對(duì)梭羅草的研究主要集中在生理生態(tài)及人工引種栽培方面[5-6]。

擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，簡(jiǎn)稱(chēng)AFLP）結(jié)合了限制性?xún)?nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，簡(jiǎn)稱(chēng)RFLP）和隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（random amplified polymorphic DNA，簡(jiǎn)稱(chēng)RAPD）技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，具有快速高效、穩(wěn)定可靠等優(yōu)勢(shì)[7-8]，被廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性分析、種質(zhì)鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建等研究[9-14]。焦湞等以3種禾本科作物為材料，建立并與優(yōu)化了針對(duì)于禾本科作物的AFLP體系[15]。劉歡等建立并優(yōu)化了燕麥的AFLP體系[16]。李娜對(duì)小麥的AFLP體系進(jìn)行優(yōu)化并證實(shí)該體系對(duì)近緣物種同樣適用[17]。AFLP過(guò)程比較復(fù)雜，針對(duì)不同物種有一定的特殊要求，因此AFLP體系優(yōu)化成為AFLP分子標(biāo)記研究的基礎(chǔ)工作。本研究以梭羅草為植物材料并以大穎草和疏花以禮草作為對(duì)比，探討AFLP分子標(biāo)記各步驟的影響因素，優(yōu)化對(duì)AFLP進(jìn)行的正交設(shè)計(jì)及單因素試驗(yàn)，建立穩(wěn)定的AFLP分析體系并進(jìn)一步構(gòu)建梭羅草的指紋圖譜，為梭羅草種質(zhì)鑒定、遺傳分化研究及種質(zhì)資源保護(hù)建立基礎(chǔ)。

1材料與方法

11植物材料

本研究包括3個(gè)植物材料，共計(jì)10個(gè)居群（表1），每個(gè)居群隨機(jī)抽取10個(gè)單株提取基因組DNA樣本，稀釋至 50 ng/μL。并分別混合成10個(gè)基因池，作為AFLP分析的DNA模板。

12試劑、接頭與引物

限制性核酸內(nèi)切酶Mse Ⅰ、EcoR Ⅰ、T4連接酶、Taq DNA聚合酶、dNTP、Mg2+、DNA ladder，購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；引物及接頭，均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

13主要儀器

凝膠電泳使用北京六一生物科技有限公司生產(chǎn)的 DYY-12型電泳儀、JY-CX2A型槽電泳，2 000 V、100 mA、80 W。[JP]

14基因組DNA的酶切與連接

本研究基于已有的文獻(xiàn)資料[18]，采用十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethyl ammonium bromide，簡(jiǎn)稱(chēng)CTAB）法提取供試材料基因組DNA并用核酸測(cè)定儀測(cè)定DNA的純度和濃度，每個(gè)居群提取10個(gè)單株的DNA，稀釋至50 ng/μL，于08%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)并將各居群的10份DNA等量混合成基因池。

采用限制性核酸內(nèi)切酶EcoR Ⅰ和MseⅠ對(duì)供試材料的基因池進(jìn)行雙酶切，反應(yīng)體系和條件參照劉歡等在燕麥研究中的方法[16]并略加改進(jìn)，酶切后與EcoRⅠ和MseⅠ的特定接頭連接（表2）。

15預(yù)擴(kuò)和選擴(kuò)反應(yīng)的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化

預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)以連接產(chǎn)物為模板DNA，采用25 μL體系，運(yùn)用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)體系中的模板DNA、dNTP、Mg2+、Taq DNA聚合酶、Mse Ⅰ和EcoR Ⅰ對(duì)應(yīng)預(yù)擴(kuò)增引物（E+A、M+C）的用量進(jìn)行優(yōu)化，采用6因素5水平設(shè)計(jì)試驗(yàn)（表3）。預(yù)擴(kuò)增PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 80 s，20個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸1 min，4 ℃保存。加上樣緩沖液混合后，在6%變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳檢測(cè)預(yù)擴(kuò)增引物的效果。

選擴(kuò)增反應(yīng)以預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物（稀釋20倍）為模板DNA，采用25 μL體系，運(yùn)用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)體系中的模板DNA、dNTP、Mg2+、Taq DNA聚合酶、EcoR Ⅰ和Mse Ⅰ對(duì)應(yīng)選擴(kuò)增引物（E+ANN、M+CNN）的用量進(jìn)行優(yōu)化，采用6因素5水平設(shè)計(jì)試驗(yàn)（表3）。選擴(kuò)增PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s（每循環(huán)降低07 ℃），72 ℃ 80 s，14個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，23個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。加上樣緩沖液混合后，在6%變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳檢測(cè)選擴(kuò)增引物的效果。endprint

