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      Mac-1基因缺失對黑色素瘤生長的影響

      2017-11-01 14:54:52段有發(fā)葉志金王麗京章倩倩
      中國比較醫(yī)學(xué)雜志 2017年10期
      關(guān)鍵詞:黑色素瘤白細(xì)胞顯著性

      陳 堅,段有發(fā),葉志金,王麗京,章倩倩

      (廣東藥科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院,血管生物學(xué)研究所,廣州 510006)

      研究報告

      Mac-1基因缺失對黑色素瘤生長的影響

      陳 堅,段有發(fā),葉志金,王麗京,章倩倩*

      (廣東藥科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院,血管生物學(xué)研究所,廣州 510006)

      目的探討Mac-1缺失對黑色素瘤腫瘤生長的影響。方法Mac-1基因敲除(Mac-1-/-)小鼠擴(kuò)群獲得實驗所需數(shù)量小鼠。設(shè)立對照組C57BL/6J小鼠和實驗組Mac-1-/-小鼠,分別皮下注射B16-F10細(xì)胞,統(tǒng)計小鼠生存率、測量腫瘤體積和重量,通過免疫組化染色檢測腫瘤細(xì)胞增殖及巨噬細(xì)胞浸潤情況。結(jié)果Mac-1缺失后的黑色素瘤小鼠存活率較對照組C57BL/6J小鼠有顯著性差異(P﹤0.001),腫瘤體積和重量較對照組C57BL/6J小鼠有顯著性差異(P﹤0.001),腫瘤組織中增殖細(xì)胞數(shù)目與對照組相比較有顯著性差異(P﹤0.01),并且腫瘤組織中巨噬細(xì)胞浸潤顯著減少。結(jié)論Mac-1基因缺失顯著抑制黑色素瘤腫瘤生長。

      Mac-1;黑色素瘤;腫瘤生長

      表面受體整合素CD11b/CD18,又稱為巨噬細(xì)胞抗原-1(macrophage associated antigen-1,Mac-1)、補(bǔ)體受體3(CR3)或αMβ2,在髓系來源白細(xì)胞上表達(dá)豐富并介導(dǎo)其關(guān)鍵的黏附運動[1,2]。研究表明Mac-1的表達(dá)與腫瘤進(jìn)程有密切關(guān)系[3]。我們前期研究發(fā)現(xiàn),Mac-1缺失會降低髓系細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境的募集,進(jìn)而減少腫瘤微環(huán)境中TNFα(tumor necrosis factor-α)含量,抑制Wnt/β-catenin信號通路,最終抑制腸道腫瘤的生長[4]。說明Mac-1可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。惡性黑色素瘤是一種由黑色素細(xì)胞發(fā)展而來的惡性腫瘤,多發(fā)生于皮膚組織,也可發(fā)生于眼、肺、消化系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、淋巴結(jié)等其他組織[5]。黑色素瘤的治療存活率普遍較低,尋找新的分子治療靶點將有望推動黑色素瘤治療的進(jìn)展。目前Mac-1缺失對黑色素瘤生長的影響研究尚不明確,我們運用Mac-1基因敲除小鼠建立皮下移植瘤模型,研究Mac-1基因缺失對黑色素瘤發(fā)生發(fā)展的影響。為探討Mac-1作為研究黑色素瘤治療新靶點提供理論依據(jù)。

      1 材料和方法

      1.1實驗動物

      SPF級Mac-1敲除小鼠純合子(Mac-1-/-),12只,雌性和雄性各6只,體重20~22 g,7周齡,購于美國Jackson實驗室[B6.129S4-Itgamtm1Myd/J, stock No. 003991]。SPF級C57BL/6J小鼠(C57,雌性,體重20~22 g),23只,6~8周齡,廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心購買[SCXK(粵)2013-0002]。無菌手術(shù)在廣東藥科大學(xué)實驗動物中心屏障環(huán)境內(nèi)進(jìn)行[SYXK(粵)2012-0125]。所有實驗動物相關(guān)的操作均經(jīng)過廣東藥科大學(xué)實驗動物使用與管理委員會(ICUC)批準(zhǔn)[批準(zhǔn)號為:gdpulac2016]。

