李小靜 李志鋒 李顯平 劉保國 劉志軍

056002河北邯鄲，河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科

丹參酮ⅡA體外促進黑素瘤A375細胞自噬及信號通路的實驗研究

李小靜 李志鋒 李顯平 劉保國 劉志軍

056002河北邯鄲，河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科

目的探討丹參酮ⅡA體外對黑素瘤細胞A375細胞自噬的影響及其信號通路研究。方法0.5、1、2、4 mg/L丹參酮ⅡA作用黑素瘤A375細胞24、48、72 h后，噻唑藍（MTT）比色法檢測A375細胞的增殖活性。1、2、4 mg/L丹參酮ⅡA作用黑素瘤A375細胞48 h，采用流式細胞儀檢測細胞自噬小體的數(shù)量，Western印跡檢測自噬相關(guān)蛋白Beclin?1和微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）?Ⅱ蛋白及磷酸肌醇3激酶（PI3K）、蛋白激酶B（Akt）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、p70S6激酶1（p70S6K1）蛋白的表達水平。結(jié)果MTT分析顯示，0.5、1、2和4 mg/L丹參酮ⅡA分別作用黑素瘤A375細胞24、48、72 h，均能抑制A375細胞的增殖能力，且抑制作用呈劑量和時間依賴性（F=2 564.12、1 235.25，均P＜0.05）。流式細胞儀顯示，1、2和4 mg/L丹參酮ⅡA作用A375細胞48 h后，細胞內(nèi)自噬小體比例分別為6.91%±0.35%、13.11%±0.73%、25.51%±0.83%，均明顯高于對照組（0.41%±0.02%），各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。Western印跡顯示，1、2和4 mg/L丹參酮ⅡA作用A375細胞48 h后，細胞自噬相關(guān)蛋白Beclin?1和LC3?Ⅱ表達水平隨丹參酮ⅡA濃度增加而升高，各丹參酮ⅡA組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且高于對照組（均P＜ 0.05）。而PI3K?Akt?mTOR?p70S6K1信號通路中PI3K、p?Akt、p?mTOR和p?p70S6K1蛋白表達隨丹參酮ⅡA濃度增加而下降，各丹參酮ⅡA組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且低于對照組（均P＜0.05）。結(jié)論丹參酮ⅡA可通過抑制P13K?Akt?mTOR?p70S6K1信號通路，促進黑素瘤細胞發(fā)生自噬。

黑色素瘤；丹參酮；自噬；A375細胞

自噬又稱Ⅱ型程序性細胞死亡，是真核細胞應(yīng)對持續(xù)性內(nèi)外刺激而產(chǎn)生的一種非損傷性應(yīng)答反應(yīng)。機體通過上調(diào)自噬，增強細胞自我清除受損蛋白和細胞器，降解毒性物質(zhì)，并為細胞生存提供能量［1］。研究顯示［2］，在皮膚黑素瘤中，自噬相關(guān)基因表達下降。丹參酮ⅡA是中藥丹參中提取的一種脂溶性成分，可抑制腫瘤細胞生長，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡和分化。本文研究丹參酮ⅡA對黑素瘤細胞增殖及自噬表達的影響，并進一步探討信號傳導(dǎo)通路。

材料與方法

一、主要材料

黑素瘤A375細胞購自中國科學(xué)院細胞研究所。胎牛血清、胰蛋白酶（美國Gibco公司）；Beclin?1、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule?associated protein 1 light chain 3，LC3）?Ⅱ抗體（美國Santa Cruz公司）；磷酸肌醇3激酶（PI3K）蛋白、磷酸化（p）?蛋白激酶B（Akt）、p?雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、p?p70S6K1（美國Cell Signaling公司）。丹參酮ⅡA標(biāo)準(zhǔn)品購自中國食品藥品檢定研究院。

二、方法

1.細胞培養(yǎng)：用含10%胎牛血清的高糖Dulbeccos極限必需培養(yǎng)基（DMEM）培養(yǎng)黑素瘤A375細胞，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2。

