p38δ在宮頸癌細胞中的表達及其對缺氧HeLa細胞凋亡的影響

沈祥麗 ，柳怡 ，張勇武 ，張勇

（1.四川省成都市錦江區(qū)婦幼保健院 婦產(chǎn)科，四川 成都 610016；2.四川省綿陽市中心醫(yī)院 婦產(chǎn)科，四川 綿陽 621000）

p38δ在宮頸癌細胞中的表達及其對缺氧HeLa細胞凋亡的影響

沈祥麗1，柳怡1，張勇武1，張勇2

（1.四川省成都市錦江區(qū)婦幼保健院 婦產(chǎn)科，四川 成都 610016；2.四川省綿陽市中心醫(yī)院 婦產(chǎn)科，四川 綿陽 621000）

目的探討p38δ在宮頸癌組織細胞和HeLa細胞系中蛋白表達水平及p38δ對缺氧誘導HeLa細胞凋亡的影響。方法采用蛋白印跡法檢測組織及細胞蛋白表達水平。采用慢病毒轉(zhuǎn)染及細胞耐藥性篩選構建穩(wěn)定表達p38δ HeLa細胞株。采用膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶雙染色法檢測細胞凋亡水平。結(jié)果宮頸癌細胞系HeLa細胞中p38δ蛋白表達水平低于非癌性細胞系人胚腎293細胞及小鼠胚胎纖維細胞，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；宮頸癌組織細胞中p38δ蛋白表達水平低于正常宮頸組織細胞，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；p38δ過表達提高缺氧條件下HeLa細胞凋亡水平，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；p38δ過表達促進缺氧條件下HeLa細胞中凋亡相關因子Bcl-2蛋白表達水平下調(diào)及Bax、p53蛋白表達水平上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論在宮頸癌組織細胞和宮頸癌HeLa細胞中，p38δ的蛋白表達水平降低。HeLa細胞中高表達p38δ促進缺氧細胞凋亡。

宮頸癌；HeLa細胞；p38δ；細胞凋亡；缺氧

宮頸癌是危害國內(nèi)外婦女身體健康的主要疾病之一。了解宮頸癌的發(fā)病機制是診斷和治療該疾病的前提。雖然現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，多種細胞信號通路參與調(diào)控宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展，如FAK信號通路、ERKCDK2/Cyclin信號通路等[1-4]，但是人們對宮頸癌發(fā)生、發(fā)展機制的了解還不足以有效診斷與治療該類疾病。細胞分裂素活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）p38是細胞信號傳導過程中的重要蛋白激酶家族。該家族蛋白主要包括4個亞型，p38α（MAPK14）、p38β（MAPK11）、p38γ（MAP K12）及 p38δ（MAPK13）[5]，其中，p38α 是目前研究最廣泛的一個亞型，而人們對p38δ了解還知之甚少。多項研究結(jié)果顯示，p38δ在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要的調(diào)控作用，并且在不同的腫瘤組織中，p38δ對腫瘤發(fā)生、發(fā)展的調(diào)控功能不同[6]。已有報道指出，在宮頸癌源細胞HeLa細胞中p38δ低表達[7]。但是p38δ在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的調(diào)控功能，目前國內(nèi)外還沒有相關的研究報道。本研究主要初步探討宮頸癌組織中p38δ的蛋白表達水平，以及利用慢病毒轉(zhuǎn)染構建穩(wěn)定表達p38δ HeLa細胞株，并進一步探討在缺氧條件下p38δ對HeLa細胞凋亡的影響，從而為今后宮頸癌的篩查、診斷及治療提供新的思路與策略。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HeLa細胞、人胚腎293細胞（human embryonic kidney 293，HEK293）及小鼠胚胎纖維細胞（mouse embryonic fibroblast，MEF）細胞（均購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫），宮頸鱗狀細胞癌組織標本（10例），2009年國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）分期標準為Ⅱ期，中分化、正常宮頸組織標本（10例）（四川大學華西第二醫(yī)院婦產(chǎn)科），杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基（dulbecco modified eagle medium，DMEM）、胎牛血清、0.25%胰酶消化液（購自美國Gibco公司），嘌呤霉素（puromycin）、二喹啉甲酸蛋白濃度測定試劑盒及預染蛋白Maker（購自美國Thermo公司），組織蛋白提取試劑盒及細胞蛋白提取試劑盒（購自上海碧云天生物技術有限公司），p38δ過表達慢病毒顆粒、對照慢病毒顆粒（購自上海吉凱基因化學技術有限公司），4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）（購自美國 Sigma公司），聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（購自美國Millipore公司），p38δ兔單克隆抗體、β-actin鼠單克隆抗體、Bcl-2兔多克隆抗體、Bax兔多克隆抗體一抗及p53兔單克隆抗體（購自美國Abcam公司），熒光標記羊抗兔熒光二抗、羊抗鼠熒光二抗及羊抗兔Alexa Fluor?488 dye、細胞免疫熒光抗熒光淬滅劑（購自美國Thermo公司），膜聯(lián)蛋白（Annexin）V-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）雙染色細胞凋亡檢測試劑盒（購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）。

