理性設計定點突變提高Streptomyces kathirae SC-1酪氨酸酶熱穩(wěn)定性

郭 靜 ， 饒志明 *， 楊套偉 ， 滿在偉 ， 張 顯 ， 徐美娟 ， 李 星

（1.江南大學 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122；2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122）

理性設計定點突變提高Streptomyces kathirae SC-1酪氨酸酶熱穩(wěn)定性

郭 靜1，2， 饒志明*1，2， 楊套偉1，2， 滿在偉1，2， 張 顯1，2， 徐美娟1，2， 李 星1，2

（1.江南大學 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122；2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122）

利用SWISS-MODEL在線服務器以栗色渾圓鏈霉菌 （Streptomyces castaneoglobisporus）酪氨酸酶（PDB登錄號：2AHL）為模板對S.kathirae酪氨酸酶的3-D結(jié)構(gòu)進行同源模擬。使用在線預測軟件PoPMuSiC-2.1計算酪氨酸酶每個突變氨基酸的去折疊自由能變化（ΔΔG）來輔助設計提高酪氨酸酶的穩(wěn)定性，利用定點突變構(gòu)建突變體，并且在大腸桿菌中對野生型酪氨酸酶及突變體進行表達，最終獲得了兩個熱穩(wěn)定性提高的突變體R95Y、G123W。在此基礎上進行復合突變，獲得了一個熱穩(wěn)定性顯著提高的突變體R95Y/G123W。該突變體在60℃的半衰期提高了2.43倍，最適反應溫度由45℃提高到50℃，本研究所用的基于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的理性設計提高穩(wěn)定性的策略也可以應用于其他工業(yè)酶類，顯示了良好的應用前景。

酪氨酸酶；氫鍵；定點突變；熱穩(wěn)定性；理性設計；POPMuSiC

酪氨酸酶 （EC 1.14.18.1）是一種典型的3型含雙銅離子的金屬酶[1]，是一種重要的雙功能酶，能催化一元酚生成二元酚 （單酚酶活性）；催化二元酚生成相應的醌（二元酚酶活性），醌在非酶催化的氧化還原反應中最終生成黑色素[2-3]。酪氨酸酶廣泛的存在于動植物及微生物中[4-8]，而不同來源的酪氨酸酶的基因結(jié)構(gòu)也有所不同[9]，其中鏈霉菌酪氨酸酶的表達依賴于melC操縱子，melC操縱子包含兩個基因：melC1編碼酪氨酸酶金屬伴侶，作用是幫助酪氨酸酶原成熟、轉(zhuǎn)運銅離子及將成熟的酪氨酸酶分泌至細胞外[10-11]；melC2編碼酪氨酸酶。

酪氨酸酶作為一種重要的生物酶，被廣泛的應用于合成左旋多巴、黑色素、R-亞砜，去除水污染中的酚類化合物以及作為高效的生物傳感器[12]。通常酶類在高溫下有較高的酶活，而在低溫下較穩(wěn)定，這將不利于獲得較高的催化效率，因此，高活性及穩(wěn)定性的酶將作為工業(yè)應用的首選。目前有兩種方法獲得催化性能優(yōu)良的工業(yè)酶：在極端環(huán)境篩選新酶的生產(chǎn)菌株，但是這種方法費時費力，效率低下；另一種方法是通過蛋白質(zhì)工程改良現(xiàn)有的酶類，這種方法效率高，節(jié)省時間，收效明顯。目前蛋白質(zhì)工程與以計算機模擬蛋白質(zhì)模型為基礎的理性設計相結(jié)合，已經(jīng)在很多工業(yè)酶類上得到應用，完善了蛋白質(zhì)工程，使這種方法更加合理、高效[13-15]。蛋白質(zhì)由氨基酸組成，而氨基酸通過氫鍵、疏水鍵、鹽鍵、范德華力等作用力折疊構(gòu)成蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)，通常使用蛋白質(zhì)的去折疊自由能（ΔG）來表征蛋白熱動力學穩(wěn)定性，蛋白質(zhì)的去折疊自由能越高，破壞蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)所需的能量越多，蛋白質(zhì)越穩(wěn)定，而蛋白質(zhì)的去折疊自由能越低，破壞蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)所需的能量越少，蛋白質(zhì)越不穩(wěn)定。POPMuSiC （http：//dezyme.com/）在線服務器通過基于突變氨基酸溶劑可及性的線性組合系數(shù)，預測出每個突變氨基酸對蛋白質(zhì)去折疊自由能的影響，進而找到那些對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性起關鍵作用的氨基酸，這種方法預測蛋白質(zhì)穩(wěn)定性變化十分迅速，可以在1 min之內(nèi)預測出所有氨基酸突變點的自由能變化，并給出一份突變氨基酸自由能變化的列表，方便選擇那些有利的突變點[16]。目前，POPMuSiC已被廣泛的應用于提高酶穩(wěn)定性研究。例如Zhang等利用POPMuSiC計算自由能變化，獲得了半衰期提高9.6倍的脂酶突變體[17]；而劉龍等通過POPMuSiC計算自由能變化，在堿性淀粉酶中引入了3對二硫鍵。使突變體在高溫下的半衰期提高了6倍，同時使其最適溫度提高了5℃[18]。