2.丹參酮ⅡA溶液的配置：取丹參酮ⅡA標(biāo)準(zhǔn)品20 mg溶于2 ml二甲基亞砜中，充分溶解配置得10g/L丹參酮ⅡA儲存液，以每管10μl分裝于1.5ml尖底離心管中，封口膜及錫紙封閉，儲存于-20℃。以預(yù)溫的含10%胎牛血清的DMEM稀釋10 g/L丹參酮ⅡA儲存液1 000倍以上配置不同濃度的丹參酮ⅡA工作液，以使工作液中二甲基亞砜的濃度不超過0.1%，即丹參酮ⅡA工作液最高濃度不超過10mg/L。

3.噻唑藍（MTT）比色法檢測細胞增殖：A375細胞以5×106/L密度接種于96孔板，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。0.5、1、2和4 mg/L丹參酮ⅡA分別處理細胞24、48、72 h，對照組加入含0.1%二甲基亞砜的DMEM。每組設(shè)置6個復(fù)孔。各試驗組于實驗結(jié)束前4 h加入5 g/L MTT 20 μl，培養(yǎng)4 h后棄去培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜150 μl于室溫振蕩15 min使結(jié)晶溶解，酶標(biāo)儀于490 nm處測吸光度（A）值，用A值表示A375細胞增殖活性，以上實驗重復(fù)3次取均值。

4.流式細胞儀定量檢測細胞自噬小體的數(shù)量：A375細胞以5×106/L密度接種于6孔板，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。1、2和4 mg/L丹參酮ⅡA分別處理細胞48 h，對照組加入含0.1%二甲基亞砜的DMEM。收集各組細胞，用1 mg/L吖啶橙室溫避光染色20 min，離心后棄去染液，用1×磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗3次后，再用1×PBS重懸細胞，上流式細胞儀檢測熒光信號，F(xiàn)L1通道檢測綠色熒光，F(xiàn)L3通道檢測紅色熒光，紅色熒光的強弱反映細胞內(nèi)自噬小體的數(shù)量，以自噬小體陽性細胞的百分比計算自噬小體的數(shù)量。

5.Western印跡檢測A375細胞自噬蛋白及信號通路相關(guān)蛋白的表達：1、2、4 mg/L丹參酮ⅡA處理A375細胞48 h后，PBS洗滌細胞，加入預(yù)冷的蛋白裂解液裂解細胞，收集上清，提取細胞總蛋白，Broadford法測定蛋白含量。取70 μg蛋白上樣，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS?PAGE）垂直電泳、聚亞乙烯雙氧化物（PVDF）轉(zhuǎn)膜，加入一抗（Beclin?1、LC3?Ⅱ、PI3K、Akt、mTOR、p70S6K1的稀釋比例分別為1∶3 000、1∶4 000、1∶5 000、1∶4 000、1∶4 000、1∶3 000）、二抗（辣根過氧化酶標(biāo)記抗體，1∶5 000稀釋），X線曝光、顯影及定影，用各抗體灰度值與3?磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）灰度值的比值代表各檢測蛋白的相對表達量。每組樣本各重復(fù)實驗3次取均值。

6.統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)以±s表示，細胞增殖活性分析用重復(fù)測量資料的方差分析，其他實驗數(shù)據(jù)用單因素方差分析和SNK檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、丹參酮ⅡA抑制黑素瘤A375細胞增殖活性

0.5、1、2和4 mg/L丹參酮ⅡA分別作用黑素瘤A375細胞24、48、72 h，均能抑制A375細胞的增殖（表1）。重復(fù)測量資料的方差分析顯示，隨時間的延長，丹參酮ⅡA對細胞增殖抑制作用逐漸增強，且有時間依賴性，符合一次直線趨勢（F=1235.25，P＜0.05）；隨丹參酮ⅡA濃度的增加，細胞增殖抑制率亦逐漸升高，有明顯的劑量依賴關(guān)系（F=2564.12，P＜0.05）；對照組與不同濃度丹參酮ⅡA組之間在各個時間點的增殖抑制率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

二、丹參酮ⅡA促進A375細胞生成自噬小體

1、2和4 mg/L丹參酮ⅡA作用A375細胞48 h后，細胞內(nèi)自噬小體比例分別為6.91%±0.35%、13.11%±0.73%、25.51%±0.83%，對照組為0.41%±0.02%，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=1013.819，P＜0.001）。SNK檢驗顯示，1、2和4 mg/L丹參酮ⅡA組細胞內(nèi)自噬小體數(shù)量均比對照組多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），且1、2和4 mg/L丹參酮ⅡA間細胞內(nèi)自噬小體數(shù)量差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），黑素瘤A375細胞自噬小體數(shù)量隨丹參酮ⅡA濃度的增加而逐漸增加。

