不同濃度過氧化氫對(duì)Peroxiredoxin II與血紅蛋白結(jié)合的影響

于佳斌，韓英浩，金美華

不同濃度過氧化氫對(duì)Peroxiredoxin II與血紅蛋白結(jié)合的影響

于佳斌，韓英浩，金美華

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319）

為探究不同濃度的過氧化氫對(duì)抗氧化蛋白（Peroxiredoxin II）與血紅蛋白結(jié)合的影響，利用蛋白質(zhì)體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)，將帶有GST標(biāo)簽的鼠重組Prx II蛋白和鼠血紅蛋白進(jìn)行結(jié)合，以及利用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測目的蛋白，檢驗(yàn)在不同濃度的過氧化氫存在時(shí)，Peroxiredoxin II（Prx II）與血紅蛋白的結(jié)合情況。結(jié)果表明，隨著過氧化氫濃度的增加，Prx II與血紅蛋白的結(jié)合程度受到抑制，同時(shí)發(fā)現(xiàn)血紅蛋白只與Prx II的二聚體形式結(jié)合。為過氧化氫存在時(shí)Prx II保護(hù)血紅蛋白提供了基礎(chǔ)理論。

蛋白質(zhì)體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)；蛋白質(zhì)免疫印跡；Peroxiredoxin II；血紅蛋白；二聚體

蛋白質(zhì)是構(gòu)成生命活動(dòng)的基本單元，主要由碳，氫，氧等元素組成[1-2]，它調(diào)節(jié)著生物體內(nèi)諸多的生理活動(dòng)過程[3]。隨著科學(xué)研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)許多蛋白質(zhì)并不是獨(dú)立完成物質(zhì)運(yùn)輸，信息傳遞等生理過程的，而是通過蛋白質(zhì)之間的相互作用完成[3]。其相互作用通常分為兩種，一種是物理相互作用，一種是遺傳相互作用，物理相互作用指由于結(jié)構(gòu)上互補(bǔ)或存在相互吸引的作用力，兩個(gè)蛋白質(zhì)相互結(jié)合在一起，或多個(gè)蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)復(fù)合體，蛋白質(zhì)分子通過與其他蛋白質(zhì)相互結(jié)合來參與細(xì)胞中的各種生理過程，從而行使相應(yīng)的功能[4]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，許多疾病也是由于蛋白質(zhì)分子結(jié)合異常引起的[5]，對(duì)蛋白質(zhì)之間結(jié)合情況的研究，不僅可以了解蛋白質(zhì)的功能，也可以對(duì)研究許多疾病的機(jī)理，以及疾病的預(yù)防、治療、新藥開發(fā)提供理論基礎(chǔ)[6-8]。

研究蛋白質(zhì)之間相互結(jié)合有多種不同的方法，其中蛋白質(zhì)體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)（Pull down assay）是一個(gè)行之有效的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，它可以驗(yàn)證兩個(gè)或兩個(gè)以上的蛋白質(zhì)之間的相互結(jié)合情況[9-10]。蛋白質(zhì)體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)有兩種常見的方法。實(shí)驗(yàn)采用帶有GST標(biāo)簽的鼠重組Prx II蛋白質(zhì)和純化的鼠血紅蛋白在試管中進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，利用GST標(biāo)簽?zāi)芴禺愋缘呐c谷胱甘肽結(jié)合的特性[11-12]，將含有目的蛋白的溶液過柱，可從中捕獲與之相互作用的“捕獲蛋白”（目的蛋白），洗脫結(jié)合物后，通過SDS-PAGE分析，從而證實(shí)兩種蛋白間的相互作用[13-15]。

Peroxiredoxins（Prxs）是一類過氧化物還原酶，它可以通過控制細(xì)胞的氧化水平調(diào)節(jié)機(jī)體平衡，保護(hù)細(xì)胞免受損傷[16-17]。Prxs家族分為六個(gè)成員，分別是Prx I-Prx VI，它們廣泛存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)[18-19]，其中Prx II在細(xì)胞膜上大量表達(dá)。研究顯示Prx II在紅細(xì)胞膜上的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于同家族的其他過氧化物還原酶，并且，血紅蛋白與其的聯(lián)系非常密切[20-21]。實(shí)驗(yàn)利用蛋白質(zhì)體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)以及蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測不同濃度過氧化氫對(duì)Prx II與血紅蛋白結(jié)合的影響，探究過氧化氫對(duì)兩者相互結(jié)合的影響作用，為過氧化氫存在時(shí)Prx II保護(hù)血紅蛋白提供基礎(chǔ)理論。

