王 晶，丁少楨，胡 翠，胡 靜，劉曉昌，梅 俏，許建明

(安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，安徽 合肥 230022)

◇研究簡報◇

同型半胱氨酸對實驗性結(jié)腸炎模型中COX-2及5-LOX表達的影響

王 晶，丁少楨，胡 翠，胡 靜，劉曉昌，梅 俏，許建明

(安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，安徽 合肥 230022)

梅 俏(1971-)，男，博士，教授，碩士生導師，研究方向：炎癥性腸病，通訊作者，E-mail：meiqiao@hotmail.com

同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)是一種含巰基氨基酸，是甲硫氨酸去甲基化過程中的產(chǎn)物，可通過多種途徑促發(fā)炎癥反應(yīng)，啟動由細胞免疫所介導的局部和全身慢性炎癥。研究發(fā)現(xiàn)[1]，Hcy可激活核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)，導致多種炎癥基因轉(zhuǎn)錄，參與炎癥的發(fā)生。炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是一種慢性非特異性腸道炎癥性疾病，發(fā)病機制目前尚未完全明確。研究發(fā)現(xiàn)，IBD患者腸黏膜中，經(jīng)由5-脂氧合酶(5-lipoxygenase，5-LOX)代謝合成白三烯(leukotrienes，LTs)和環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)代謝合成前列腺素(prostaglandins，PGs)的量升高。腸黏膜發(fā)生炎癥時，由COX-2合成的PGE2引發(fā)血管擴張、黏膜充血水腫及滲透性增加。5-LOX可以調(diào)節(jié)炎癥細胞的遷移浸潤，促進炎癥介質(zhì)產(chǎn)生，增加腸黏膜通透性[2]。在對關(guān)節(jié)炎大鼠模型研究中發(fā)現(xiàn)，抗關(guān)節(jié)炎藥物通過抑制NF-κB信號通路，下調(diào)5-LOX和COX-2基因表達，導致LTB4和PGE2合成減少，減輕關(guān)節(jié)炎癥[3]，提示5-LOX和COX-2受到NF-κB的調(diào)控。另外，我們發(fā)現(xiàn)IBD患者結(jié)腸黏膜中Hcy濃度明顯升高[4]，且Hcy會進一步加重結(jié)腸炎癥的病理損傷，但Hcy對IBD腸黏膜炎癥損傷的具體機制尚不明確。因此，本研究擬建立高Hcy特征的實驗性結(jié)腸炎大鼠模型，探討Hcy是否通過促進NF-κB的表達，調(diào)控5-LOX、COX-2合成LTs和PGE2水平增加，加重結(jié)腸炎癥。

1 材料

1.1實驗動物與試劑SD大鼠，SPF級，♂，體質(zhì)量(200±20)g，實驗動物許可證號：34000200000480，由安徽省實驗動物中心提供。三硝基苯磺酸(TNBS)、DL-Hcy均購于美國Sigma公司；LTs及PGE2試劑盒購于武漢新啟迪生物科技公司。

1.2方法

1.2.1實驗分組 大鼠分為4組，每組8只，在室溫、光周期12 h ∶12 h條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后使用。A組(正常對照組)：生理鹽水灌腸+生理鹽水皮下注射；B組(TNBS模型組)：TNBS/乙醇溶液灌腸+生理鹽水皮下注射；C組(正常對照+Hcy注射組)：生理鹽水灌腸+Hcy皮下注射；D組(TNBS模型+Hcy注射組)：TNBS/乙醇溶液灌腸+Hcy皮下注射。

1.2.2高Hcy血癥模型的制備和給藥方法 參照文獻[5]，采用10%水合氯醛進行腹腔注射，經(jīng)肛門將橡膠管插入大鼠結(jié)腸內(nèi)，長度約8 cm，注入(1 ∶1)乙醇溶解的TNBS(100 mg·kg-1)溶液。對照組灌腸等體積生理鹽水。DL-Hcy溶解于生理鹽水，滴定pH至7.4，參照文獻劑量[6]，自TNBS模型制備后d 1起，皮下注射Hcy(0.03 μmol·kg-1)，每天2次，間隔8 h，連續(xù)30 d。對照組皮下注射等體積生理鹽水。

1.2.3標本采集 10%水合氯醛腹腔注射麻醉，切取遠端結(jié)腸8 cm左右，沿縱軸剪開腸管，冰生理鹽水沖洗干凈后，取部分結(jié)腸進行檢測。

1.2.4ELISA法檢測大鼠結(jié)腸勻漿LTs(LTB4、LTC4、LTD4、LTE4)及PGE2水平 取病變結(jié)腸組織，制備成勻漿，采用ELISA雙抗夾心法檢測其中LTs(LTB4、LTC4、LTD4、LTE4)、PGE2的水平。

1.2.5RT-qPCR法檢測結(jié)腸黏膜組織5-LOX、COX-2及NF-κB mRNA表達 提取結(jié)腸黏膜組織mRNA，取出基因組DNA，合成cDNA后，按照試劑盒說明書進行加樣：95℃ 5 min，95℃ 10 s，60℃ 30 s退火，72℃延伸，40個循環(huán)。分析方法：relative quantification study，分析指標為：2-ΔΔCt。5-LOX引物序列：Forward primer: 5′-AGTTGCCTAAGAAGCTCCCA-3′； Reverse primer：5′-GCATCAATGCCATCCAGTAG -3′； 產(chǎn)物長度：133 bp。COX-2引物序列：Forward primer：5′-AATCGCTGTACAAGCAGTGG-3′；Reverse primer：5′-GCAGCCATTTCTTTCTCTCC-3′；產(chǎn)物長度：144 bp。NF-κB 引物序列：Forward primer：5′-GCCTCATCCACATGAACTTG-3′；Reverse primer：5′-CGCTTCTTCACACACTGGAT-3′；產(chǎn)物長度：120 bp。