三、丹參酮ⅡA對A375細胞自噬相關(guān)蛋白表達的影響

如表2所示，1、2和4 mg/L丹參酮ⅡA作用A375細胞48 h后，細胞自噬相關(guān)蛋白Beclin?1和LC3?Ⅱ表達水平隨丹參酮ⅡA濃度增加而升高，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.001）。SNK檢驗顯示，與對照組相比，1、2和4 mg/L丹參酮ⅡA組Beclin?1、LC3?Ⅱ蛋白表達均明顯增加（均P＜ 0.05），且不同濃度丹參酮ⅡA組間比較蛋白表達均有顯著性差異（均P＜0.05），提示丹參酮ⅡA可促進A375細胞發(fā)生自噬。

表1 不同濃度丹參酮ⅡA作用A375細胞24、48、72 h后細胞增殖抑制率的比較（%，±s）

表1 不同濃度丹參酮ⅡA作用A375細胞24、48、72 h后細胞增殖抑制率的比較（%，±s）

注：n=6。a：與對照組比較，P ＜ 0.05

組別對照組0.5 mg/L丹參酮ⅡA組1.0 mg/L丹參酮ⅡA組2.0 mg/L丹參酮ⅡA組4.0 mg/L丹參酮ⅡA組24 h 0.02±0.01 8.66±0.47a 13.50±0.87a 19.09±0.84a 34.02±1.12a 48 h 0.09±0.01 12.59±0.71a 18.06±0.65a 23.29±0.52a 40.58±0.58a 72 h 0.10±0.02 18.50±0.74a 24.65±0.96a 32.45±0.64a 51.95±0.20a

表2 丹參酮ⅡA對A375細胞自噬相關(guān)蛋白及信號通路的影響（±s）

表2 丹參酮ⅡA對A375細胞自噬相關(guān)蛋白及信號通路的影響（±s）

注：n=6。a：與對照組比較，P ＜ 0.05

組別對照組1 mg/L丹參酮ⅡA組2 mg/L丹參酮ⅡA組4 mg/L丹參酮ⅡA組F值P值Beclin?1 0.09±0.02 0.33±0.01a 0.53±0.04a 0.63±0.02a 229.884＜0.001 LC3?Ⅱ0.21±0.01 0.41±0.01a 0.52±0.02a 0.64±0.02a 431.179＜0.001 PI3K 0.57±0.03 0.40±0.02a 0.25±0.02a 0.09±0.01a 242.138＜0.001 p?Akt 0.49±0.02 0.36±0.04a 0.25±0.03a 0.06±0.03a 95.683＜0.001 p?mTOR 0.63±0.02 0.47±0.02a 0.36±0.01a 0.20±0.03a 232.699＜0.001 p?p70S6K1 0.48±0.03 0.40±0.01a 0.31±0.02a 0.16±0.02a 110.400＜0.001

四、丹參酮ⅡA對A375細胞自噬相關(guān)信號通路的影響

如表2所示，1、2和4 mg/L丹參酮ⅡA作用A375細胞48 h后，PI3K?Akt?mTOR?p70S6K1信號通路中PI3K、p?Akt、p?mTOR和p?p70S6K1蛋白表達均逐漸下降，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.001）。SNK檢驗顯示，1、2和4 mg/L丹參酮ⅡA組PI3K、p?Akt、p?mTOR和p?p70S6K1蛋白表達均低于對照組（均P＜0.05），且各丹參酮ⅡA組間這4種蛋白差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

討 論

愈來愈多的研究顯示自噬與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。當(dāng)細胞的DNA和蛋白質(zhì)受到損傷的時候，細胞主要通過自噬作用來維持細胞的穩(wěn)態(tài)，若自噬能力下降，DNA受損將會提高腫瘤的發(fā)生率［3］。也有研究［4］顯示，因腫瘤細胞本身存在凋亡缺陷，主要依靠自噬作用來維持腫瘤細胞的存活。在食道癌中，放射治療后可誘導(dǎo)癌細胞自噬，從而促進癌細胞增殖進而造成對治療抵抗［5］。因此自噬對腫瘤細胞有保護和殺傷的雙重作用，在腫瘤發(fā)生過程中，自噬究竟有利抑或有害的作用尚無定論。有研究［2］認(rèn)為，腫瘤形成的早期，自噬起到積極作用，當(dāng)腫瘤進展到晚期，自噬反而能促進癌細胞的存活，起到消極的作用。通過調(diào)控癌細胞自噬與凋亡的關(guān)系可能在腫瘤的治療中具有廣闊的前景［6］。