1 材料與方法

1.1 試劑

TEMED，生物工程（上海）有限公司；Tris、考馬斯亮藍(lán)R-250、過硫酸銨、甲叉雙丙烯酰胺均為Sigma公司；GST agarose沉降蛋白、Prx II一抗、血紅蛋白一抗、鼠源二抗均為Santa公司，Prx II重組蛋白，武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司。

1.2 材料儀器

紫外可見分光光度計(jì)，T6，北京普析通用儀器有限公司；垂直板電泳槽，SE260-10A-75，通用電氣醫(yī)療系統(tǒng)貿(mào)易發(fā)展（上海）有限公司；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，18113001 EPS 301，上海天能儀器廠；小型臺(tái)式冷凍離心，1-15K，Sigma公司；化學(xué)免疫熒光成像系統(tǒng)，AI600，GE 公司；冷凍真空干燥機(jī)，F(xiàn)0-1B-55，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司?？鼓埽珽DTA-K2，三力有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

129/SvJ野生型小鼠，129/SvJ Prx II基因敲除型小鼠，由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，疾病模式動(dòng)物研究中心提供。

1.4 細(xì)胞

129/SvJ野生型小鼠紅細(xì)胞，129/SvJ Prx II基因敲除型小鼠紅細(xì)胞。

1.5 方法

1.5.1 小鼠眼眶取血

取周齡為6周的野生型及Prx II基因敲除型129/SvJ小鼠各3只進(jìn)行眼眶靜脈叢取血。采血者的左手拇指和食指從小鼠背部握住小鼠的頸部，使其頭部固定，拇指和食指壓迫小鼠頸部兩側(cè)，使右側(cè)眼球突出，眼眶后側(cè)靜脈叢充血，此時(shí)將毛細(xì)管以45度夾角旋轉(zhuǎn)刺入小鼠眼眶后側(cè)，插入深度2～3 mm，取血同時(shí)放松手指，使血液順利流到抗凝管，取血300 μL[22-23]。

1.5.2 血紅蛋白的提取與分離

取小鼠血液300 μL加入1.5 mL離心管中，離心，5 867×g，5 min，上層為透明的淡黃色血漿，下層為紅色的紅細(xì)胞，將上層血吸出棄去，在此離心管中加入 1 mL 磷酸鹽緩沖液，混勻，離心，5 867×g，5 min，洗滌紅細(xì)胞3～4次，直至上清液不再渾濁。洗滌后加入1 mL無菌去離子水，充分吹打，混勻，使紅細(xì)胞破裂，離心，5 867×g，10 min，收集上清液，用 0.22 μm細(xì)胞篩過濾，得到血紅蛋白溶液，加入飽和（NH4）2SO4溶液，并攪拌，直至溶液變渾濁，離心，5 867×g，15 min，去上清，得到血紅蛋白，干燥備用[24]。

1.5.3 蛋白質(zhì)體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)分為GST-Prx II組，Prx II基因敲除小鼠的血紅蛋白與GST-Prx II混合組，Prx II基因敲除小鼠的血紅蛋白組，以及分別以0.2，0.5，1.0 μM濃度的過氧化氫處理Prx II基因敲除小鼠的血紅蛋白與GST-Prx II的混合蛋白，過氧化氫溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。將1 μM重組Prx II蛋白和7 μM血紅蛋白在5 mM磷酸緩沖液（pH 8.0）中進(jìn)行混合，37℃孵育10 min后加入GST agarose沉降蛋白，得到GST-Prx II，將Prx II基因敲除小鼠的血紅蛋白與GST-Prx II混合組溶液注入含有谷胱甘肽瓊脂糖的柱子內(nèi)，再用洗脫液將柱子內(nèi)結(jié)合的蛋白洗出[25]，2 292×g，離心 5 min，用磷酸緩沖液清洗3遍，沉淀混合物后加入樣品緩沖液并定容至20 μL，95℃變性處理后進(jìn)行Western blot檢測[11-13]。

1.5.4 蛋白質(zhì)免疫印跡

實(shí)驗(yàn)分為β-ME處理組，與過氧化氫處理組，以2%，4%，6%濃度的 β-ME 和 0.2，0.5，1.0 μM 濃度的過氧化氫處理重組Prx II蛋白，β-ME及過氧化氫均現(xiàn)用現(xiàn)配。準(zhǔn)備相應(yīng)1.5 mL離心管，加入800 μL無菌去離子水，200 μL考馬斯亮藍(lán)，1 βM重組Prx II樣品，混勻，A595測定光度值，確定樣品蛋白質(zhì)含量，進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳檢測，溴酚藍(lán)前沿跑至底部約1 cm時(shí)，關(guān)閉電源，停止電泳。轉(zhuǎn)膜后剪下Prx II蛋白相對(duì)應(yīng)的條帶，孵育Prx II一抗與鼠源二抗，ECL顯色照相，確定Prx II結(jié)構(gòu)，分析結(jié)果[20-21]。