1.2 儀器與設備

5810R型離心機（德國Eppendorf公司），Chemi Doc MP全能型凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），Nikon 50i正置顯微鏡（帶高清CCD DP72攝像頭）（日本尼康公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) 將細胞從-150℃冰箱中取出，迅速置于37℃水浴鍋中解凍，然后吸入離心管，加入3 ml細胞培養(yǎng)液（10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液），1 500 r/min離心5 min，棄去上清液，將細胞重懸于1 ml細胞培養(yǎng)液，并轉(zhuǎn)移至10 cm細胞培養(yǎng)皿中，加入8 ml細胞培養(yǎng)液，混勻后放入細胞培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)（37℃、5%二氧化碳CO2）。每天更換1次培養(yǎng)液。

1.3.2 蛋白印跡法檢測蛋白表達水平 按照蛋白提取試劑盒說明書提取組織蛋白和細胞蛋白后，采用BCA法測定蛋白濃度。依照Western blot電泳系統(tǒng)進行蛋白電泳和轉(zhuǎn)膜。5%BSA TBST溶液室溫封閉1 h，一抗（1∶500）4℃孵育過夜，TBST 洗膜 3 次，每次 15 min。二抗（1∶1 000）避光室溫孵育 1 h，TBST洗膜3次，每次15 min。采用百樂熒光成像系統(tǒng)掃摸拍照。利用Image J軟件分析目的條帶灰度值，目的蛋白表達水平以目的蛋白/β-actin比值表示。

1.3.3 慢病毒感染及耐藥性細胞株篩選 將HeLa細胞接種于24孔板（3×104個/孔）。細胞培養(yǎng)過夜后移除培養(yǎng)基，每孔加入400μl DMEM培養(yǎng)液和100 μl病毒顆粒（病毒滴度為 5×107TU/ml），培養(yǎng)4 h后更換為細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后將細胞接種于6孔板中培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)液中含有1μg/ml的嘌呤霉素，直至6孔板中細胞克隆形成。將具有puromycin抗性的細胞克隆消化并接種至新的培養(yǎng)皿中，進行擴大培養(yǎng)。Western blot及細胞免疫熒光染色鑒定p38δ表達情況。

