于之清，童 武，鄭 浩，李國(guó)新，高 飛，王 濤，梁 超，葉 超，武吉強(qiáng)，黃勤峰，童光志

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241）

使用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建新型重組偽狂犬病毒疫苗的初步研究

于之清，童 武，鄭 浩，李國(guó)新，高 飛，王 濤，梁 超，葉 超，武吉強(qiáng)，黃勤峰，童光志

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241）

本研究使用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)結(jié)合同源重組，以偽狂犬病毒經(jīng)典疫苗株Bartha-K61為骨架，將其gB基因替換為偽狂犬病毒變異株JS-2012的gB基因，經(jīng)噬斑純化、PCR篩選鑒定，獲得重組病毒rPRV-BJB。體外生物學(xué)特性分析結(jié)果顯示，重組病毒株rPRV-BJB與疫苗株Bartha-K61具有相似的生長(zhǎng)特性和噬斑形態(tài)，可作為新型重組偽狂犬病病毒疫苗候選株。

變異偽狂犬病毒；CRISPR/Cas9；重組病毒；gB基因

Abstract:In this study, we utilized the speci fi c CRISPR/Cas9 gene editing system combined with homologous recombination to replace the gB of Bartha-K61 strain with that of JS-2012 strain. After several rounds plaque purification and PCR-screening, the acquired recombinant virus was identified by sequencing and designated as rPRV-BJB. rPRV-BJB and Bartha-K61 showed similar biological characteristics in vitro, indicating that rPRV-BJB is a promising PRV vaccine candidate that can be performed in following protective ef fi cacy evaluation.

Key words:PRV variant; CRISPR/Cas9；recombinant virus；gB gene

偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）屬于α皰疹病毒亞科（Alphaherpesvirinae），可感染不同年齡段的豬，以種豬繁殖障礙、育肥豬生長(zhǎng)緩慢、哺乳仔豬高死亡率為特征。自2011年以來，我國(guó)許多Bartha-K61免疫豬場(chǎng)爆發(fā)偽狂犬病，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。國(guó)內(nèi)多份研究表明，本次偽狂犬病爆發(fā)是由偽狂犬病毒變異株引起的，且變異毒株主要保護(hù)性抗原基因的核苷酸序列出現(xiàn)了多處變異[1,2]。研制新型偽狂犬病病毒疫苗株，控制變異偽狂犬病的流行成為當(dāng)務(wù)之急。

PRV有11種囊膜糖蛋白，其中糖蛋白B（gB）[3-6]、糖蛋白C（gC）[7,8]和糖蛋白D（gD）[9]能夠有效激發(fā)體內(nèi)免疫保護(hù)反應(yīng)，刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體[10,11]。研究表明，gB能夠有效激發(fā)體內(nèi)體液免疫和細(xì)胞免疫，且能夠針對(duì)PRV致死性攻擊為易感動(dòng)物提供有效免疫保護(hù)[5,12,13]。序列分析發(fā)現(xiàn)當(dāng)前流行的偽狂犬病毒變異株JS-2012的gB基因與經(jīng)典疫苗株Bartha-K61差異較大。那么，若以Bartha-K61毒株為骨架，將其gB基因替換為PRV變異株的gB基因，所獲重組病毒是否能針對(duì)變異PRV為易感動(dòng)物提供有效的免疫保護(hù)？

然而，PRV是DNA病毒，基因組龐大且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，GC含量高達(dá)73%，如何對(duì)其基因組進(jìn)行高效精準(zhǔn)的操作一直是待解決的難題。近年來，隨著人們對(duì)CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）的認(rèn)識(shí)逐漸加深，多種CRISPR/Cas9突變體以及商品化CRISPR/Cas9已成為病毒基因組編輯以及病毒致病機(jī)理研究的有力工具[14]。