Streptomyces kathirae SC-1是作者所在實驗室前期篩選獲得的黑色素高產(chǎn)菌株[19]，在發(fā)酵產(chǎn)黑色素的過程中，我們發(fā)現(xiàn)酪氨酸酶的穩(wěn)定性差，這將限制黑色素的產(chǎn)量，因此，作者以在線軟件預測酪氨酸酶穩(wěn)定性為基礎，采用定點突變技術，獲得熱穩(wěn)定性提高的酪氨酸酶突變體。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基

鏈霉菌S.kathirae SC-1：作者所在實驗室篩選獲得的黑色素高產(chǎn)菌株，目前保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為M2012432；大腸桿菌E.coli JM109和 E.coli BL21：美國Novagen公司；重組質(zhì)粒pET-melC1NC2：作者所在實驗室前期構(gòu)建和保存，該質(zhì)粒共表達酪氨酸酶金屬伴侶及酪氨酸酶，酪氨酸酶金屬伴侶不含組氨酸標簽，酪氨酸酶含組氨酸標簽。

LB 培養(yǎng)基 （g/L）：Tryptone 10、Yeast Extract 5、NaCl 10、瓊脂 20（固體培養(yǎng)基添加）。

1.2 工具酶、引物和試劑

限制性內(nèi)切酶DpnI、Prime star HS DNA聚合酶、蛋白質(zhì)Marker：大連Takara公司；SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒：上海生物工程有限公司；其他試劑均為國藥有限公司；本研究所用PCR引物均由上海生物工程有限公司合成，見表1。

表1 PCR擴增引物Table 1 Primers for PCR amplification

1.3 主要儀器

核酸電泳系統(tǒng)：北京六一廠；UVP凝膠丞相儀：英國UVP有限公司；大型冷凍離心機3K-15，小型離心機1-14：德國Sigma公司；VC130超聲破碎儀：美國SONICS公司；紫外分光光度儀UV-2000：尤尼科（上海）儀器有限公司；隔水式恒溫培養(yǎng)箱，立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實業(yè)有限公司；AKTA蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)：美國GE公司醫(yī)療集團。

1.4 同源建模

將S.kathirae酪氨酸酶蛋白序列提交至SWISS-MODEL進行同源建模，同源搜索對比表明，該酪氨酸酶與S.castaneoglobisporus的酪氨酸酶（PDB 登錄號：2AHL）同源性最高（84%），以該酪氨酸酶為模板進行同源建模。

1.5 突變位點的選擇

將S.kathirae酪氨酸酶3-D結(jié)構(gòu)提交至POPMuSiC在線服務器，預測計算酪氨酸酶每個突變氨基酸的去折疊自由能變化（ΔΔG），選擇去折疊自由能變化顯著的氨基酸作為突變位點。

1.6 定點突變及構(gòu)建重組菌株

使用PCR定點突變法即DpnI法進行定點突變[20]。以作者保存的pET-melC1NC2質(zhì)粒為模板，以相應突變位點上下游引物為引物進行PCR反應（注意模板質(zhì)粒只能以從E.coli甲基化陽性的菌株中提取）。PCR反應條件為：97℃ 5 min，之后，97℃ 45 s，67 ℃ 45 s，72 ℃ 10 min，共 30 個循環(huán)，PCR 產(chǎn)物使用DpnI限制性內(nèi)切酶消化2 h，回收后直接轉(zhuǎn)化E.coli JM109，抗性平板挑選轉(zhuǎn)化子，將陽性轉(zhuǎn)化子送至上海生物工程有限公司進行測序，將測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli BL21中。復合突變的操作步驟同上，將PCR質(zhì)粒模板替換成其中的一個突變質(zhì)粒即可。