1.3.4 細胞免疫熒光染色 將對照組HeLa細胞或穩(wěn)定表達p38δ HeLa細胞接種于24孔板內(nèi)的細胞培養(yǎng)玻片上（1×105個/孔），細胞培養(yǎng)過夜。PBS洗1次，4%多聚甲醛PBS溶液固定細胞15 min，0.2%Trition-X-100 PBS溶液透膜20 min，5%BSA封閉液封閉1 h，p38δ兔單克隆抗體（1∶200）室溫孵育 2 h，羊抗兔 Alexa Fluor?88 dye（1∶1 000）室溫避光孵育 1 h，DAPI（1μg/ml）染核 5 min，樹脂封閉，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.3.5 細胞缺氧處理 將對照組HeLa細胞或穩(wěn)定表達p38δ HeLa細胞接種于24孔板（1×105個/孔），細胞正常培養(yǎng)過夜。然后更換細胞培養(yǎng)液，將缺氧處理組置入三氣培養(yǎng)箱（5%CO2-1%O2-94%N2，37℃）中缺氧培養(yǎng)24 h，對照組置入正常培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取出缺氧培養(yǎng)或正常培養(yǎng)后的細胞，進行蛋白提取或細胞凋亡檢測。

1.3.6 Annexin V-FITC/PI雙染色檢測細胞凋亡將對照組HeLa細胞或穩(wěn)定表達p38δ HeLa細胞接種于24孔板（1×105個/孔）。細胞經(jīng)缺氧處理后，按照Annexin V-FITC/PI染色細胞凋亡檢測試劑盒說明書收集細胞，PBS溶液洗滌細胞2次。將細胞重懸于400μl Binding buffe（r試劑盒提供），加入5μl AnnexinV-FITC及10μl PI染色液，室溫染色15min。按照試劑盒說明書將染色后的細胞重懸于50μl Binding buffer，取5 μl重懸液滴于干凈載玻片，扣蓋蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察并拍照，其中，Annexin V-FITC采用波長488nm激發(fā)光，PI采用波長568nm激發(fā)光。Anneixn V陽性細胞代表凋亡發(fā)生細胞。采用Image J軟件對細胞進行計數(shù)。本實驗細胞凋亡水平以Anneixn V陽性細胞百分數(shù)表示。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 p38δ在宮頸癌HeLa細胞中的表達情況

蛋白印跡法檢測結(jié)果顯示，非癌源細胞系HEK293細胞、MEF細胞及宮頸癌HeLa細胞中p38δ 蛋白表達水平分別是（0.78±0.07）、（0.81±0.02）及（0.09±0.02），經(jīng)t檢驗，HEK293 細胞和 HeLa細胞中p38δ蛋白表達水平差異有統(tǒng)計學意義（t=22.980，P=0.002），HeLa細胞中 p38δ 蛋白表達水平降低；同時MEF細胞和HeLa細胞中p38δ蛋白表達水平差異有統(tǒng)計學意義（t=50.040，P=0.000），HeLa細胞中p38δ蛋白表達水平也降低。見圖1。

2.2 p38δ在宮頸癌組織中低表達

蛋白印跡法結(jié)果顯示，正常宮頸組織與宮頸癌組織中p38δ蛋白表達水平分別是（1.25±0.09）、（0.31±0.04），正常宮頸組織中p38δ蛋白表達水平與宮頸癌組織中p38δ蛋白表達水平經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=18.570，P=0.000），宮頸癌組織中p38δ蛋白表達水平降低。此外，蛋白印跡結(jié)果同時顯示，與正常宮頸組織比較，宮頸癌組織中p38α蛋白表達水平變化不大。見圖2。

2.3 成功構建p38δ穩(wěn)定表達HeLa細胞株

圖1 HeLa細胞、HEK293細胞及MEF細胞中p38δ蛋白表達水平 （Western blot）

圖2 正常宮頸組織和宮頸癌組織中p38δ蛋白表達水平

圖3 p38δ穩(wěn)定表達HeLa細胞株中p38δ蛋白水平（Western blot）

HeLa細胞經(jīng)對照病毒顆粒（不含目的基因）和表達p38δ病毒顆粒（含有p38δ基因）感染后，進行嘌呤霉素耐藥性克隆篩選。然后采用蛋白印跡和免疫熒光染色檢測細胞中p38δ表達情況。蛋白印跡法檢測結(jié)果顯示，p38δ穩(wěn)定表達HeLa細胞株中p38δ蛋白成功高表達，而對照細胞株中p38δ蛋白表達較低（見圖3）。細胞免疫熒光染色結(jié)果顯示，p38δ穩(wěn)定表達HeLa細胞株中細胞均為p38δ陽性克隆，且各個細胞間p38δ蛋白表達水平均一（見圖4）。結(jié)果表明，p38δ穩(wěn)定表達HeLa細胞株構建成功。