16選擴(kuò)增引物反應(yīng)體系的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化的選擴(kuò)增引物反應(yīng)體系設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)（表4）。對(duì)某一因素進(jìn)行單因素設(shè)計(jì)時(shí)，其他因素采用正交試驗(yàn)篩選出的水平。經(jīng)PCR擴(kuò)增后，在6%變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳檢測(cè)選擴(kuò)增引物反應(yīng)效果。

17引物篩選與指紋圖譜構(gòu)建

利用10份植物材料對(duì)216對(duì)AFLP選擴(kuò)增引物組合進(jìn)行初步篩選，獲得具有多態(tài)性的引物對(duì)，進(jìn)一步篩選出引物擴(kuò)增帶型清晰、對(duì)供試材料區(qū)鑒別率高的核心引物。指紋圖譜構(gòu)建參照Pan的研究方法[19]，有AFLP片段的記為“A”，無(wú)AFLP片段的記為“C”。

[BT1#][STHZ]2結(jié)果與分析

21植物基因組DNA提取與檢測(cè)結(jié)果

18～20，08%瓊脂糖電泳條帶整齊一致，表明雜質(zhì)去除較干凈，純度較高，可用于AFLP分析（圖1）。

22正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化

預(yù)擴(kuò)增采用EA和MC引物對(duì)酶切片段進(jìn)行擴(kuò)增，體系中各因素用量均影響最終結(jié)果。正交試驗(yàn)處理的試驗(yàn)產(chǎn)物在6%變性聚丙烯酰胺凝膠上檢測(cè)（圖2）發(fā)現(xiàn)，預(yù)擴(kuò)增片段在100～500 bp擴(kuò)增信號(hào)較強(qiáng)，各樣品間相對(duì)一致，說(shuō)明基因組DNA的提取和酶切連接體系比較合適；6個(gè)因素僅取值在兩端的水平組合選擇性片段擴(kuò)增量較少（泳道1、10、18、22）或背景太深（泳道11、16、21），其他組合帶型較好。試驗(yàn)結(jié)果表明，梭羅草AFLP預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系各因素水平范圍寬泛，根據(jù)經(jīng)濟(jì)適用原則確定預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系：連接產(chǎn)物1 μL，10×PCR Buffer 25 μL，dNTP 0375 μL，Mg2+1 μL，TaqDNA聚合酶05 μL，EcoR I預(yù)擴(kuò)增引物1 μL，Mse I預(yù)擴(kuò)引物12 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。

選擴(kuò)增反應(yīng)采用EA+GA和MC+CA對(duì)預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行再次擴(kuò)增。對(duì)上述優(yōu)化過(guò)的預(yù)擴(kuò)體系產(chǎn)生的預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物進(jìn)行選擇性擴(kuò)增體系優(yōu)化，正交試驗(yàn)處理的產(chǎn)物在6%變性聚丙烯酰胺凝膠上檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)增片段在100～500 bp擴(kuò)增信號(hào)較強(qiáng)，不同處理對(duì)選擴(kuò)反應(yīng)影響較大，僅試驗(yàn)組合4、13、15、19、24、25相對(duì)帶型較好（圖3）。試驗(yàn)結(jié)果表明，選擴(kuò)體系設(shè)置的6因素中對(duì)結(jié)果影響較大的為dNTP和Mg2+（dNTPs濃度過(guò)低時(shí)，造成非特異性擴(kuò)增增加，反之，則擴(kuò)增產(chǎn)物會(huì)逐漸減少，Mg2+的影響效應(yīng)與此相反），其次是引物、預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物、Taq DNA 聚合酶；初步確定最佳選擴(kuò)反應(yīng)體系：預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物（稀釋[CM（25]20倍）20μL，10×PCRBuffer25μL，dNTP075μL，

Mg2+ 2 μL，TaqDNA聚合酶01 μL，EcoRⅠ選擴(kuò)引物15 μL，MseⅠ選擴(kuò)引物25 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。