Tab 1 Effects of Hcy on LTB4，LTC4，LTD4，LTE4 and PGE2 levels in colonic homogenate of experimental colitis rats(±s，n=8)

*P<0.05vsnormal;#P<0.05vsTNBS/ethanol group

2 結(jié)果

2.1Hcy對結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸勻漿中LTs和PGE2水平的影響如Tab 1所示，與正常對照組比較，TNBS模型組及正常對照組+Hcy注射組大鼠結(jié)腸勻漿中LTs(LTB4、LTC4、LTD4、LTE4)及PGE2水平升高(P<0.05)。與TNBS模型組比較，TNBS模型+Hcy注射組大鼠結(jié)腸勻漿中LTs(LTB4、LTC4、LTD4、LTE4)及PGE2水平明顯升高(P<0.05)，提示Hcy引起腸道炎癥介質(zhì)水平的升高。

2.2Hcy對結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜中5-LOX、COX-2及NF-κBmRNA表達的影響如Tab 2所示，與正常對照組相比，TNBS模型組大鼠結(jié)腸黏膜組織5-LOX、COX-2、NF-κB mRNA的表達增加。與TNBS模型組相比，TNBS模型+Hcy注射組大鼠結(jié)腸黏膜組織5-LOX、COX-2、NF-κB mRNA的表達明顯增加(P<0.05)，提示Hcy可能通過調(diào)控NF-κB信號通路，促進5-LOX、COX-2的表達，加重腸道炎癥的發(fā)生。

Tab 2 Effects of Hcy on mRNA expressionof 5-LOX, COX-2 and NF-κB in colonic mucosaof experimental colitis rats(±s，n=8)

*P<0.05vsnormal;#P<0.05vsTNBS/ethanol

3 討論

本研究通過制備大鼠高Hcy血癥實驗性結(jié)腸炎模型，發(fā)現(xiàn)與正常對照組比較，Hcy注射組和TNBS模型組兩組大鼠結(jié)腸勻漿中的LTs和PGE2的水平均升高，大鼠結(jié)腸黏膜組織5-LOX、COX-2、NF-κB的mRNA表達升高，提示Hcy可能通過對COX-2、5-LOX、NF-κB mRNA表達的調(diào)節(jié)，引起LTs和PGE2的升高，促進腸道炎癥損傷。因此，通過降低IBD患者體內(nèi)Hcy水平，有助于減輕炎癥損傷，但是Hcy調(diào)節(jié)COX-2、5-LOX及NF-κB途徑的具體機制目前尚不明確，有待進一步的研究。

[1] Lazzerini P E, Selvi E, Lorenzini S, et al. Homocysteine enhances cytokine production in cultured synoviocytes from rheumatoid arthritis patients[J].ClinExpRheumatol, 2006,24(4): 387-93.

[2] Jupp J, Hillier K, Elliott D H, et al. Colonic expression of leukotriene-pathway enzymes in inflammatory bowel diseases[J].InflammBowelDis, 2007,13(5): 537-46.

[3] Zhang X, Ito Y, Liang J, et al. Therapeutic effects of total steroid saponin extracts from the rhizome of Dioscorea zingiberensis CH Wright in Freund′s complete adjuvant induced arthritis in rats[J].IntImmunopharmacol, 2014,23(2): 407-16.

[4] 丁少楨, 丁 浩, 梅 俏, 等. 同型半胱氨酸調(diào)控 MEK-ERK-MLCK 通路影響結(jié)腸炎大鼠腸黏膜通透性的實驗研究[J]. 中國藥理學通報, 2016,32(4): 498-502.

[4] Ding S Z, Ding H, Mei Q, et al. Effect of homocysteine on the intestinal permeability by regulating ERK-MLCK signal transduction in experimental colitis rats[J].ChinPharmacolBull, 2016,32(4):498-502.

[5] Morris G P, Beck P L, Herridge M S, et al. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon[J].Gastroenterology, 1989,96(3): 795-803.

[6] Scherer E B S, da Cunha A A, Kolling J, et al. Development of an animal model for chronic mild hyperhomocysteinemia and its response to oxidative damage[J].IntJDevNeurosci, 2011,29(7): 693-9.

EffectsofhomocysteineonexpressionofCOX-2and5-LOXinexperimentalcolitsratmodel

WANG Jing, DING Shao-zhen, HU Cui, HU Jing, LIU Xiao-chang, MEI Qiao, XU Jian-ming

(DeptofGastroenterology,theFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230022,China)

同型半胱氨酸；炎癥性腸病；環(huán)氧合酶-2；5-脂氧合酶；核轉(zhuǎn)錄因子-κB；白三烯；前列腺素E2

homocysteine; inflammatory bowel disease；cyclooxygenase-2；5-lipoxygenase；nuclear factor kappa B；leukotrienes；prostaglandin E2

A

1001-1978(2017)11-1627-02

R-332；R322.45；R363-332；R574.62；R977.4；R977.3；R977.6

時間：2017-10-10 10:05 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20171010.1005.058.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.11.029

2017-06-21，

2017-07-26

國家自然科學基金資助項目(No 81470809)

王 晶(1992-)，女，碩士生，研究方向：炎癥性腸病，E-mial：1653198369@qq.com；