廣東省2014～2016年普通級(jí)兔和豚鼠病毒抗體監(jiān)測(cè)與分析

吳瑞可，王 靜，潘金春，李秀珍，陳梅玲，黃樹(shù)武，閔凡貴

(廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所，廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510663)

研究報(bào)告

廣東省2014～2016年普通級(jí)兔和豚鼠病毒抗體監(jiān)測(cè)與分析

吳瑞可，王 靜，潘金春，李秀珍，陳梅玲，黃樹(shù)武，閔凡貴*

(廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所，廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510663)

目的依據(jù)GB 14922.2標(biāo)準(zhǔn)中SPF級(jí)動(dòng)物質(zhì)量要求，對(duì)2014～2016年廣東省生產(chǎn)許可單位的普通級(jí)兔和豚鼠進(jìn)行病毒抗體監(jiān)測(cè)，分析從普通級(jí)動(dòng)物中篩查SPF級(jí)動(dòng)物的可行性。方法累計(jì)收集到來(lái)自6家單位9批次的167只普通級(jí)兔和155只普通級(jí)豚鼠血清樣本，采用ELISA方法檢測(cè)GB 14922.2標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的SPF級(jí)動(dòng)物排除的病毒抗體。結(jié)果兔出血癥病毒(RHDV)免疫陽(yáng)性率85.4%(134/157)，10只非免動(dòng)物抗體均為陰性，兔輪狀病毒(RRV)陽(yáng)性率42.5%(71/167)，兔仙臺(tái)病毒(SV)結(jié)果均為陰性。豚鼠呼腸孤病毒Ⅲ型(REO-3)陽(yáng)性率52.9%(82/155)，豚鼠小鼠肺炎病毒(PVM)陽(yáng)性率20%(31/155)，仙臺(tái)病毒(SV)和淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦炎病毒(LCMV)均為陰性。結(jié)論普通級(jí)兔和豚鼠雖然滿(mǎn)足國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求，但SPF級(jí)動(dòng)物質(zhì)量要求排除的病原污染率較高，表明不適宜通過(guò)群體篩查獲得滿(mǎn)足SPF級(jí)質(zhì)量要求的動(dòng)物。

普通級(jí)；兔；豚鼠；病毒；抗體檢測(cè)

兔和豚鼠是目前國(guó)內(nèi)使用量較大、標(biāo)準(zhǔn)化程度較高的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，廣泛應(yīng)用于生物科學(xué)研究和醫(yī)藥檢驗(yàn)等領(lǐng)域。隨著科學(xué)研究和醫(yī)藥檢驗(yàn)要求的提高，清潔級(jí)和SPF級(jí)兔和豚鼠的用量逐步增加，但因受制于較高的生產(chǎn)和使用成本，清潔級(jí)及SPF級(jí)兔和豚鼠尚未獲得廣泛應(yīng)用，目前，仍以普通級(jí)兔和豚鼠為主。從家兔流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果來(lái)看，兔輪狀病毒(rabbit rotavirus, RRV)和兔出血癥病毒(rabbit hemorrhagic disease virus, RHDV)感染率較高[1,2]，并且對(duì)動(dòng)物健康危害較大。國(guó)內(nèi)關(guān)于豚鼠病毒的流行病調(diào)查較少，相關(guān)報(bào)道顯示淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus, LCMV)是對(duì)豚鼠健康威脅較大的病毒[3,4]。

由于普通級(jí)兔和豚鼠生產(chǎn)設(shè)施的環(huán)境質(zhì)量控制措施有限，導(dǎo)致動(dòng)物病原暴露機(jī)會(huì)增加，加之普通級(jí)動(dòng)物需排除的病原較少，部分條件性致病微生物可能直接影響動(dòng)物的質(zhì)量及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。本研究依照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 14922.2規(guī)定的SPF級(jí)動(dòng)物質(zhì)量要求[5]，對(duì)2014～2016年本機(jī)構(gòu)監(jiān)督抽查的普通級(jí)兔和豚鼠的樣本進(jìn)行檢測(cè)，分析病原攜帶情況，探討在普通級(jí)動(dòng)物群體中篩查SPF級(jí)動(dòng)物的可行性，以期為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)、管理、使用和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)的制(修)訂提供參考。

1 材料和方法

1.1血清樣品

2014～2016年，累計(jì)收集到來(lái)自廣東省內(nèi)6家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)單位(分別定義為A、B、C、D、E、F單位)的9批次167份普通級(jí)兔和155份普通級(jí)豚鼠血清，每批次抽樣數(shù)量為5～25個(gè)。兔均為新西蘭系，豚鼠主要以FMMU、Hartley等白化品系為主，并有少量三色豚鼠。兔經(jīng)耳緣靜脈或耳中央動(dòng)脈采血，豚鼠經(jīng)心臟采血，分離血清，-80℃保存。