23單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化

由正交試驗(yàn)結(jié)果可知，dNTP、Mg2+、引物、預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物、Taq DNA 聚合酶對(duì)選擴(kuò)體系影響較大，采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)一步研究，dNTP用量調(diào)整為060、065、070、075、080 μL。選擴(kuò)增引物反應(yīng)體系中單因素不同水平試驗(yàn)電泳圖譜（圖4）結(jié)果表明，各因素水平控制良好，較好帶型均出現(xiàn)在各因素中值附近；進(jìn)一步優(yōu)化的選擴(kuò)增反應(yīng)體系（25 μL）：預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物（稀釋20倍）20 μL，10×PCR Buffer 25 μL，dNTP 06 μL，[JP2]Mg2+2 μL， TaqDNA聚合酶01 μL， EcoR Ⅰ選擴(kuò)引物 15 μL，[JP]Mse Ⅰ選擴(kuò)引物25 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。

24引物篩選和指紋圖譜構(gòu)建

對(duì)10份供試材料篩選216對(duì)選擇性擴(kuò)增引物（圖5），從

中篩選出38對(duì)具有多態(tài)性的引物并從中選出6對(duì)條帶清晰，鑒別效率高的引物（表5），其中E16C4、E4C10（圖6）的擴(kuò)增條帶中均有梭羅草的特征條帶。這6對(duì)AFLP引物組合的擴(kuò)增產(chǎn)物共統(tǒng)計(jì)出28個(gè)AFLP多態(tài)性片段，因此這28個(gè)AFLP標(biāo)記的有無(wú)，即為供試植物材料的指紋。由于任何單一引物對(duì)都不能獨(dú)自鑒定10份植物材料，所以本研究對(duì)10份植物材料構(gòu)建E16C4、E3C16引物對(duì)的指紋圖譜（表6），以鑒別10份植物材料。

3結(jié)論與討論

本研究采用正交結(jié)合單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，兼顧各因素間的交互作用。試驗(yàn)結(jié)果表明，梭羅草的AFLP分析對(duì)2種引物的用量需求并不相同，MseⅠ的預(yù)擴(kuò)增引物和選擴(kuò)增引物均略高于EcoRⅠ的預(yù)擴(kuò)增和選擴(kuò)增引物，這一點(diǎn)在之前的禾本科作物AFLP體系優(yōu)化的國(guó)內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)中并未提及。分析原因可[CM（25]能為AFLP擴(kuò)增片段同時(shí)具有4個(gè)堿基的 MseⅠ和6個(gè)堿

注：A表示有AFLP標(biāo)記片段；C表示無(wú)AFLP標(biāo)記片段。[HT][FK）]

基的EcoRⅠ黏性末端，依據(jù)4種堿基隨機(jī)排列組合，MseⅠ的位點(diǎn)多于EcoRⅠ，則用量相對(duì)較少理論上是可行的。同樣，MseⅠ的預(yù)擴(kuò)增引物和選擴(kuò)增引物應(yīng)略高于EcoRⅠ的引物。

DNA指紋圖譜構(gòu)建是種質(zhì)資源分子鑒定的基礎(chǔ)，常用的分子生物學(xué)方法很多。SSR和AFLP是構(gòu)建DNA指紋圖譜的首選技術(shù)。本研究選取譜帶穩(wěn)定性較好、鑒定效率較高的6對(duì)AFLP引物構(gòu)建10份植物材料的DNA指紋圖譜，6對(duì)引物擴(kuò)增結(jié)果不一致，表明此方法可以構(gòu)建梭羅草的指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)。顯影結(jié)果中觀察到梭羅草的特征條帶（圖6），能直接將梭羅草與大穎草和疏花以禮草區(qū)別出來(lái)，可以用來(lái)鑒定梭羅草種質(zhì)資源。

梭羅草是青藏高原高寒荒漠草原的優(yōu)勢(shì)鄉(xiāng)土草種，對(duì)生態(tài)恢復(fù)和拓寬小麥育種的遺傳基礎(chǔ)具有重要意義。目前，針對(duì)于梭羅草的研究主要集中于宏觀方面，分子水平上的研究有待進(jìn)一步發(fā)展。AFLP分子標(biāo)記的引物在物種之間具有通用性，無(wú)須事前了解基因組的序列信息，是以分子水平研究梭羅草的良好接入點(diǎn)。為進(jìn)一步利用AFLP分子標(biāo)記研究梭羅草的遺傳多樣性、遺傳分化等建立了基礎(chǔ)。endprint

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