2.4 p38δ過表達對HeLa細胞缺氧條件下細胞凋亡的影響

Annexin V-FITC/PI雙染色細胞凋亡檢測實驗結(jié)果顯示，在常氧處理條件下，對照組HeLa細胞株和穩(wěn)定表達p38δ HeLa細胞株細胞凋亡水平分別是（6.99±1.21）%和（19.52±1.93）%（見圖 5），經(jīng) t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=23.610，P=0.002），后者細胞凋亡水平升高；在缺氧處理條件下，對照組HeLa細胞株和穩(wěn)定表達p38δ HeLa細胞株細胞凋亡水平分別是（20.37±2.47）%和（47.23±3.42）%（見圖5），經(jīng) t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=8.720，P=0.013），后者細胞凋亡水平升高。本結(jié)果表明，HeLa細胞中過表達p38δ促進細胞凋亡。

圖4 p38δ穩(wěn)定表達HeLa細胞株中p38δ蛋白表達 （細胞免疫熒光染色×400）

2.5 p38δ過表達對HeLa細胞缺氧條件下Bcl-2、Bax及p53蛋白表達水平的影響

蛋白印跡結(jié)果顯示，在常氧處理條件下，對照組HeLa細胞株和穩(wěn)定表達p38δ HeLa細胞株中Bcl-2和Bax蛋白表達水平差異不大；p53蛋白表達水平經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.003），穩(wěn)定表達p38δ HeLa細胞株中p53蛋白表達水平提高（見附表和圖6）。在缺氧處理條件下，對照組HeLa細胞株中Bcl-2蛋白表達水平和穩(wěn)定表達p38δ HeLa細胞株中Bcl-2蛋白表達水平經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.001），穩(wěn)定表達p38δ HeLa細胞株中Bcl-2蛋白表達水平上升；經(jīng)t檢驗，穩(wěn)定表達p38δ HeLa細胞株中Bax和p53蛋白表達高于對照組HeLa細胞株，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）（見附表和圖6）。結(jié)果表明，p38δ可能通過調(diào)控凋亡相關因子 Bcl-2、Bax及 p53蛋白表達水平來調(diào)控HeLa細胞凋亡的發(fā)生。

圖5 Annexin V-FITC/PI雙染色和熒光顯微鏡觀察檢測p38δ過表達對缺氧HeLa細胞凋亡的影響 （×200）

附表 p38δ過表達對缺氧條件下HeLa細胞中Bcl-2、Bax及p53蛋白表達水平的影響 （n=3，±s）

附表 p38δ過表達對缺氧條件下HeLa細胞中Bcl-2、Bax及p53蛋白表達水平的影響 （n=3，±s）

蛋白表達水平Bcl-2（Bcl-2/β-actin） Bax（Bax/β-actin） p53（p53/β-actin）常氧 常氧 常氧 缺氧對照組HeLa細胞株 0.34±0.03 0.75±0.02 0.69±0.02 0.74±0.02 0.13±0.03 0.59±0.05穩(wěn)定表達p38δ HeLa細胞株 0.34±0.02 0.25±0.02 0.65±0.03 1.21±0.01 0.32±0.01 1.16±0.06 t值 0.160 29.210 4.110 64.050 11.670 18.060 P值 0.891 0.001 0.054 0.000 0.007 0.003組別缺氧 缺氧