本研究以經(jīng)典疫苗株 Bartha-K61為基礎(chǔ)，使用CRISPR/Cas9技術(shù)結(jié)合同源重組，將其gB 基因替換為PRV變異株 JS-2012的gB基因，獲得重組病毒rPRV-BJB。rPRV-BJB株可作為新型重組偽狂犬病病毒疫苗候選株，為防控變異偽狂犬病的流行奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞、病毒和質(zhì)粒PK-15細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；PRV JS-2012（GenBank登錄號(hào)：KP257591.1）變異株于2012年由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所分離自江蘇豬場(chǎng)，且該毒株由本實(shí)驗(yàn)室保存；PRV Bartha-K61（GenBank登錄號(hào)：JF797217.1）來自于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所的中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏中心。pCR?-Blunt II- TOPO?購(gòu)自Invitrogen；lentiCRISPRv1來自張峰實(shí)驗(yàn)室[15,16]；大腸桿菌TOPO10感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京天根生物技術(shù)公司。

1.2 主要試劑和儀器FBS、DMEM以及EDTA-胰酶均購(gòu)自Gibco公司；T4 DNA 連接酶、限制性內(nèi)切酶購(gòu)自 NEB 公司；PCR 所用高保真DNA聚合酶PrimeSTAR? HS DNA Polymerase以及LA Taq?with GC Buffer購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；AxyPrep DNA 片段回收試劑盒購(gòu)自AxyGEN公司；質(zhì)粒提取試劑盒Miniprep購(gòu)自Qiagen公司；AXYPREP DNA GEL EXTRACTION KIT；酚氯仿、蛋白酶 K、RNase與低熔點(diǎn)瓊脂糖購(gòu)自Sigma公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofactamine 3000購(gòu)自Invitrogen 公司。

1.3 重組病毒構(gòu)建設(shè)計(jì)原理根據(jù)Bartha-K61 gB基因序列，設(shè)計(jì)合成特異靶向Bartha-K61 gB基因的指導(dǎo) RNA 序列，構(gòu)建識(shí)別并剪切Bartha-K61 gB的CRISPR/Cas9質(zhì)粒pCas9-Bar-gB1和 pCas9-BargB2。擴(kuò)增Bartha-K61 gB基因兩側(cè)區(qū)域DNA片段作為左右重組臂，中間插入PRV變異株JS-2012 gB基因，構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移載體pT-Bar-JSgB。將Bartha-K61基因組、pCas9-Bar-gB1、pCas9-BargB2和pT-Bar-JSgB共轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，拯救的重組病毒命名為rPRV-BJB。

1.4 CRISPR/Cas9質(zhì)粒構(gòu)建根據(jù) PRV Bartha-K61株（GenBank登錄號(hào)：JF797217.1）的基因組序列，使用 CRISPR/sgRNA工具 Blue Heron Biotechnology. https∶//wwws.blueheronbio.com/external/tools/gRNASrc.jsp進(jìn)行sgRNA設(shè)計(jì)，共設(shè)計(jì)了2條sgRNA，合成其互補(bǔ)引物對(duì)（表1），分別靶向Bartha-K61 gB基因的5'端和3'端區(qū)域。參照lentiCRISPRv1質(zhì)粒的構(gòu)建說明書，利用磷酸化酶（T4 PNK）對(duì)互補(bǔ)的gB-gRNA引物gB1-sgRNA-F/gB1-sgRNA-R和gB2-sgRNA-F/gB2-sgRNA-R進(jìn)行退火磷酸化反應(yīng)后，高溫（95℃ 5 min）對(duì) T4 PNK滅活和引物變性，然后逐步降溫復(fù)性使引物互補(bǔ)形成雙鏈，獲得2條雙鏈gB-gRNA DNA。以BsmBI酶切pCRISPR/Cas9 載體，膠回收大的載體片段。利用T4 DNA連接酶將2條雙鏈gB-gRNA DNA分別連入上述BsmBI 酶切回收的載體中，轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)，提取質(zhì)粒，以NotI和BamHI 雙酶切鑒定，并將酶切陽性克隆進(jìn)行測(cè)序分析。獲得克隆質(zhì)粒pCas9-BargB1和pCas9-Bar-gB2。

表1 靶向Bartha-K61基因組的CRISPR/Cas9 sgRNA序列Table 1 Sequences of sgRNAs target Bartha-K61 genome