      1.2細(xì)胞株

      B16-F10黑色素瘤細(xì)胞株購于中科院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所,37℃貼壁培養(yǎng)在含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中,待細(xì)胞處于指數(shù)生長期時進(jìn)行實驗。

      1.3主要試劑與儀器

      胎牛血清、胰蛋白酶和DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Gibco公司;Ki67抗體購自基因科技有限公司;CD68抗體購自Abcam公司;Omniscript? Reverse Transcription Kit購自Qiagen公司;QuantiTect? SYBR? Green PCR Kit購自Qiagen公司;獨立通氣籠IVC(蘇杭科技器材有限公司);CO2培養(yǎng)箱(Thermo,美國)。

      1.4實驗方法

      1.4.1 異體移植黑色素瘤模型建立

      Mac-1-/-小鼠飼養(yǎng)于溫度(25±3)℃,相對濕度40% ~60%,自動光控時間12 h明/12 h暗的SPF級環(huán)境中。Mac-1-/-小鼠(8~12周齡)以雄∶雌=1∶3的比例配種,共配兩籠,母鼠懷孕后單獨飼養(yǎng),記錄產(chǎn)仔日期和產(chǎn)仔數(shù),3周齡時將仔鼠按照性別分籠飼養(yǎng),并編號。

      Mac-1-/-小鼠為實驗組,C57小鼠為對照組,各22只,雌性,6周齡。取指數(shù)生長期B16細(xì)胞,胰酶消化后臺盼藍(lán)染色確定活細(xì)胞數(shù)95%以上,用無菌生理鹽水將細(xì)胞稀釋后每只小鼠右上肢腋下皮下接種1×105個細(xì)胞(0.2 mL)。

      1.4.2 腫瘤體積及重量的測定

      從細(xì)胞注射后第10天開始每組取10只小鼠,每天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑(L)和短徑(W)直至第17天,并按照公式統(tǒng)計腫瘤的體積V=0.5236×(L×W2)。第17天測量完畢將小鼠處死,剝離腫瘤并稱重。

      1.4.3 小鼠生存率統(tǒng)計

      剩余小鼠每天觀察生長生活情況,記錄自然死亡時間統(tǒng)計小鼠生存率。

      1.4.4 免疫組化染色

      小鼠斷頸處死并分離腫瘤組織,10%中性福爾馬林固定過夜,石蠟包埋切片。4 μm厚切片脫蠟,脫水,并用10% BSA室溫封閉30 min。一抗4℃孵育過夜,PBS洗三次,二抗室溫孵育1 h,DAB顯色,蘇木素復(fù)染。然后在顯微鏡下觀察拍照。

      1.4.5 實時熒光定量PCR檢測Mac-1缺失對腫瘤組織中炎癥因子表達(dá)的影響

      剪取50 mg腫瘤組織,于研缽中加入液氮研磨至粉狀,加1 mL Trizol,收集至1.5 mL離心管,靜置5 min。加入0.2 mL氯仿混勻,13 000 r/min 4℃離心15 min,吸取上層水相,加0.5 mL異丙醇混勻,沉淀10 min。13 000 r/min 4℃離心10 min,棄上清,加1 mL 75%乙醇混勻,7500 r/min 4℃離心5 min,棄上清,20 μL DEPC水溶解,測定濃度。參考文獻(xiàn)方法,用Omniscript? Reverse Transcription Kit反轉(zhuǎn)錄,QuantiTect? SYBR? Green PCR Kit進(jìn)行擴(kuò)增[6]。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為:37℃ 15 min,85℃ 5 s。熒光定量PCR擴(kuò)增程序為95℃ 3 min,95℃ 7 s、57℃ 10 s、72℃ 15 s 40個循環(huán)。按照文獻(xiàn)報道方法進(jìn)行結(jié)果分析[7],并對炎癥因子表達(dá)差異在2倍以上的進(jìn)行統(tǒng)計分析。