圖6 p38δ過表達對缺氧條件下HeLa細胞中Bcl-2、Bax及p53蛋白表達水平的影響

3 討論

p38蛋白家族是生理病理過程中重要的中樞調(diào)控蛋白激酶，其參與多種細胞行為調(diào)控，如細胞增殖、細胞凋亡及細胞遷移等。雖然，p38家族蛋白之間存在高度的保守性，但是其在組織中的表達水平不盡相同，其調(diào)控功能也不盡相同。p38α和p38β在多種組織細胞中廣泛表達，而p38γ和p38δ的表達依賴于組織細胞的類型[8]。在人類原發(fā)性皮膚鱗狀細胞癌細胞、膽管癌細胞等腫瘤細胞中p38δ高表達，并且p38δ表達水平的升高和激酶活性的增強與該腫瘤的侵襲、遷移相關[9-11]；而在食管鱗狀細胞癌、原發(fā)性皮膚黑色素瘤等癌細胞中p38δ表達受抑制，并且進一步的研究發(fā)現(xiàn)在該癌細胞中p38δ的低表達促進癌細胞的增殖、遷移及侵襲[12-15]。有研究報道指出，在宮頸癌HeLa細胞中，p38δ蛋白表達水平極低[7]。本實驗發(fā)現(xiàn)，與非癌性細胞HEK293、MEF細胞相比，HeLa細胞中p38δ蛋白表達量極低，這與上述報道一致。此外，本實驗還發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌實體瘤組織中，p38δ蛋白表達水平降低。本結(jié)果說明，在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展過程中，p38δ的表達受到特異性的下調(diào)。但是p38δ蛋白表達水平降低的分子機制，還需進一步的研究揭示。

p38δ在細胞凋亡方面具有重要的調(diào)控作用。在角質(zhì)細胞中，軟海綿酸可以激活p38δ，并且誘導角質(zhì)細胞凋亡；進一步研究證明該過程中，p38α和p38β并不參與角質(zhì)細胞凋亡的誘導[16]。另外，在食管鱗狀細胞癌中過表達p38δ將會提高細胞在順鉑處理條件下的凋亡水平，從而提高細胞對順鉑的敏感性[13]。本實驗中，利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術及細胞耐藥性篩選技術成功構建穩(wěn)定表達p38δ HeLa細胞株。進一步的研究發(fā)現(xiàn)HeLa細胞中高表達p38δ促進細胞凋亡的發(fā)生。這與p38δ在角質(zhì)細胞、食管鱗狀細胞癌細胞中調(diào)控細胞凋亡的功能一致。腫瘤細胞規(guī)避細胞凋亡的調(diào)控，是其癌化及腫瘤遷移侵襲的關鍵。腫瘤在發(fā)生、發(fā)展過程中，由于其生長速度及微環(huán)境的改變，腫瘤組織中供氧供血能力低于正常組織。對低氧環(huán)境的耐受，是腫瘤生長的一個重要特性[17]。本實驗發(fā)現(xiàn)，在低氧環(huán)境中，p38δ促進HeLa細胞凋亡的發(fā)生，說明宮頸癌細胞在生長過程中對細胞凋亡調(diào)控的耐受與p38δ蛋白表達量下調(diào)有關。除細胞凋亡之外，細胞遷移與細胞侵襲也是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關鍵。宮頸癌細胞中p38δ表達量的下調(diào)是否與宮頸癌細胞增殖遷移及侵襲有關，還需進一步的實驗研究來揭示。