惡性黑素瘤的惡性程度較高，且早期極易發(fā)生血液和淋巴轉(zhuǎn)移。目前主要采用手術(shù)治療，但不能有效控制復(fù)發(fā)及遠處轉(zhuǎn)移。Hara等［7］檢測到細胞自噬相關(guān)蛋白Beclin?1在發(fā)展成熟的黑素瘤中高表達，而在原位黑素瘤中低表達，提示自噬在黑素瘤中呈階段依賴性。已有研究顯示，玫瑰茄葉多酚提取物［8］、姜黃素［9］等可通過自噬來減弱惡性黑素瘤的生長，達到治療的目的。在皮膚基底細胞癌中，咪喹莫特誘導(dǎo)細胞自噬對腫瘤細胞也產(chǎn)生一定的抑制作用［10］。然而，在其他皮膚惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)一些藥物可通過下調(diào)自噬抑制腫瘤細胞的惡性增殖，如在皮膚鱗癌中，3甲基腺嘌呤通過抑制自噬可以增強癌細胞對化療反應(yīng)的敏感性［11］。

丹參酮ⅡA是中藥丹參中提取的一種脂溶性成分，可抑制食道癌［12］、結(jié)腸癌［13］等多種腫瘤細胞生長，誘導(dǎo)其凋亡和分化，具有良好的抗腫瘤前景。體外研究顯示［14］，丹參酮可在細胞內(nèi)產(chǎn)生活性氧化物誘導(dǎo)肺癌細胞發(fā)生保護性自噬和凋亡。丹參酮ⅡA作用白血病KBM?5細胞系后，可通過激活A(yù)MP依賴的蛋白激酶（AMPK）和細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）抑制mTOR和p70S6K，從而誘導(dǎo)細胞發(fā)生自噬性細胞死亡［15］。為了證實丹參酮ⅡA對皮膚黑素瘤的抑制作用及其與自噬的關(guān)聯(lián)性，本研究采取不同濃度的丹參酮ⅡA體外處理黑素瘤A375細胞，MTT檢測顯示丹參酮ⅡA具有抑制黑素瘤A375細胞增殖的作用，且呈時間和濃度依賴性。

LC3是細胞自噬膜的通用標(biāo)記物，主要分為兩種亞型。當(dāng)細胞沒有發(fā)生自噬時，細胞內(nèi)合成的LC3經(jīng)過加工，成為胞質(zhì)可溶性Ⅰ型LC3并常規(guī)表達。當(dāng)機體發(fā)生自噬時，Ⅰ型LC3經(jīng)泛素樣加工修飾，與自噬泡膜表面的腦磷脂（PE）結(jié)合，成為LC3?Ⅱ。由于LC3?Ⅱ在自噬晚期階段表達，其含量在某種程度上反映了細胞的自噬活性，更適用于自噬的檢測，主要反映細胞內(nèi)自噬體數(shù)量。Beclin?1在促進自噬起始囊泡的形成過程及細胞自噬發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用，與LC3聯(lián)合檢測可反應(yīng)細胞自噬的活性。本研究顯示，丹參酮ⅡA作用A375細胞48 h后，隨丹參酮ⅡA濃度的增加，Beclin?1和LC3?Ⅱ蛋白表達含量均逐漸增加，說明丹參酮ⅡA促進黑素瘤A375細胞發(fā)生自噬。自噬上調(diào)伴隨黑素瘤細胞增殖抑制，提示丹參酮ⅡA可能通過誘導(dǎo)細胞自噬，抑制黑素瘤細胞的增殖，在抗黑素瘤作用中起積極的作用。