1.5 同源重組供體質(zhì)粒構(gòu)建根據(jù) PRV Bartha-K61株（GenBank登錄號(hào)：JF797217.1）基因組序列以及PRV變異株JS-2012（GenBank登錄號(hào)：KP257591.1）的基因組序列，用 Olio6.0 軟件設(shè)計(jì)了3對(duì)引物dpLF/dpLR、dpRF/dpRR和dpgBF/dpgBR（見表2）。利用dpLF/dpLR與dpRF/dpRR 2對(duì)引物，以 PRV Bartha-K61 病毒基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得Bartha-K61 基因上游 UL46 部分區(qū)域?yàn)橥醋蟊郏˙ar-L-arm）和gB基因下游UL28 部分區(qū)域?yàn)橥从冶郏˙ar-R-arm）的片段。利用引物 dpgBF/ dpgBR，以PRV JS-2012病毒基因組DNA為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增JS-2012 gB基因片段JS-gB-DNA。以dpLF/dpgBR為引物、以回收得到的Bar-L-arm與gB-DNA 片段為模板進(jìn)行Overlap PCR擴(kuò)增，獲得片段Bar-L-arm-JS-gB。以dpgBF/dpRR為引物、以回收得到的Bar-R-arm 與gB-DNA為模板進(jìn)行OverLap PCR擴(kuò)增，獲得片段JS-gB-Bar-R-arm。將膠回收的Bar-L-arm-JS-gB和JS-gB-Bar-R-arm分別連入pCR?-Blunt II- TOPO?載體。轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌TOP10，獲得陽性質(zhì)粒pBar-L-JSgB和pJSgB-Bar-R。將上述陽性質(zhì)粒分別以NheI和BamHI進(jìn)行雙酶切反應(yīng)。膠回收產(chǎn)物使用T4連接酶連接。4℃連接過夜后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌TOP10，獲得陽性供體質(zhì)粒，命名為pT-Bar-JSgB。

1.6 重組病毒的拯救以1 MOI的劑量分別接種PRV Bartha-K61株于 PK-15細(xì)胞上，待細(xì)胞出現(xiàn)約70%病變時(shí)，棄去培養(yǎng)基，刮取細(xì)胞，使用酚氯仿法提取總基因組DNA。使用Lipofectamine? 3000 Transfection Reagent（Thermo Fisher）轉(zhuǎn)染試劑，將上述1 μg 供體質(zhì)粒pT-Bar-JSgB、1 μg pCas9-gB1、1 μg pCas9- gB2和2 μg 病毒基因組共轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后每天觀察病變情況。當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)大約80 %病變時(shí)，收取上清，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 重組病毒的篩選純化將1.6收取的上清分別接種6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的PK-15細(xì)胞，1 h后，棄去上清，覆蓋含有2% FBS和1%低熔點(diǎn)瓊脂糖的MEM，室溫凝固后，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。60 h后，挑取單個(gè)噬斑，吹打入500 μL DMEM，放入-80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。取上?0 μL病毒空斑溶液接種PK-15細(xì)胞，待細(xì)胞全部病變后，收取上清，提取病毒基因組。使用引物 screening-F（5'-CTCGA GGGACGCCTCCGCGGAGACGT-3'）/screening-R（5'-CATCGACGGGCTGCTCGTGGGCGGCT GC-3'）進(jìn)行PCR鑒定，PCR陽性病毒液進(jìn)行下一輪噬斑純化。經(jīng)過3輪噬斑純化結(jié)合PCR篩選的陽性毒株進(jìn)行測(cè)序分析。

表2 重組病毒供體質(zhì)粒構(gòu)建所需引物Table 2 The sequence of primers that utilized to construct donor plasmids

1.8 病毒生長(zhǎng)曲線的繪制待T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的PK-15細(xì)胞長(zhǎng)至單層，將篩選到的重組病毒rPRVBJB株和疫苗 Bartha-K61株分別以1 MOI 感染劑量感染PK-15細(xì)胞。病毒感染細(xì)胞1 h后，棄去病毒液，并用PBS緩沖液清洗2遍后，每個(gè)T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入5 mL 含有2%FBS的DMEM培養(yǎng)基。在感染后每隔4 h收取300 μL細(xì)胞上清液進(jìn)行病毒滴度測(cè)定，同時(shí)補(bǔ)加300 μL 2% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基，直至感染后36 h，細(xì)胞呈現(xiàn)完全病變且大范圍脫落。根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)病毒滴度（TCID50/mL）繪制病毒一步生長(zhǎng)曲線。