1.2主要試劑和儀器

ELISA試劑盒均源于美國(guó)XpressBio公司，購(gòu)自蘇州西山生物科技有限公司。本次檢測(cè)兩種動(dòng)物共計(jì)七種病毒的ELISA試劑分別為：兔出血癥病毒(RHDV)ELISA試劑(批號(hào)：K7057)、兔輪狀病毒(RRV)ELISA試劑(批號(hào)：K6951)、兔仙臺(tái)病毒(SV)ELISA試劑(批號(hào)：K6970)，豚鼠淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦炎病毒(LCMV)ELISA試劑(批號(hào)：K6948)、豚鼠小鼠肺炎病毒(PVM)ELISA試劑(批號(hào)：K6947)、豚鼠呼腸孤病毒III(REO-3)ELISA試劑(批號(hào)：K6617)、豚鼠仙臺(tái)病毒(SV)ELISA試劑(批號(hào)：K7008)。

酶標(biāo)儀為T(mén)hermo Multiskan Fc；洗板機(jī)為伯樂(lè)BIO-RAD1575酶標(biāo)洗板機(jī)；恒溫培養(yǎng)箱為上海躍進(jìn)PYX-DHS隔水式電熱恒溫箱。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 檢測(cè)項(xiàng)目

兔病毒檢測(cè)項(xiàng)目包RRV、RHDV和仙臺(tái)病毒(Sendai virus, SV)。豚鼠病毒檢測(cè)項(xiàng)目包括呼腸孤病毒III(Reovirus type III, REO-3)、小鼠肺炎病毒(Pneumonia virus of mice, PVM)、SV和LCMV。

1.3.2 檢測(cè)方法

根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行抗體檢測(cè)。兔、豚鼠各病毒均按以下步驟進(jìn)行檢測(cè)：將血清樣本1：50稀釋?zhuān)傧駿LISA 微孔板對(duì)應(yīng)的樣品孔各加100 μL稀釋好的樣本和陰性、陽(yáng)性對(duì)照(陰性、陽(yáng)性對(duì)照不稀釋)， 37℃孵育45 min后洗板5次，拍干微孔板；每孔加100 μL酶標(biāo)二抗，37℃孵育45 min后洗板5次，拍干微孔板；加顯色液室溫孵育30 min；反應(yīng)完畢，立即用酶標(biāo)儀讀板，測(cè)試波長(zhǎng)為405 nm。

結(jié)果判定方法：樣本(或?qū)φ?OD值=特異孔OD值-非特異孔OD值；陽(yáng)性對(duì)照OD值≥0.600，陰性對(duì)照OD值≤0.250，則試驗(yàn)成立；樣本OD值≥0.300判為陽(yáng)性，樣本OD值<0.300判為陰性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

根據(jù)病原的免疫和感染情況，分別計(jì)算抗體陽(yáng)性率，評(píng)價(jià)免疫保護(hù)率和感染率?？贵w陽(yáng)性率為抗體陽(yáng)性的個(gè)體數(shù)量占采樣總量的百分比；免疫保護(hù)率為免疫群體中抗體檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的個(gè)體數(shù)量占采樣總量的百分比；某病毒感染率是指該病的陽(yáng)性個(gè)體數(shù)占總采樣數(shù)量的百分比，而已知群體并未曾針對(duì)該病毒進(jìn)行過(guò)免疫。

2 結(jié)果

2.1普通級(jí)兔檢測(cè)結(jié)果

本次檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。對(duì)于普通級(jí)兔，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)只對(duì)RHDV做出規(guī)定，可以免疫，也可不免疫。除E單位2016年未進(jìn)行免疫外，其他單位各抽樣時(shí)間段均進(jìn)行了免疫，免疫后群體抗體陽(yáng)性率均在70%以上，3年的總體陽(yáng)性率為85.4%(134/157)，未免疫的動(dòng)物抗體均為陰性。

SPF級(jí)兔另需排除的2種病毒RRV和SV。除E單位未檢出RRV外，其他5家受檢單位均檢出RRV，3年的總體檢出率為42.5%(71/167)；對(duì)于SV，3年來(lái)，所有單位均未檢出。

表1 2014～2016年普通級(jí)兔檢測(cè)結(jié)果

注：*表示動(dòng)物已免疫；#表示動(dòng)物未免疫。

Note.*，indicates that animals have been vaccinated; #，indicates that animals are not vaccinated.

表2 2014～2016年普通級(jí)豚鼠檢測(cè)結(jié)果

2.2普通級(jí)豚鼠檢測(cè)結(jié)果

普通級(jí)豚鼠檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。對(duì)于普通級(jí)豚鼠，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)只對(duì)LCMV做出規(guī)定，要求陰性，3年來(lái)所有抽檢的樣本檢測(cè)結(jié)果均為陰性。

清潔級(jí)豚鼠要求進(jìn)一步排除SV，SPF級(jí)豚鼠在清潔級(jí)基礎(chǔ)上排除REO-3和PVM。3年來(lái)，所有抽檢的動(dòng)物均未檢測(cè)到SV，但PVM和Reo-3抗體陽(yáng)性率均較高，PVM的總體檢出率為20%(31/155)，Reo-3的總體檢出率為52.9%(82/155)。