      1.5統(tǒng)計學(xué)方法

      2 結(jié)果

      2.1Mac-1-/-小鼠繁育結(jié)果

      Mac-1-/-小鼠按照雄∶雌=1∶3比例配種,擴(kuò)大種群,平均每只母鼠的窩產(chǎn)仔數(shù)為8只,共產(chǎn)仔50只。

      2.2Mac-1基因敲除對黑色素瘤模型小鼠生存時間的影響

      小鼠在接種B16腫瘤細(xì)胞后第7天觀察到體表明顯成瘤。成瘤后第10天開始,每天觀察小鼠生活狀態(tài),并記錄小鼠的死亡時間,繪制小鼠生存曲線圖(見圖1)。注射B16細(xì)胞后C57BL/6J小鼠在13周開始出現(xiàn)死亡,在第27周時死亡率達(dá)100%;而Mac-1-/-小鼠則在15周時出現(xiàn)死亡,36周時死亡率達(dá)100%。與對照組相比,實驗組Mac-1-/-小鼠生存時間延長,差異有顯著性(P< 0.001)。

      圖1 皮下注射B16細(xì)胞后Mac-1-/-小鼠和C57BL/6J小鼠生存率(n=10)Fig.1 The survival rate of Mac-1-/- and C57BL/6J mice after subcutaneous injection of B16 cells

      2.3Mac-1缺失對黑色素瘤生長的影響

      分別在Mac-1敲除小鼠和C57小鼠右前肢皮下接種B16黑色素瘤細(xì)胞,10天后均形成可見瘤結(jié)節(jié)。成瘤后,每天測量移植瘤長、短徑,計算體積,并繪制出移植瘤生長曲線(圖2)。C57小鼠移植瘤生長較快,腫瘤體積由0.224 cm3增加到3.023 cm3;而Mac-1敲除小鼠移植瘤生長較緩慢,腫瘤體積由0.062 cm3僅增加到1.108 cm3。與C57小鼠移植瘤相比,Mac-1敲除小鼠移植瘤體積減小,差異有顯著性(P<0.01)。

      注:與C57組比較,** P< 0.01,***P< 0.001。圖2 Mac-1敲除小鼠皮下移植黑色素瘤生長受到抑制(n=10)Note. Compared with the C57 group, ** P< 0.01,***P< 0.001.Fig.2 The tumor volume of Mac-1-/- mice was significantly inhibited compared with the C57BL/6J mice after subcutaneous injection of B16 cells

      在接種腫瘤后第17天頸椎脫臼處死小鼠,剝?nèi)∫浦擦龇Q重。從圖3可見,C57小鼠移植瘤生長較快,平均腫瘤重量為3.28 g,而Mac-1敲除小鼠移植瘤生長較慢,平均腫瘤重量僅為1.32 g。Mac-1敲除小鼠的腫瘤重量低于C57小鼠,差異有顯著性(P< 0.001)。

      注:與C57組比較,***P< 0.001。圖3 Mac-1敲除小鼠皮下移植黑色瘤的重量受到抑制(n=9)Note. Compared with the C57 group, ***P<0.001.Fig.3 The tumor weight of Mac-1-/- mice was the significantly inhibited compared with the C57BL/6J mice after subcutaneous injection of B16 cells

