非小細(xì)胞肺癌惡性胸水中癌細(xì)胞EML4-ALK重排檢測及其臨床意義

王莉，韓永紅，曾娟，李軍

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院 腫瘤科，湖北 武漢 430014）

非小細(xì)胞肺癌惡性胸水中癌細(xì)胞EML4-ALK重排檢測及其臨床意義

王莉，韓永紅，曾娟，李軍

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院 腫瘤科，湖北 武漢 430014）

目的探討非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者惡性胸水（MPE）中癌細(xì)胞EML4-ALK基因重排的可行性及與其病理特征之間的關(guān)系。方法選取138例伴有MPE的NSCLC患者，用瑞氏染色法鑒定MPE中的癌細(xì)胞，用免疫組織化學(xué)法鑒定腫瘤組織中EML4-ALK基因重排，運(yùn)用微流控芯片技術(shù)檢測NSCLC患者M(jìn)PE中癌細(xì)胞，采用熒光染色法確定癌細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測ALK基因重排狀態(tài)。結(jié)果在138例NSCLC患者中，腫瘤組織免疫組織化學(xué)（IHC）染色有10例EML4-ALK基因陽性，qRT-PCR檢測到10例EML4-ALK融合基因重排。IHC和qRT-PCR的一致性為100%，兩者敏感性和特異性均為100%。ALK基因重排狀況與患者EGFR突變等差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而與病理分型、原發(fā)部位、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論qRT-PCR檢測NSCLC患者M(jìn)PE中癌細(xì)胞EML4-ALK融合基因是篩選ALK基因重排方法的一種補(bǔ)充，值得在臨床中推廣。

非小細(xì)胞肺癌；惡性胸水；棘皮動(dòng)物微管相關(guān)類蛋白4和間變性淋巴瘤激酶

肺癌每年新發(fā)病例約150萬，其中，約85%為非小細(xì)胞肺癌（non small cell lung cancer，NSCLC），肺癌是全世界癌癥相關(guān)性死亡的首要原因?；熓侵委煇盒阅[瘤最重要的手段之一，然而腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥使得效果不盡人意。靶向藥物在腫瘤臨床中應(yīng)用越來越廣泛，棘皮動(dòng)物微管相關(guān)類蛋白4（echinoderm microtubule-associated protein-like4，EML4）基因和間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）融合基因，被證實(shí)為NSCLC的一個(gè)重要致癌驅(qū)動(dòng)因子，也是克唑替尼的主要治療靶基因[1]。惡性胸水（malignant pleural effusions，MPE）是中晚期NSCLC的一種常見的嚴(yán)重并發(fā)癥，約15%的肺癌患者在診斷時(shí)就出現(xiàn)MPE，而且50%的NSCLC患者M(jìn)PE為細(xì)胞學(xué)檢查陽性。臨床上獲得MPE具有微創(chuàng)、反復(fù)多次及易于操作等特點(diǎn)，使得MPE可能替代腫瘤組織用于基因檢測，但是MPE中癌細(xì)胞數(shù)量較少，還混有炎癥細(xì)胞、間皮細(xì)胞等，MPE中癌細(xì)胞純度較低。筆者用微流控芯片技術(shù)提取MPE中的癌細(xì)胞，然后用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測EML4-ALK重排，探討檢測MPE中癌細(xì)胞EML4-ALK重排能否作為一種非組織來源的替代方法。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2012年4月-2014年4月在本院入住的患者138例經(jīng)組織病理學(xué)證實(shí)Ⅲ-Ⅳ期的NSCLC。其中，男性98例，女性40例。詳細(xì)記錄患者的病理分型、原發(fā)部位、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）突變等資料。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)和受試對(duì)象知情同意。

1.2 惡性胸水中癌細(xì)胞的鑒定

取50 ml惡性胸水行常規(guī)的瑞氏染色，紫色為癌細(xì)胞，由2位有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師在熒光顯微鏡下獨(dú)立觀察細(xì)胞染色情況，有分歧時(shí)由第3人協(xié)助判定。

1.3 NSCLC癌組織中EML4-ALK基因免疫組織化學(xué)染色

術(shù)中取得的腫瘤組織或者纖維支氣管鏡活檢取得的組織，采用EnVision二部法。所用一抗克隆號(hào)為D5F3，一抗和二抗（購自瑞士羅氏公司），操作采用全自動(dòng)免疫組織化學(xué)（免疫組化）染色機(jī)進(jìn)行。

1.4 惡性胸水中癌細(xì)胞捕獲和釋放

在診斷性或治療性排放惡性胸水時(shí)取最后一管惡性胸水50 ml，以3 000 r/min離心10 min，取沉淀物再懸浮于1 ml磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）中備用。微流控納米芯片的制作和修飾過程請(qǐng)參見文獻(xiàn)[2]，每個(gè)芯片加上250 μl的Streptavidin（濃度為 250 μg/ml），置于 4℃冰箱過夜；組裝芯片，并用0.5ml的PBS沖洗1次，流速為0.5ml/h；用注射器加入500 μl濃度為200 μg/ml的上皮細(xì)胞黏附分子，在常溫下孵育45 min，再用0.5 ml的PBS沖洗1次；將1 ml的惡性胸水以0.5 ml/h的速度流過芯片，最后用并用0.5 ml的PBS沖洗1次，流速為0.5 ml/h，卸載芯片并保存在4℃冰箱中。