2 結(jié)果

2.1 重組Prx II蛋白與血紅蛋白相互結(jié)合的鑒定

蛋白質(zhì)體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在GST agarose沉淀的混合物中，均可檢出Prx II和血紅蛋白，表明Prx II與血紅蛋白具有相互結(jié)合的特性。由于血紅蛋白提取分離于Prx II基因敲除小鼠的紅細(xì)胞中，因此在血紅蛋白樣品中并無Prx II蛋白的檢出（圖1）。此結(jié)果證明正常小鼠的血紅蛋白可以與Prx II相互結(jié)合。

2.2 不同濃度過氧化氫對(duì)Prx II與血紅蛋白結(jié)合程度的影響

蛋白質(zhì)體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)以及蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果顯示，血紅蛋白的含量相同時(shí)，隨著過氧化氫濃度的升高，Prx II與血紅蛋白的結(jié)合程度隨之降低（圖2）。結(jié)果證明過氧化氫的濃度可以影響Prx II與血紅蛋白之間的結(jié)合，過氧化氫濃度越高，與血紅蛋白結(jié)合的Prx II量越少。

圖1 蛋白質(zhì)體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)檢測Prx II與血紅蛋白結(jié)合情況Fig.1 Binding of Prx II with Hb examined by in vitro binding assay of protein

圖2 蛋白質(zhì)體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)檢測不同濃度過氧化氫處理后Prx II與血紅蛋白的結(jié)合程度Fig.2 Binding extent of Prx II with Hb after hydrogen peroxide treatment of different concentration by in vitro binding assay of protein

2.3 β-ME和過氧化氫對(duì)Prx II單體和二聚體構(gòu)型的影響

經(jīng)蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果分析顯示，β-ME處理組的重組Prx II全部處于單體形式，過氧化氫處理組的重組Prx II蛋白全部處于二聚體形式（圖3）。結(jié)果表明，Prx II單體和二聚體結(jié)構(gòu)的形成受到過氧化氫和還原條件的影響。

2.4 Prx II的單體和二聚體結(jié)構(gòu)與血紅蛋白結(jié)合的程度

實(shí)驗(yàn)分為GST-Prx II組，未經(jīng)β-ME處理的Prx II基因敲除小鼠的血紅蛋白與GST-Prx II混合組，β-ME處理的Prx II基因敲除小鼠的血紅蛋白與GST-Prx II混合組，蛋白質(zhì)體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，未經(jīng)β-ME處理的Prx II可以與血紅蛋白結(jié)合，而處理β-ME的Prx II不可以與血紅蛋白結(jié)合（圖4）。蛋白質(zhì)體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Prx II二聚體形式才能與血紅蛋白結(jié)合。

圖3 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測β-ME和過氧化氫處理后Prx II的構(gòu)型轉(zhuǎn)換Fig.3 Configuration transition of Prx II after β-ME and hydrogen peroxide treatment by Western blotting

圖4 蛋白質(zhì)體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)檢測二種構(gòu)型的Prx II與血紅蛋白的結(jié)合程度Fig.4 Binding extent of two forms of Prx II with Hb by in vitro bindingassay of protein

3 討論

蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互結(jié)合是實(shí)現(xiàn)細(xì)胞生物功能的基礎(chǔ)，在生物的發(fā)育過程中起著重要的作用，幾乎在所有細(xì)胞活動(dòng)中蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互結(jié)合都有著關(guān)鍵性的作用，深入研究其機(jī)理對(duì)疾病的診斷和治療有著重大的意義，如果能掌握蛋白質(zhì)之間相互結(jié)合產(chǎn)生的現(xiàn)象及機(jī)理，就可以更透徹的了解蛋白質(zhì)的功能，進(jìn)而了解生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，這更有利于對(duì)許多疾病的診斷，研究與治療。對(duì)藥物的篩選也有重要的意義[6-8]。