1.7 酪氨酸酶基因在E.coli BL21（DE3）中的表達

將重組菌株接種于含有卡那霉素 （50 μg/mL）的LB培養(yǎng)基中，37℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，按照2%的接種體積分數(shù)轉(zhuǎn)接于50 mL的抗性LB培養(yǎng)基中，37℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8時，添加IPTG至其終濃度為1.0 mmol/L，16℃誘導培養(yǎng)10 h。

1.8 重組酪氨酸酶的純化

重組酪氨酸酶的純化均在4℃的環(huán)境下進行。將方法1.6所述發(fā)酵液10 000 r/min離心10 min去除發(fā)酵液，將菌體用上樣緩沖液 （50 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，80 mmol/L 咪唑，pH 8.0）懸浮，將菌液置于冰浴中并用超聲波細胞破碎儀破碎細胞，10 000 r/min離心30 min，所得上清液即為粗酶液。將粗酶液上樣到Ni-NTA親和層析柱（美國通用公司醫(yī)療集團），用洗脫緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L 咪唑，15 μmol/L CuSO4，pH 8.0）洗脫帶有組氨酸標記的目的蛋白質(zhì)，將蛋白液保存于-20℃?zhèn)溆?。采用Broadford[21]法測定蛋白質(zhì)質(zhì)量。

1.9 酪氨酸酶的酶活測定方法

取適量酶液與5 mL酶活反應液混合試管中，30℃反應10 min，反應結(jié)束后在475 nm下測吸光度。 （酶活反應液配制：10 mmol/LL-Dopa，15 μmol/L硫酸銅，0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH 6.2）

酶活定義：在此條件下，每分鐘催化生成1 μmol/L多巴醌的酶量定義為一個酶活單位（U）。多巴醌的測量在475 nm的吸光度下進行。

1.10 突變酪氨酸酶的酶學性質(zhì)

1.10.1 最適pH 在反應溫度為30℃，將酪氨酸酶置于不同的緩沖體系中：檸檬酸緩沖液 （pH 3.0～6.0）、磷酸鹽緩沖液（pH 6.0～8.0）、Tris-HCl緩沖液（pH 8.0～9.0），測定酪氨酸酶酶活。酶活最高時作為100%。

1.10.2 pH穩(wěn)定性 在4℃的條件下，將酪氨酸酶置于不同的緩沖體系中保存1 h，測定酪氨酸酶酶活。檸檬酸緩沖液（pH 3.0～6.0）、磷酸鹽緩沖液（pH 6.0～8.0）、Tris-HCl緩沖液（pH 8.0～9.0），0 h 酶活作為100%。

1.10.3 最適溫度 在反應pH為6.2的條件下，將反應體系分別置于25～60℃下進行反應，測定酪氨酸酶酶活。酶活最高時作為100%。

1.10.4 半衰期t1/2在pH 7.5的條件下，將酪氨酸酶置于60℃的溫度中，在不同時間測定酪氨酸酶酶活，酪氨酸酶酶活為未處理時酶活50%的時間即為酪氨酸酶的半衰期。

1.10.5 耐熱性T50將酪氨酸酶置于50～70℃下處理30 min，冰浴10 min，最適反應條件下測定酪氨酸酶酶活，酪氨酸酶酶活為未處理時的酶活50%的溫度即為酪氨酸酶的T50值。

1.10.6 酪氨酸酶動力學研究 在最適反應條件下，將酪氨酸酶酶液與底物L-Dopa反應，測酪氨酸酶酶活，根據(jù)米氏方程，使用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法，計算出酪氨酸酶動力學常數(shù)。

1.11 突變酪氨酸酶三級結(jié)構(gòu)模擬與熱穩(wěn)定性機理研究

將酪氨酸酶突變后的蛋白序列提交至SWISSMODEL網(wǎng)站進行同源建模，以S.castaneoglobisporus的酪氨酸酶為模板進行同源建模，并且利用蛋白質(zhì)模型對酪氨酸酶熱穩(wěn)定性提高的機理進行探究。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變位點的選擇將S.kathirae酪氨酸

酶晶體結(jié)構(gòu)提交至POPMuSiC在線服務器預測計算酪氨酸酶每個突變氨基酸的去折疊自由能變化 （ΔΔG），最終選擇Arg95Tyr （ΔΔG：-2.61 kcal/mol）、Gly123Trp （ΔΔG：-5.55 kcal/mol）作為突變位點。

2.2 突變菌株的構(gòu)建

將酪氨酸酶基因序列中編碼Arg95的密碼子CGC突變?yōu)榫幋aTyr的密碼子TAC；編碼Gly123的密碼子GGC突變?yōu)榫幋aTrp的密碼子TGG，PCR擴增，DpnI消化模板質(zhì)粒，經(jīng)回收后直接轉(zhuǎn)化E.coli JM109，測序后顯示突變結(jié)果正確，將正確突變的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli BL21。