1.5 免疫組化染色

將捕獲癌細(xì)胞的芯片用4%的甲醛溶液固定15 min，然后用200 μl的PBS沖洗。對(duì)樣品進(jìn)行免疫組化染色，其中先用異硫氰酸熒光素標(biāo)記的細(xì)胞角蛋白抗體（200 μg/ml）200 μl在常溫下孵育45 min，然后用200 μl的PBS輕輕沖洗芯片；再用花氰染料5熒光染料標(biāo)記的白細(xì)胞共同抗原CD45抗體（200 μg/ml）在常溫下孵育45 min，然后用200 μl的PBS輕輕沖洗芯片；最后用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（10μg/ml）200μl在常溫下孵育10min，然后用200 μl的PBS輕輕沖洗芯片。對(duì)固定在納米芯片上特異性捕獲的癌細(xì)胞和非特異性捕獲的白細(xì)胞，用熒光顯微鏡進(jìn)行鑒別確認(rèn)。

1.6 qRT-PCR檢測EML4-ALK基因重排

將捕獲在納米芯片上的癌細(xì)胞用胰酶處理后，可釋放出高純度的癌細(xì)胞。然后提取癌細(xì)胞的總核糖核酸（ribonucleic acid，RNA），每例樣品提起 30～300 ng的RNA在42℃孵育1 h和95℃孵育5 min后逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)脫氧核糖核酸，然后置于冰中冷卻。qRT-PCR依據(jù)試劑公司操作說明書進(jìn)行操作。在每個(gè)樣本的qRT-PCR進(jìn)行以下4個(gè)反應(yīng)[3]。所有的4個(gè)實(shí)驗(yàn)在Mx3000P qRT-PCR設(shè)備執(zhí)行（美國安捷倫科技公司）。qRT-PCR程序進(jìn)行如下：初始在95℃下變性5 min，隨后95℃保持25 s，在64℃保持20 s，72℃保持 20 s，循環(huán) 15 次；93℃保持 25s，60℃保持35 s，72℃保持20 s，循環(huán)31次。定量判斷根據(jù)融合熒光信號(hào)強(qiáng)度。測定得Ct值≤30周期被認(rèn)定癌細(xì)胞中檢測到EML4-ALK基因重排。用看家基因確保RNA的完整性。陽性對(duì)照和陰性對(duì)照確保試驗(yàn)效率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0與GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC患者惡性胸水中癌細(xì)胞EML4-ALK融合基因重排與臨床病理特征的相關(guān)性

不同病理分型、不同原發(fā)部位、不同臨床分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有無間的EML4-ALK融合基因重排陽性率的比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；EGFR突變有無間EML4-ALK融合基因重排陽性率的比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.132，P=0.023）。見附表。

2.2 NSCLC患者惡性胸水中癌細(xì)胞的鑒定結(jié)果

對(duì)惡性胸水中癌細(xì)胞經(jīng)瑞氏染色后，通過熒光顯微鏡觀察拍照，癌細(xì)胞為紫色且細(xì)胞直徑范圍為10～40 μm，見圖 1。

2.3 NSCLC患者惡性胸水中癌細(xì)胞的鑒定結(jié)果

對(duì)捕獲的癌細(xì)胞行免疫組化染色，通過熒光顯微鏡觀察拍照，可以明確鑒別出癌細(xì)胞（DAPI+/FITC+/Cy5-）和惡性胸水中的白細(xì)胞（DAPI+/FITC-/Cy5+）。見圖2。

附表 NSCLC患者不同臨床病理特征EML4-ALK融合基因重排陽性率的比較

圖1 惡性胸水中癌細(xì)胞 （瑞氏染色×400）

2.4 NSCLC癌組織中EML4-ALK基因免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

圖2 惡性胸水中的癌細(xì)胞和白細(xì)胞

在138例NSCLC中，對(duì)癌組織行免疫組化染色，陽性表達(dá)的判定標(biāo)準(zhǔn)：腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)強(qiáng)染色顆粒，發(fā)現(xiàn)有10例EML4-ALK基因重排陽性7.25%（10/138），陽性染色。見圖 3。

2.5 qRT-PCR檢測EML4-ALK基因重排結(jié)果

惡性胸水中癌細(xì)胞用qRT-PCR檢測EML4-ALK基因重排，其中，有10例為陽性，剩余為陰性，陽性率為7.25%（10/138），陰性和陽性結(jié)果見圖4。