Prxs是研究非常廣泛的抗氧化蛋白家族，其中Prx II在紅細(xì)胞中被檢測出大量表達(dá)，在前期研究中發(fā)現(xiàn)Prx II與血紅蛋白的結(jié)合對(duì)溶血性貧血的發(fā)生有著重要的影響，Prx II基因敲除小鼠紅細(xì)胞中血紅蛋白易變性，進(jìn)而形成海因茨小體，導(dǎo)致溶血性貧血的發(fā)生。地中海貧血病人的紅細(xì)胞中Prx II與血紅蛋白結(jié)合明顯減少，使其更易受到活性氧的攻擊，導(dǎo)致氧化損傷的積累。種種現(xiàn)象表明，Prx II對(duì)血紅蛋白的保護(hù)有重要意義。同時(shí)在前期研究中發(fā)現(xiàn)，Prx II與血紅蛋白的結(jié)合可以維持血紅蛋白的穩(wěn)定，保護(hù)血紅蛋白免受活性氧的攻擊[20]，但Prx II如何維持血紅蛋白的穩(wěn)定，其中的機(jī)制尚未明確，實(shí)驗(yàn)利用蛋白質(zhì)體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)以及蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測不同濃度過氧化氫對(duì)Prx II與血紅蛋白結(jié)合的影響，探究過氧化氫對(duì)兩者相互結(jié)合的影響作用，為過氧化氫存在時(shí)Prx II保護(hù)血紅蛋白提供基礎(chǔ)理論。

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)是影響蛋白質(zhì)行使功能的重要因素，Prx II存在著兩種不同的結(jié)構(gòu)，一種是單體形式，另一種是二聚體形式，不同的結(jié)構(gòu)導(dǎo)致Prx II行使不同的生理功能，對(duì)生物體產(chǎn)生不同的影響，其中影響PrxII結(jié)構(gòu)最主要的因素是氧化劑和還原劑，實(shí)驗(yàn)表明，加入還原劑后，使Prx II維持在單體形式，不能與血紅蛋白結(jié)合，加入氧化劑后，使Prx II維持在二聚體形式，可以與血紅蛋白結(jié)合。

蛋白質(zhì)體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)可以有效，準(zhǔn)確的在體外檢測出蛋白質(zhì)之間的相互作用，Prx II以二聚體的形式和血紅蛋白的結(jié)合受到過氧化氫濃度的影響，過氧化氫濃度越高，Prx II與血紅蛋白的結(jié)合程度越低，而沒有過氧化氫的情況下Prx II與血紅蛋白也是不結(jié)合的，說明Prx II與血紅蛋白的結(jié)合受到過氧化氫濃度的調(diào)控。這種調(diào)控是根據(jù)Prx II的結(jié)構(gòu)來決定的。這一研究為維護(hù)血紅蛋白提供了基礎(chǔ)思路。

［1］ Bultinck J， Lievens S，Tavernier J， et al.Protein-protein interactions：network analysis and applications in drug discovery［J］.Curr Pharm Des.，2009，18（30）：4619-4629.

［2］ Casado-Vela，co-Zorrilla.Screening of protein-protein and protein-DNA interactions using microarrays：applications in biomedicine［J］.Adv Protein Chem Struct Biol.， 2014，95：231-281.

［3］ 李文釗.蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)的分子動(dòng)力學(xué)模擬［D］.長春：吉林大學(xué)，2013.

［4］ 倪青山.蛋白質(zhì)相互作用與功能預(yù)測方法研究［D］.北京:國防科學(xué)技術(shù)大學(xué)，2009.

［5］ 沈瑤瑤，嚴(yán)慶豐.蛋白質(zhì)相互作用研究進(jìn)展［J］.生命科學(xué)， 2013（3）：269-274.

［6］ 王明強(qiáng)，武金霞，張玉紅，等.蛋白質(zhì)相互作用實(shí)驗(yàn)技術(shù)的最新進(jìn)展［J］.遺傳， 2013（11）：1274-1282.

［7］ Hu Z.Analysis strategy of protein-protein interaction networks［J］.Mol Biol.， 2013， 939：141.

［8］ De Las Rivas J， Fontanillo C.Protein-protein interaction networks：unraveling the wiring of molecular machines within the cell［J］.Brief Funct Genomics，2012，11（6）：489-496.

［9］ Suzuki H.In vitro pull-down assay without expression constructs［J］.Biotechniques，2004，37（6）：918-920.

［10］ Einarson M B，Pugacheva E N， OrlinickJ R.Identification of Protein-Protein Interactions with Glutathione-STransferase （GST）Fusion Proteins ［J］.CSH Protoc.，2007，11：117-126.