2.3 重組酪氨酸酶的表達與純化

IPTG誘導表達重組蛋白10 h后，離心收集重組菌菌體，細胞破碎后，破碎上清液使用Ni NTA分離純化。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，純化后的酶蛋白呈現(xiàn)單一條帶 ，見圖1。大小為30 000左右，野生型酪氨酸酶比酶活為1 182.12 U/mg；Arg95Tyr比酶活為1 098.59 U/mg；Gly123Trp比酶活為 1 139.41 U/mg；Arg95Tyr/Gly123Trp 比酶活為 1 113.74 U/mg。

圖1 表達上清液及純化蛋白質(zhì)的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of expressed supernatant and purified enzyme of recombinant strain

2.4 重組酪氨酸酶酶學性質(zhì)

2.4.1 酪氨酸酶的最適pH及pH穩(wěn)定性 以LDopa為底物測定酪氨酸酶及其突變體的最適pH及pH穩(wěn)定性。結(jié)果表明，相對于野生型酪氨酸酶，每個突變酶的最適pH及pH穩(wěn)定性未發(fā)生顯著變化。

2.4.2 酪氨酸酶的最適溫度、t1/2及T50分別測定酪氨酸酶及其突變體的最適溫度，結(jié)果見圖2。野生型酪氨酸酶的最適溫度為45℃，Arg95Tyr、Gly123Trp這兩個突變體雖然最適溫度沒有發(fā)生變化，但是在高溫下的相對酶活提高顯著，而組合突變后的突變體展現(xiàn)良好的協(xié)同效應，最適溫度提高了5℃。

圖2 野生型酪氨酸酶及其突變體的最適溫度Fig.2 Optimal temperature of tyrosinase and its mutants

酪氨酸酶的熱穩(wěn)定性采用t1/2及T50來進行表征，結(jié)果見表2，野生型酪氨酸酶在60℃的半衰期為 7.2 min，Arg95Tyr、Gly123Trp 在 60 ℃的半衰期分別為9.7、13.1 min，較野生型酪氨酸酶的半衰期分別提高了1.35和1.82倍，而組合突變體Arg95Tyr/Gly123T的半衰期較野生型酪氨酸酶提高了2.43倍，有了顯著提高。野生型酪氨酸酶的T50為59 ℃，Arg95Tyr、Gly123Trp 及 Arg95Tyr/Gly123T 突變體的T50較野生型酪氨酸酶的T50，分別提高了1、2、4℃，較好地提高了酪氨酸酶的耐熱性。

2.4.3 酪氨酸酶的動力學常數(shù) 以L-Dopa為底物測定酪氨酸酶及其突變體的動力學常數(shù)，結(jié)果見表3。相對于野生型酪氨酸酶，3個突變體的Km與kcat值變化不大，沒有對酶的催化效率造成嚴重影響。

表2 野生型酪氨酸酶及其突變體在60℃下的半衰期及T50Table 2 Half-lives （60℃）and T50of tyrosinase and its mutants

表3 野生型酪氨酸酶及其突變體的動力學參數(shù)Table 3 Kinetic parameters of tyrosinase and its mutants

2.5 突變酪氨酸酶的結(jié)構(gòu)模擬與突變位點分析

為研究酪氨酸酶熱穩(wěn)定性提高的機制，分別對野生型酪氨酸酶及Arg95Tyr/Gly123T進行同源建模。野生型酪氨酸酶3-D結(jié)構(gòu)見圖3，酪氨酸酶由7個α螺旋和2個β折疊構(gòu)成，2個β折疊分別位于N-端和C-端，這9個二級結(jié)構(gòu)由8段無規(guī)則卷曲連接， 其中 α2、α3、α6、α7 上的 6 個組氨酸形成高級結(jié)構(gòu)結(jié)合兩個銅離子構(gòu)成酪氨酸酶的活性中心。95位與123位氨基酸位于酪氨酸酶結(jié)構(gòu)表面，并且遠離酶的活性中心，在野生型酪氨酸酶中，Arg95和Gly123沒有與周圍的氨基酸相互作用，當Arg95和Gly123突變成Tyr95和Trp123時 ，見圖4。由于氨基酸結(jié)構(gòu)的變化Tyr95上的氮原子與Thr93上的氧原子足夠接近，進而形成了一個新的氫鍵，而Trp123上的氮原子與Ala121上的氧原子同時也形成了一個新的氫鍵，兩個增加的氫鍵可能是酪氨酸酶穩(wěn)定性提高的原因。氫鍵對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定起重要的作用，在維持蛋白質(zhì)的二級、三級結(jié)構(gòu)中起到至關重要的作用。在合理的位置引入氫鍵將極大地改良蛋白質(zhì)的耐熱性。作者通過利用在線預測軟件PoPMuSiC-2.1來輔助設計提高酪氨酸酶的穩(wěn)定性，根據(jù)預測得到的突變位點進行定點突變，獲得了穩(wěn)定性提高的突變體。在進行熱穩(wěn)定性提高的機理分析時發(fā)現(xiàn)，定點突變后的酪氨酸酶增加了兩個新的氫鍵，這可能是酪氨酸酶穩(wěn)定性提高的重要因素，同時突變位點遠離活性中心，沒有造成活性中心的結(jié)構(gòu)變化，對酪氨酸酶的催化活性影響較小。重組酪氨酸酶在60℃的穩(wěn)定性提高了2倍以上。