1.9 空斑形成試驗(yàn)待Vero細(xì)胞于6孔板中長(zhǎng)至單層，將重組病毒株rPRV-BJB和疫苗株Bartha-K61株 10倍梯度稀釋后接種6孔板中的單層Vero細(xì)胞，每孔接500 μL，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育1 h加入覆蓋層，覆蓋層為2 % FBS、1%（w/v）低熔點(diǎn)瓊脂糖的MEM。37℃培養(yǎng) 60 h 后，小心去除6孔板中的半固體覆蓋層，用5% （W/V）結(jié)晶紫染色。

2 結(jié)果

2.1 CRISPR/Cas9的構(gòu)建將合成的sgRNA片段連接入pLentiCRISPRv1中，構(gòu)建插入sgRNA的CRISPR/Cas9質(zhì)粒pCas9-Bar-gB1和pCas9-Bar-gB2（圖1）。結(jié)果顯示，pCas9-Bar-gB1中含有sgRNA序列CGTGCGTGTCATCGTGGTCG，pCas9-Bar-gB2中含有sgRNA序列CAGCTCGCGGATATATCGCC。

圖1 pCas9-Bar-gB1和pCas9-Bar-gB2測(cè)序鑒定Fig. 1 Identi fi cation of pCas9-Bar-gB1 and pCas9-Bar-gB2 by sequencing

2.2 供體質(zhì)粒的構(gòu)建PCR擴(kuò)增獲得同源重組左臂（Bar-L-arm）、同源重組右臂（Bar-R-arm）及gB基因片段（JS-gB-DNA）（圖 2A），經(jīng)OverLap PCR獲得拼接DNA片段Bar-L-arm-JS-gB和JS-gBBar-R-arm（圖2B）。將PCR產(chǎn)物連接 pCR?-Blunt II- TOPO? 載體經(jīng)測(cè)序鑒定，獲得質(zhì)粒pBar-L-JSgB和pJSgB-Bar-R。兩質(zhì)粒進(jìn)行片段拼接后，經(jīng)NheI和EcoRI雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后如圖2C所示，陽性供體質(zhì)粒稱之為pT-Bar-JSgB（pTJSB）。

2.3 重組病毒的篩選純化將疫苗株Bartha-K61基因組、供體質(zhì)粒pT-Bar-JSgB、sgRNA質(zhì)粒pCas9-Bar-gB1和pCas9-Bar-gB2共轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，收獲病變細(xì)胞上清進(jìn)行噬斑純化，單噬斑病毒再以PCR方法篩選陽性病毒克隆。如圖3所示，重組陽性病毒經(jīng)PCR擴(kuò)出一條1200 bp的目的條帶，而疫苗株Bartha-K61基因組不能擴(kuò)增出條帶（圖3A）。將獲得的陽性克隆病毒再進(jìn)行噬斑純化結(jié)合PCR鑒定，經(jīng)過3輪噬斑純化，PCR鑒定結(jié)果顯示，所有鑒定的克隆均擴(kuò)增出目的條帶，均為陽性克?。▓D3B）。對(duì)PCR陽性毒株的基因組進(jìn)行序列分析，結(jié)果顯示，gB核苷酸差異位點(diǎn)為特異性單峰且與變異株JS-2012的序列一致（圖4），表明成功篩選到重組病毒rPRV-BJB。