圖3 NSCLC癌組織中EML4-ALK基因免疫組化染色結(jié)果

圖4 惡性胸水中癌細(xì)胞qRT-PCR檢測EML4-ALK基因重排

3 討論

EML4-ALK融合基因由第2號(hào)染色體短臂插入形成，其嵌合產(chǎn)物可導(dǎo)致ALK酪氨酸激酶持續(xù)高表達(dá)，從而激活下游PI3K/AKT、MAPK等信號(hào)通路，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[4]。在臨床上應(yīng)用ALK抑制劑克唑替尼已對(duì)ALK融合基因陽性的NSCLC的患者產(chǎn)生獲益[5-7]，克唑替尼治療ALK陽性的NSCLC患者客觀有效率高達(dá)60%[7]。而NSCLC中EML4-ALK陽性率為3%～8%[8]。因此，篩選NSCLC中EML4-ALK重排陽性率高的目標(biāo)人群進(jìn)行靶向治療具有重要的臨床意義。

免疫組化檢測EML4-ALK基因重排具有價(jià)廉和省時(shí)的特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于臨床。WANG等[9]研究發(fā)現(xiàn)，通過IHC法和FISH法檢測MPE中EML4-ALK基因重排的結(jié)果是完全一致的。JIANG等[10]在腫瘤組織中兩種方法檢測結(jié)果也一致。在本研究中，用免疫組化檢測腫瘤組織中EML4-ALK重排陽性率為7.25%（10/138），用qRT-PCR檢測MPE中癌細(xì)胞的EML4-ALK重排陽性率為7.25%（10/138）。免疫組織化學(xué)和qRT-PCR兩種檢測方法一致率為100%，敏感性為100%（10/10），特異性也為100%（128/128）。本研究結(jié)果表明，用qRT-PCR檢測MPE中癌細(xì)胞EML4-ALK重排是一種非組織來源的EML4-ALK檢測替代方法。

獲取腫瘤組織常代表某個(gè)時(shí)間點(diǎn)[11]，有時(shí)甚至無有效組織可用，因此用IHC法對(duì)腫瘤組織的染色檢測EML4-ALK重排存在一定的局限性。與組織樣品的檢測相比，MPE的獲得具有微創(chuàng)、反復(fù)多次及易于操作等特點(diǎn)[12-15]，用qRT-PCR檢測MPE中癌細(xì)胞EML4-ALK重排可以實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)反映患者的狀況，可以用于靶向治療藥物療效監(jiān)測等。本研究中采用微流控芯片技術(shù)獲得MPE中癌細(xì)胞純度高，qRT-PCR也是一個(gè)敏感高效的方法，因此用qRT-PCR檢測MPE中癌細(xì)胞EML4-ALK重排在臨床實(shí)踐中具有極大的推廣應(yīng)用價(jià)值。

綜上所述，筆者的研究結(jié)果表明，基于MPE中癌細(xì)胞的EML4-ALK檢測與基于腫瘤組織的EML4-ALK檢測具有高度的一致性，證實(shí)利用MPE中癌細(xì)胞檢測EML4-ALK重排是一種可行和可靠的非組織來源的替代方法。在腫瘤臨床中獲得MPE具有微創(chuàng)、反復(fù)多次及易于操作等優(yōu)點(diǎn)，檢測MPE中癌細(xì)胞的EML4-ALK重排不但可以指導(dǎo)NSCLC的靶向治療，而且可以用于動(dòng)態(tài)監(jiān)測藥物的反應(yīng)和疾病的進(jìn)展情況，值得在臨床工作中進(jìn)一步推廣。

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Detection ofEML4-ALKgene rearrangement in NSCLC cells and its clinical significance

Li Wang,Yong-hong Han,Juan Zeng,Jun Li
(Department of Oncology,The Central Hospital of Wuhan,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan,Hubei 430014,China)

ObjectiveToinvestigatetheapplication ofdetecting echinoderm microtubule-associated protein-like 4-anaplastic lymphoma kinase (EML4-ALK)gene rearrangement by qRT-PCR in non-small cell lung cancer cells (NSCLC),and to evaluate the relationship betweenEML4-ALKgene rearrangement and clinical relevance.MethodsA total of 138 patients confirmed with NSCLC in malignant pleural effusion(MPE)were recruited in this study.Cancer cells in MPE were identified by Wright's staining and microfluidic chip technology.EML4-ALKgene rearrangement in cancer cells was determined by Immunohistochemistry(IHC),and quantitative real time polymerase chain reaction (qRT-PCR).ResultsTen out of 138 (7.25%)patients were identified with EML4-iat d protein-lik by IHC,who were also verified by qRT-PCR.Sensitivity and specificity of IHC and qRT-PCR were 100%.TheEML4-ALK gene rearrangement was correlated with EGFR mutation (P＜0.05),while no relation between theEML4-ALKgene rearrangement and tumor characters including histological type,site of primary onset,clinical stage and lymphatic metastasis(P＞0.05).ConclusionsqRT-PCR is a reliable method for detection ofEML4-ALKrearrangement detection in NSCLC.

non-small-cell lung cancer;malignant pleural effusions;echinoderm microtubule-associated protein-like4-anaplastic lymphoma kinase

R730.43

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.24.007

1005-8982（2017）24-0034-05

2017-03-29

（王榮兵 編輯）