PI3K/AKT/mTOR/p70S6K1信號通路在正常細胞生理過程中發(fā)揮作用，也是腫瘤細胞生成、增殖和轉(zhuǎn)移過程中的主要調(diào)節(jié)器。該信號通路的活化可以抑制由多種刺激誘發(fā)的細胞凋亡，加快細胞周期進展，從而促進細胞增殖、腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究顯示，丹參酮ⅡA作用于A375細胞48 h后，隨丹參酮ⅡA藥物濃度的增加，該通路中PI3K、Akt、mTOR和p70S6K1蛋白的表達均逐漸下降，說明PI3K?Akt?mTOR?p70S6K1通路的活性下降。

綜上所述，本研究顯示丹參酮ⅡA可能通過抑制PI3K?Akt?mTOR?p70S6K1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進黑素瘤細胞發(fā)生自噬，從而抑制黑素瘤細胞的增殖，為黑素瘤治療提供一定的理論依據(jù)。

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In vitroeffects of tanshinoneⅡA on autophagy of A375 melanoma cells and related signaling pathway

Li Xiaojing,Li Zhifeng,Li Xianping,Liu Baoguo,Liu Zhijun
Department of Dermatology,Affiliated Hospital of Hebei University of Engineering,Handan 056002,Hebei,China

s:Liu Baoguo,Email:LBG66@163.com;Liu Zhijun,Email:zlmdsh@126.com

ObjectiveTo investigatein vitroeffects of tanshinoneⅡA on the autophagy of A375 melanoma cells and related signaling pathway.MethodsSome cultured A375 cells were divided into 5 groups to be treated with tanshinoneⅡA at concentrations of 0.5,1,2 and 4 mg/L,and DMEM containing 0.1%dimethyl sulfoxide（DMSO）,respectively,for 24,48,72 hours.Methyl thiazol tetrazolium（MTT）assay was performed to estimate the proliferative activity of A375 cells.Some cultured A375 cells were divided into 4 groups to be treated with 1,2 and 4 mg/L tanshinone ⅡA（1?,2?and 4?mg/L tanshinone group）,and DMEM containing 0.1%DMSO （control group）,respectively,for 48 hours.Then,flow cytometry was conducted to count autophagosome?positive cells,and Western blot analysis to determine protein expression of autophagy?associated proteins Beclin?1,microtubule?associated protein 1 light chain 3（LC3）?Ⅱ,phosphatidylinositol 3?kinase（PI3K）,protein kinase B（Akt）,mammalian target of rapamycin（mTOR）and p70 ribosomal protein S6 kinase 1（p70S6K1）.ResultsMTT assay showed that 24?,48?,72?hour treatments with tanshinoneⅡA at concentrations of 0.5,1,2 and 4 mg/L all could inhibit the proliferative activity of A375 cells,and the inhibitory effects increased in a dose?and time?dependent manner（F=2 564.12,1 235.25,bothP＜ 0.05）.The percentage of autophagosome?positive cells and protein expression of Beclin?1 and LC3?Ⅱ increased gradually and significantly in the 1?,2?and 4?mg/L tanshinone groups（autophagosome?positive cells:6.91% ±0.35%,13.11% ±0.73%,25.51% ±0.83%,respectively;Beclin?1:0.33±0.01,0.53±0.04,0.63±0.02,respectively;LC3?Ⅱ:0.41±0.01,0.52±0.02,0.64 ± 0.02,respectively）,after 48?hour treatment,which were significantly different between the tanshinone groups（allP＜ 0.05）,and higher in the tanshinone groups than in the control group（0.41% ±0.02%;0.09±0.02;0.21±0.01,allP＜0.05）.However,the protein expression of PI3K,phosphorylated Akt（p?Akt）,p?mTOR and p?p70S6K1 in the PI3K?Akt?mTOR?p70S6K1 signaling pathway decreased gradually and significantly with the increase in tanshinone concentrations after 48?hour treatment,and were significantly lower in all the tanshinone groups than in the control group（allP＜ 0.05）.ConclusionTanshinoneⅡA can promote the auophagy of A375 cells,likely by blocking the PI3K?Akt?mtTOR?p70S6K1 signaling pathway.

Melanoma;Tanshinone;Autophagy;A375 cells

劉保國，Email：LBG66@163.com；劉志軍，Email：zlmdsh@126.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.01.008

2016?05?03）

（本文編輯：顏艷）