3 討論

隨著生物醫(yī)藥行業(yè)的快速發(fā)展，普通級(jí)兔和豚鼠已經(jīng)不能完全滿(mǎn)足科研和檢驗(yàn)需求，而清潔級(jí)和SPF級(jí)兔和豚鼠的產(chǎn)能有限，從普通級(jí)動(dòng)物群體中篩選滿(mǎn)足清潔級(jí)和SPF級(jí)動(dòng)物質(zhì)量要求的兔和豚鼠成為解決當(dāng)前供求矛盾的捷徑。本研究對(duì)2014～2016年監(jiān)督抽查的樣本進(jìn)行了復(fù)測(cè)，涵蓋SPF級(jí)動(dòng)物質(zhì)量要求排除的病毒項(xiàng)目，旨在了解目前普通級(jí)動(dòng)物病毒的感染情況，為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)應(yīng)用和動(dòng)物篩查提供參考。

從本次調(diào)查結(jié)果來(lái)看，普通級(jí)兔RHDV群體免疫合格率均達(dá)到70%，未免疫的動(dòng)物抗體檢測(cè)結(jié)果均為陰性，符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的要求。RRV是SPF級(jí)兔要求排除的病毒，調(diào)查結(jié)果顯示該病毒感染率較高，9次抽檢結(jié)果僅1次未檢出，表明該病毒污染嚴(yán)重。SV已被證實(shí)可影響家兔的熱原試驗(yàn)，存在交叉感染[6，7]，也是SPF級(jí)兔要求排除的病原，此次調(diào)查未發(fā)現(xiàn)普通級(jí)兔攜帶SV。

普通級(jí)豚鼠均未檢出LCMV，滿(mǎn)足普通級(jí)動(dòng)物質(zhì)量要求。同時(shí)，所有動(dòng)物均未檢出SV，表明SV感染率極低，可以通過(guò)日常管理控制該病原。然而，SPF級(jí)豚鼠要求排除的2種病毒Reo-3和PVM的感染率均較高，表明基于現(xiàn)有的普通級(jí)豚鼠群體篩查滿(mǎn)足SPF級(jí)質(zhì)量要求的動(dòng)物可行性低，批量獲得滿(mǎn)足SPF級(jí)質(zhì)量要求豚鼠需要嚴(yán)格依照SPF級(jí)動(dòng)物生產(chǎn)繁育的要求進(jìn)行生產(chǎn)繁育。

綜上調(diào)查結(jié)果，廣東地區(qū)現(xiàn)有的普通級(jí)兔和豚鼠符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的普通級(jí)動(dòng)物質(zhì)量要求，但SPF級(jí)動(dòng)物規(guī)定的病毒污染率高，基于普通級(jí)動(dòng)物群體篩選高質(zhì)量動(dòng)物的可行性不高，需要建立SPF種群進(jìn)行生產(chǎn)繁育。

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SurveillanceandanalysisofvirusantibodiesinconventionalrabbitsandguineapigsinGuangdongProvinceduring2014-2016

WU Rui-ke， WANG Jing， PAN Jin-chun， LI Xiu-zhen， Chen Mei-ling， HUANG Shu-wu， MIN Fan-gui*

(Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute, Guangdong Provincial Key Laboratory of Laboratory Animals, Guangzhou 510663，China)

ObjectiveTo analyze the possibilities of screening SPF rabbits and guinea pigs from conventional animals, viral antibodies of the conventional rabbits and guinea pigs bred by licensed companies in Guangdong province during 2014 -2016 were determined according to the standard of SPF animals in GB14922.2.MethodsNine batches of 167 rabbit sera and 155 guinea pig sera were sampled from 6 companies. Serum antibodies to virus were determined by ELISA according to GB14922.2.ResultsPositivity of antibody to rabbit hemorrhagic disease virus (RHDV) was 82.2% (129/157) for the vaccinated rabbits, and negative result were obtained for unvaccinated rabbits. Positive rate of rabbit rotavirus (RRV) was 42.5% (71/167). No positive antibody responses to Sendai virus were detected out in all rabbits. The positive rates of guinea pig reovirus type III (REO-3) and pneumonia virus of mice (PVM) were 52.9%(82/155)and 20% (31/155) respectively. Antibody responses to Sendai virus (SV) and lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) were negative in all guinea pigs.ConclusionsAlthough the conventional rabbits and guinea pigs could meet the national standard, higher infection rates of virus excluded that SPF animals emerged in conventional animals, indicating that selection of SPF animals from conventional colonies is impracticable.

Conventional animals; Rabbits; Guinea pigs; Virus; Antibody detection

R-33

A

1671-7856(2017) 10-0065-04

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.10.013

2017-03-16

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2015BAI07B01)； 廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015A030302028)。

吳瑞可(1984-)，女，本科，研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物學(xué)。 E-mail: 359295772@qq.com

閔凡貴(1980.2-)，男，碩士，副研究員，研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)研究。E-mail: minfangui@aliyun.com