細胞凋亡是眾多細胞信號通路相互作用的結(jié)果。Bcl-2是一個主要的抗凋亡因子，其能夠與促凋亡因子Bax相互作用，抑制Bax的促凋亡活性[18]。HeLa細胞中，順鉑、雙氫青蒿素（dihydroartemisinin）、人參皂苷 Rg3（ginsenoside Rg3）對細胞凋亡的誘導依賴于Bcl-2基因表達水平的降低和Bax表達水平的上升[19-21]。本研究發(fā)現(xiàn)在缺氧條件下，HeLa細胞中過表達p38δ將誘導Bcl-2蛋白表達量下調(diào)和Bax蛋白表達量上調(diào)。這與Bcl-2/Bax調(diào)控細胞凋亡模型一致。此外，p53蛋白也是一個重要的細胞凋亡調(diào)控因子。在宮頸癌組織細胞中，利用腺病毒轉(zhuǎn)染野生型p53基因，可以誘導宮頸癌細胞的凋亡，從而達到腫瘤治療的效果[22]。非編碼RNA VTRNA2-1-5p可以通過作用p53 mRNA的非編碼區(qū)，降低p53的表達水平，從而降低宮頸癌細胞的凋亡水平，促進宮頸癌細胞的增殖與侵襲[23]。在HeLa細胞中，SIRT2基因敲低后，將會誘導細胞凋亡的發(fā)生，在該過程中p53蛋白的表達水平上調(diào)，并且p53蛋白的積累依賴于p38蛋白激酶的激活[24]。本實驗發(fā)現(xiàn)，HeLa細胞中過表達p38δ蛋白將會誘導p53蛋白表達水平的升高，且缺氧處理將會進一步誘導p53蛋白積累。本結(jié)果提示在常氧條件及缺氧條件下，p38δ調(diào)控HeLa細胞凋亡可能與p53蛋白積累有關。但對于p38δ調(diào)控Bcl-2、Bax及p53蛋白表達水平的具體分子機制，還需進一步深入研究來揭示。

通過以上實驗，本研究發(fā)現(xiàn)在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展過程中，p38δ的表達量特異性下調(diào)，而且p38δ表達水平的這一改變，與宮頸癌細胞規(guī)避細胞凋亡相關。外源性過表達p38δ，能夠提高HeLa細胞對低氧環(huán)境的敏感度，上調(diào)細胞凋亡水平。本研究將幫助人們更好的了解p38δ對細胞行為的調(diào)控功能，同時為宮頸癌的篩查、診斷及臨床治療提供新的思路與策慮。

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Role of p38δ on hypoxia-induced apoptosis in cervical cancer cells and its effect on hypoxia-mediated apoptosis of HeLa

Xiang-li Shen1,Yi Liu1,Yong-wu Zhang1,Yong Zhang2
(1.Department of Gynaecology and Obstetrics,Jinjiang Maternity and Child Health Hospital,Chengdu,Sichuan 610016,China;2.Department of Gynaecology and Obstetrics,Mianyang Central Hospital,Mianyang,Sichuan 621000,China)

ObjectiveTo investigate the expression level of p38δ in cervical cancer cells and its effect on hypoxia-mediated apoptosis of HeLa cells.MethodsThe expression level of p38δ was identified by Western blot.HeLa cell models stably expressing p38δ were established with lentivirus system.Hypoxia-induced apoptosis in HeLa cells was measured by Annexin V-FITC/PI double labeling system.Resultsp38δ was significantly down-regulated in cervical cancer tissures and HeLa cells compared with that in normal cervical tissues and non-tumor cell lines,respectively (P＜0.05).Expression of p38δ in cervical cancer tissues was significanthy lower than that in normal cervical tissues.HeLa cells stably expressing p38δ experienced a higher hypoxia-induced apoptosis when compared with control HeLa cells(P＜0.05).Under hypoxia conditions,the expression levels of p53 and Bax in HeLa cells stably expressing p38δ were significantly increased,and Bcl-2 was decreased when compared with those in control HeLa cells (P＜0.05).Conclusionsp38δ is downregulated in cervical cancer.Overexpression of p38δ promotes hypoxia-induced apoptosis.

cervical cancer;HeLa cells;p38δ;apoptosis;hypoxia

R737.3

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.24.005

1005-8982（2017）24-0022-07

2017-02-28

張勇，E-mail：zhangyong1215@hotmail.com；Tel：13808110138

（王榮兵 編輯）