［11］ Smith D B， Johnson K S.Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase［J］ Gene，1988，67（1）：31-40.

［12］ 柴政斌，張更林，韓金祥.GST-pulldown技術(shù)在蛋白質(zhì)相互作用中的應(yīng)用［J］.中國生物制品學(xué)雜志，2004（10）:1354-1358.

［13］ 溫麗娟，王桂華，侯喜林，等.共表達(dá)ETEC K99、K88菌毛蛋白重組干酪乳桿菌的構(gòu)建［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，23（3）:34-39.

［14］ Choi S.Probing protein complexes inside living cells using a silicon nanowire-based pull-down assay ［J］ .Nanoscale，2016， 22（8）：11380-11384.

［15］ Tanemura Y.Easy and rapid binding assay for functional analysis of disulfide-containing peptides by a pull-down method using a puromycin-linker and a cell-free translation system［J］ .Biology，2015（1）：161-172.

［16］ Sambrook J， RussellD W.Detection of Protein-Protein Interactions Using the GST Fusion Protein Pulldown Technique［J］ .CSH Protoc.， 2006（1）：275-276.

［17］ Kang SW.Mammalian peroxiredoxin isoforms can reduce hydrogen peroxide generated in response to growth factors and tumor necrosis factor-alpha［J］.Biol Chem.， 1998，273（11）：6297-302.

［18］ Kang SW.2-Cys peroxiredoxin function in intracellular signal transduction：therapeutic implications［J］.Trends Mol Med.，2005， 11（12）：571-578.

［19］ Rinalducci S.Oxidative stress-dependent oligomeric status of erythrocyte peroxiredoxin II（Prx II） during storage under standard blood banking conditions.［J］.Biochimie，2011，93（5）：845-853.

［20］ Wood Z A.Structure，mechanism and regulation of peroxiredoxins［J］.Trends Biochem Sci.，2003，28（1）：32-40.

［21］ 李田田，王士霞，畢瑩，等.BVDV P7蛋白的原核表達(dá)及其生物信息學(xué)分析［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，28（6）:69-73.

［22］ Han YH.Peroxiredoxin II is essential for preventing hemolytic anemia from oxidative stress through maintaining hemoglobin stability［J］.Biochem Biophys Res Commun，2012， 426（3）：427-432.

［23］ Johnson R M.Hemoglobin autoxidation and regulation of endogenous H2O2levels in erythrocytes［J］.Free Radic Biol Med.，2005， 39（11）：1407-1417.

［24］ 車兆義，鄒悅，宋清斌.大鼠實(shí)驗(yàn)中幾種常用的采血方法探討［J］.局解手術(shù)學(xué)雜志，2008（2）：84-85.

［25］ 邢文，何尚斌.幾種哺乳動(dòng)物眼眶后靜脈叢取血法［J］.生理科學(xué)進(jìn)展，1958（4）：441-443.

［26］ 唐曉明.血紅蛋白的提取和分離實(shí)驗(yàn)改進(jìn)的研究［J］.生物學(xué)通報(bào)， 2015（1）：53-54+63.

［27］ 柴政斌.利用GST-pull down方法篩查PAD4相互作用蛋白的初步研究.［D］.濟(jì)南：濟(jì)南大學(xué)，2014.

Effect of Hydrogen Peroxide of Different Concentration on the binding of Peroxiredoxin II with Hemoglobin

Yu Jiabin，Han Yinghao，Jin Meihua
（College of Life Science and Technology， Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing 163319）

In vitro binding assay of protein was used to explore the effect of hydrogen peroxide of different concentration on the binding of Peroxiredoxin II （Prx II） with hemoglobin.The GST label mouse’s recombinant Prx II protein was combined with rat hemoglobin，Western blotting was used to detect the interest protein，the binding of Prx II with hemoglobin was tested by hydrogen peroxide of different concentration.The results showed that the binding of Prx II and Hb was inhibited with the concentration of hydrogen peroxide increasing，and Hb only bound with the dimer of the Prx II.It provided the fundamental theory for Prx II protecting hemoglobin in the presence of hydrogen peroxide.

in vitro binding assay of protein;Western blotting;Peroxiredoxin II;hemoglobin;dimer

R285

A

1002-2090（2017）05-0049-05

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.05.013

2016-10-25

黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)?？蒲袉?dòng)計(jì)劃項(xiàng)目（XYB2013-17）。

作者介紹：于佳斌（1993-），女，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院2013級(jí)生物科學(xué)專業(yè)本科生。

金美華，女，講師，E-mail：meihuajin@byau.edu.cn。