      2.4Mac-1缺失對黑色素瘤腫瘤細(xì)胞增殖的影響

      對腫瘤組織進(jìn)行免疫組化染色,檢測Mac-1缺失對腫瘤細(xì)胞增殖的影響。發(fā)現(xiàn)對照組小鼠腫瘤組織中,陽性染色的增殖細(xì)胞較多,而Mac-1缺失的小鼠腫瘤組織中,PCNA(proliferating cell nuclear antigen)陽性染色的增殖細(xì)胞較少。并且如圖4統(tǒng)計結(jié)果顯示,Mac-1缺失抑制小鼠腫瘤組織中腫瘤細(xì)胞的增殖,且差異有顯著性(P< 0.01)。

      2.5Mac-1缺失對腫瘤組織中巨噬細(xì)胞浸潤的影響

      腫瘤組織中通過對巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD68進(jìn)行免疫組化染色。如圖5顯示,Mac-1缺失腫瘤組織中巨噬細(xì)胞的浸潤數(shù)目較少,而C57對照組腫瘤組織中有大量巨噬細(xì)胞浸潤。

      注:與C57組比較,** P< 0.01。圖4 Ki67免疫組化染色Note. Compared with the C57 group, ** P< 0.01.Fig.4 Immunohistological staining for Ki67 in the tumor tissues

      2.6Mac-1缺失對腫瘤組織中細(xì)胞因子的影響

      通過對兩種小鼠腫瘤組織進(jìn)行總RNA提取,通過real-time PCR檢測白細(xì)胞分泌的驗證相關(guān)細(xì)胞因子進(jìn)行篩選,對表達(dá)有2倍差異以上的基因進(jìn)行統(tǒng)計,發(fā)現(xiàn)Mac-1缺失后,皮下移植黑色素瘤內(nèi)細(xì)胞因子CXCL9(Cxc chemokine ligand-9)表達(dá)上調(diào)18倍,IFN-γ(interferon-γ)表達(dá)上調(diào)8.5倍(圖6)。

      圖6 細(xì)胞因子表達(dá)Fig.6 Cytokine expression in the tumor tissues

      3 討論

      Mac-1是由α(CD11b)和β(CD18)兩個亞基以非共價鍵的方式締合而成的異二聚體,表達(dá)于白細(xì)胞表面參于機(jī)體防御及免疫反應(yīng)的重要粘附分子,其主要影響白細(xì)胞粘附和遷移出內(nèi)皮細(xì)胞或上皮細(xì)胞,到達(dá)炎癥部位介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[2]。Ahn等[8]證實抑制Mac-1的表達(dá)能減少白細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的募集,減弱腫瘤的抗輻射能力。并且,Mac-1陽性白細(xì)胞大量分泌MMP9(matrix metalloproteinase-9)促進(jìn)腫瘤血管新生[9]。Spicer等[10]發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞通過Mac-1/ICAM-1與腫瘤細(xì)胞黏附,協(xié)助腫瘤轉(zhuǎn)移。我們前期研究表明,Mac-1陽性白細(xì)胞在結(jié)腸癌組織中大量浸潤,缺失Mac-1能夠抑制結(jié)腸癌腫瘤生長[4]。本研究應(yīng)用Mac-1基因敲除小鼠建立移植瘤模型,探討Mac-1缺失對惡性黑色素瘤腫瘤生長的影響。發(fā)現(xiàn)Mac-1缺失可以抑制黑色素瘤腫瘤生長及腫瘤細(xì)胞增殖,并且腫瘤微環(huán)境中巨噬細(xì)胞浸潤數(shù)目減少。說明Mac-1缺失可能通過抑制腫瘤微環(huán)境中巨噬細(xì)胞浸潤來抑制腫瘤的生長。