2.4 重組病毒的生物學(xué)特性通過繪制一步生長(zhǎng)曲線和噬斑形態(tài)來比較分析重組病毒rPRV-BJB和疫苗株Bartha-K61的體外生物學(xué)特性。一步生長(zhǎng)曲線中，Bartha-K61 與 rPRV-BJB 相比，兩者的病毒復(fù)制速率以及最終效價(jià)無顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖5。rPRV-BJB和Bartha-K61均在感染后復(fù)制速率較快，在感染后20 h 進(jìn)入復(fù)制平臺(tái)期，最終效價(jià)均可達(dá)到108TCID50/mL。另外，從病毒噬斑形態(tài)和大小上來分析，重組病毒株rPRV-BJB與疫苗株Bartha-K61的空斑形態(tài)較為相似，病毒噬斑均呈散落圓點(diǎn)狀，邊緣清晰，且兩者以相同劑量接種 Vero 細(xì)胞后在相同面積下形成的單個(gè)噬斑分布均勻，噬斑數(shù)量也較為相近，如圖6所示。這表明重組病毒株rPRV-BJB與疫苗株Bartha-K61具有較為相似的體外生物學(xué)特性，gB替換沒有顯著影響病毒的生物學(xué)特性。

圖2 供體質(zhì)粒的構(gòu)建Fig. 2 Construction of donor plasmid

3 討論

自20世紀(jì)70年代Bartha-K61疫苗株引入我國(guó)以來，廣泛應(yīng)用該疫苗使 PR 得到了有效控制[17,18]，但2011年末，豬偽狂犬病在我國(guó)大規(guī)模爆發(fā)。研究表明，當(dāng)前流行的PRV變異毒株發(fā)生了抗原變異，且經(jīng)典疫苗株Bartha-K61不能針對(duì)變異偽狂犬病毒為豬群提供完全免疫保護(hù)[1,19-21]。本研究提供了疫苗株一種新型重組偽狂犬病病毒疫苗的構(gòu)建策略，以Bartha-K61為骨架，使用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)結(jié)合同源重組，將其gB基因全部替換為JS-2012的gB 基因，獲得重組PRV疫苗候選株rPRV-BJB，可用于疫苗免疫保護(hù)效力評(píng)價(jià)，利于我國(guó)PRV變異毒株的流行防控。

高效的基因編輯技術(shù)以及精準(zhǔn)簡(jiǎn)便的基因操作策略是構(gòu)建 PRV 重組病毒的必要手段。CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)在病毒基因編輯中應(yīng)用日漸廣泛，如對(duì)病毒基因組進(jìn)行缺失構(gòu)建缺失疫苗等。已有研究使用 CRISPR/Cas9 技術(shù)對(duì) PRV 基因組進(jìn)行基因缺失[22]，但仍未有研究報(bào)道使用該技術(shù)直接對(duì)病毒基因進(jìn)行大片段替換編輯，特別是對(duì)病毒的必需基因直接進(jìn)行基因編輯。在此，我們使用 CRISPR/Cas9 結(jié)合同源重組技術(shù)直接對(duì) PRV gB 基因進(jìn)行大片段替換，并提供了一種簡(jiǎn)單高效的重組病毒篩選方法，擴(kuò)寬了該技術(shù)在大病毒基因組的應(yīng)用可能性，從而推動(dòng)病毒的基礎(chǔ)研究。

圖3 重組病毒株rPRV-BJB的 PCR 初步篩選Fig. 3 The PCR-based method for screening rPRV-BJB

圖4 純化的重組病毒株rPRV-BJB gB基因區(qū)域序列分析（部分區(qū)域）Fig. 4 Sequence analysis of the puri fi ed recombinant viruses in gB gene region

圖5 重組病毒rPRV-BJB與疫苗株Bartha-K61的一步生長(zhǎng)曲線Fig. 5 One-step growth curves of rPRV-BJB and Bartha-K61

圖6 重組病毒rPRV-BJB與疫苗株Bartha-K61的噬斑形態(tài)比較Fig. 6 The morphology of plaque-form between the recombinant virus and parental virus

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PRELIMINARY STUDY ON UTILIZING CRISPR/CAS9 TO CONSTRUCT NEW RECOMBINANT PSEUDORABIES VARIANT VACCINE

YU Zhi-qing, TONG Wu, ZHENG Hao, LI Guo-xin, GAO Fei, WANG Tao, LIANG Chao, YE Chao, WU Ji-qiang, HUANG Qin-feng, TONG Guang-zhi

(Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

S852.659.1

A

1674-6422（2017）04-0006-07

2017-04-14

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2016YFD0500100）

于之清，女，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

童光志，E-mail：gztong@shvri.ac.cn