圖3 野生型酪氨酸酶的3-D結(jié)構(gòu)Fig.3 Three-dimensional structure model of tyrosinase

圖4 酪氨酸酶突變體的3-D結(jié)構(gòu)變化Fig.4 Change in structure （hydrogen bond） of tyrosinase after mutation

3 結(jié) 語

利用在線預測軟件PoPMuSiC計算酪氨酸酶每個突變氨基酸的去折疊自由能變化（ΔΔG）來輔助設計提高酪氨酸酶的穩(wěn)定性。對原始酶和突變體的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預測分析可知，突變前后酪氨酸酶的蛋白結(jié)構(gòu)及其酶活性中心基本沒有發(fā)生改變。95位氨基酸和123位氨基酸突變并沒有影響酪氨酸酶的酶活性中心，但是在突變位點引入了兩個新的氫鍵，而氫鍵的增加使突變體在60℃的半衰期提高了2.43倍，最適反應溫度由45℃提高到50℃，本研究結(jié)合蛋白質(zhì)工程與以計算機模擬為基礎的理性設計，完善了傳統(tǒng)蛋白質(zhì)工程的不足，展示了良好的應用前景。以計算機模擬為基礎的理性設計也為其他工業(yè)用酶的穩(wěn)定性改造提供了思路與方法。

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Enhancement of the Thermostability of Streptomyces kathirae SC-1 Tyrosinase by Rational Sign and Empirical Mutation

GUO Jing1，2， RAO Zhiming*1，2， YANG Taowei1，2， MAN Zaiwei1，2，ZHANG Xian1，2， XU Meijuan1，2， LI Xing1，2
（1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Homology modeling of tyrosinase was performed using the SWISS-MODEL based on the known crystal structure of tyrosinase from S.castaneoglobisporus（PDB No.2AHL）.The POPMuSiC algorithm was applied to predict the folding free energy change （ΔΔG）of amino acid substitution.Site-directed mutagenesis was used to construct mutants at Arg95Tyr and Gly123Trp.The mutant and wild-type enzymes were expressed in Escherichia coli （DE3）.As compared to the wild-typetyrosinase，all the mutant enzymes showed improved thermal properties.The mutant with combined substitution（Arg95Tyr/Gly123Trp） showed the most pronounced shifts in temperature optima，which was about 5℃upward，and the half-life for thermal inactivation at 60℃was increased by 1.5 times.The structure-based rational design strategies in this study may also provide further insight into the thermostability of other industrial enzymes and suggest further potential industrial applications.

tyrosinase，hydrogen bond，site-directed mutagenesis，rational design，POPMuSiC

Q 812

A

1673—1689（2017）09—0906—06

2015-03-10

國家自然科學基金項目（31300028）；國家863計劃項目（2015AA021004）；國家973計劃項目（2012CB725202）；江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程資助項目；111引智計劃（111-2-06）和江蘇省現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心項目。

郭 靜（1987—），女，遼寧本溪人，工學博士，主要從事酶工程方面的研究。E-mail：guojing05031205@163.com

*通信作者：饒志明（1975—），男，江西臨川人，農(nóng)學博士，教授，博士研究生導師，主要從事工業(yè)微生物育種和發(fā)酵代謝方面的研究。

E-mail：raozhm@jiangnan.edu.cn

郭靜，饒志明，楊套偉，等.理性設計定點突變提高Streptomyces kathirae SC-1酪氨酸酶熱穩(wěn)定性[J].食品與生物技術學報，2017，36（09）：906-911.