      黑色素瘤是一種惡性程度較高的腫瘤,多發(fā)生于皮膚。其預(yù)后效果差,易轉(zhuǎn)移的特點使得患者不能順利地治愈。Li[11]團(tuán)隊最近發(fā)現(xiàn)抑制髓樣細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的募集能有效提高黑色素瘤免疫治療。腫瘤的發(fā)展與髓樣細(xì)胞的激活密切相關(guān),其中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophage,TAM)為腫瘤生長提供了所需的因子[12]。TAM是浸潤在腫瘤組織中最多的白細(xì)胞,分泌多種炎癥因子調(diào)節(jié)腫瘤的生長,因此我們主要檢測腫瘤組織中巨噬細(xì)胞的浸潤情況。根據(jù)巨噬細(xì)胞的活化類型及其在腫瘤微環(huán)境中的不同作用,TAM主要分為M1型和M2型巨噬細(xì)胞。IFN-γ刺激M1型巨噬細(xì)胞,誘導(dǎo)一氧化氮合酶和CXCL9等因子的表達(dá),抑制腫瘤生長。而M2型巨噬細(xì)胞主要促進(jìn)腫瘤生長。我們研究結(jié)果顯示,Mac-1缺失后IFN-γ和CXCL9表達(dá)升高。同時Keane[13],Alshaker[14]等研究表明CXCL-9及IFN-γ能減弱血管生成和腫瘤生長。提示雖然腫瘤微環(huán)境中巨噬細(xì)胞浸潤數(shù)目減少,但是可能是浸潤的M2型巨噬細(xì)胞減少,而M1型巨噬細(xì)胞增多,抑制了腫瘤生長。對腫瘤具有殺傷作用的CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞可以分泌IFN-γ,但是這兩種白細(xì)胞在腫瘤組織中的浸潤情況,以及IFN-γ升高是否由于這兩種白細(xì)胞分泌尚不清楚,我們將進(jìn)一步在今后的研究中深入探討。

      綜上所述,Mac-1基因的缺失能夠抑制黑色素瘤的生長,可能是通過促進(jìn)IFN-γ分泌增加M1型、減少M2型巨噬細(xì)胞在腫瘤組織中浸潤,促進(jìn)CXCL9分泌,進(jìn)而抑制抑制腫瘤生長。本研究對Mac-1作為臨床治療腫瘤靶點的開發(fā)具有重要理論指導(dǎo)意義。

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      EffectofMac-1deficiencyonthetumorgrowthofmelanomainmice

      CHEN Jian, DUAN You-fa, YE Zhi-jin, WANG Li-jing, ZHANG Qian-qian*

      (Institute of Vascular Biology, School of Basic Course, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China)

      ObjectiveTo explore the influence ofMac-1 deficiency on tumor growth of melanoma.MethodsThe population ofMac-1 gene knock-out (Mac-1-/-) mice was expanded. B16-F10 cells were subcutaneously injected into the C57BL/6J mice (control group) andMac-1-/-mice (experiment group), respectively. Subsequently,the survival rate, tumor volume and body weight were recorded. The proliferation and infiltration of macrophages were detected by immunohistochemistry.ResultsThe survival rate ofMac-1-/-mice was significantly improved compared with the C57BL/6J mice (P﹤0.001). The tumor volume and body weight were remarkably decreased in theMac-1-/-mice compared with the control group (P﹤0.001). Meanwhile, the tumor cell proliferation index was decreased in theMac-1-/-mice compared with the control group (P﹤0.01).Furthermore, the infiltration of macrophages in the tumor tissues was also decreased in Mac-1-/-tumor mice compared with control group.ConclusionsMac-1 gene deletion can significantly suppress melanoma growth.

      Mac-1; Melanoma; Tumor growth; Mice

      R-33

      A

      1671-7856(2017) 10-0023-05

      10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.10.005

      2016-12-16

      國家自然科學(xué)基金(31712904);廣東省科技計劃(2015A030302083);廣東省優(yōu)秀青年教師培養(yǎng)計劃(YQ2015100);廣州市珠江科技新星(201610010045)。

      陳堅(1993-),男,碩士研究生,研究方向:腫瘤藥理,模式動物疾病模型。E-mail: chenjian_ivory@163.com

      章倩倩(1981-),女,副研究員,研究方向:腫瘤藥理,模式動物疾病模型。E-mail: vinny223@126.com

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