鹽脅迫下不同K+吸收抑制劑對小麥根系K+/Na+比和質(zhì)膜相關(guān)蛋白活性的影響

張華寧，李孟軍，郭秀林，張艷敏，劉子會

(1.河北省農(nóng)林科學院 遺傳生理研究所，河北省植物轉(zhuǎn)基因中心重點實驗室，河北 石家莊 050051；2.石家莊市農(nóng)林科學研究院,河北 石家莊 050000)

鹽脅迫下不同K+吸收抑制劑對小麥根系K+/Na+比和質(zhì)膜相關(guān)蛋白活性的影響

張華寧1，李孟軍2，郭秀林1，張艷敏1，劉子會1

(1.河北省農(nóng)林科學院 遺傳生理研究所，河北省植物轉(zhuǎn)基因中心重點實驗室，河北 石家莊 050051；2.石家莊市農(nóng)林科學研究院,河北 石家莊 050000)

為了研究不同K+吸收途徑在小麥耐鹽機理中的作用，以小麥耐鹽品種滄6005(C6005)和敏感品種矮抗58(AK58)為材料，通過K+吸收相關(guān)抑制劑和NaCl對幼苗進行根系處理，測定并分析了根系K+、Na+含量、比值和質(zhì)膜K+轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白活性的變化。結(jié)果表明：與正常條件生長小麥相比，250 mmol/L NaCl處理7 d后，2種耐鹽性不同的小麥根系中的K+/Na+比明顯降低，同時與敏感品種相比，耐鹽品種能保持較高的K+/Na+比；NaCl脅迫下，通過3種抑制劑處理對K+含量及K+/Na+比值的影響發(fā)現(xiàn)，與鉀離子通道和非選擇性陽離子通道途徑相比，小麥根系K+吸收主要通過鉀載體途徑；當該途徑被抑制時，滄6005的K+/Na+比下降幅度明顯高于矮抗58，表明耐鹽品種更依賴該途徑；NaCl脅迫下，鉀載體途徑被抑制時，小麥根系質(zhì)膜質(zhì)子泵H+-ATPase和H+-PPase活性明顯降低，且滄6005降低幅度相對更大；NaCl脅迫下，鉀載體抑制劑處理，對滄6005質(zhì)膜K+/H+轉(zhuǎn)運蛋白的抑制作用明顯強于矮抗58，進一步證明上述結(jié)果。研究表明，鹽脅迫下小麥主要通過鉀載體途徑吸收K+，耐鹽品種滄6005對鉀轉(zhuǎn)運載體的依賴程度更高；高NaCl環(huán)境中，細胞質(zhì)膜質(zhì)子泵活性和鉀載體活性的提高對于維持K+/Na+比具有重要作用。為深入解析小麥耐鹽機理提供了理論依據(jù)。

小麥；鹽脅迫；K+/Na+比；質(zhì)膜蛋白；K+抑制劑

小麥(TriticumaestivumL.)是我國乃至世界主要糧食作物，往往受到土壤鹽漬化影響。土壤鹽漬化不僅產(chǎn)生滲透脅迫、離子失衡、營養(yǎng)缺乏、膜結(jié)構(gòu)損傷、新陳代謝紊亂等危害，同時過量ROS造成的氧化損傷、光合作用的減弱還對作物造成二次傷害[1]，因此，鹽脅迫成為影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要因素之一[2]。

低Na+對植物生長具有促進作用，尤其在缺K+環(huán)境中，少量的Na+可以替代K+，參與植物生長發(fā)育和新陳代謝；但在高濃度下，大量的Na+進入細胞質(zhì)，會引起一系列負面反應(yīng)，其中最主要的是引起K+缺乏，而K+穩(wěn)態(tài)對于維持細胞內(nèi)多種酶活性和功能所必須[3]，其中根系的保K+能力至關(guān)重要[4]。胞質(zhì)K+/Na+平衡是維持細胞新陳代謝、提高耐鹽能力的關(guān)鍵[5]，植物可以通過維持體內(nèi)較高的K+/Na+比來減輕毒害。研究表明，100 mmol/L NaCl處理30 d，耐鹽小麥植株Na+含量最少，且質(zhì)膜逆向轉(zhuǎn)運蛋白相關(guān)基因SOS1、SOS2和SOS3的表達量、Na+排出量和體內(nèi)K+/Na+均明顯高于鹽敏感品種[6]；鹽脅迫下，耐鹽小麥能夠?qū)⒏嗟腘a+和K+積累在根部，促進K+吸收同時抑制Na+向地上部轉(zhuǎn)運，從而保證葉片較高的K+/Na+[7]。用NaHS預(yù)處理水稻發(fā)現(xiàn)，植株在增加K+吸收的同時，減少Na+吸收，從而保持更高的K+/Na+和更好的長勢[8]。鹽脅迫下耐鹽性高的甘薯體內(nèi)K+/Na+下降幅度更小，其質(zhì)膜SOS1和液泡膜NHX1表達量都明顯高于普通品種[1]。Zhang等[9]通過轉(zhuǎn)基因苜蓿研究也表明，鹽脅迫下轉(zhuǎn)TaNHX苜蓿植株的K+/Na+比值顯著高于野生型，且轉(zhuǎn)基因植株能夠選擇性吸收K+，減少胞質(zhì)Na+，增強耐鹽性[9]；轉(zhuǎn)甜瓜MIRK擬南芥植株的K+/Na+是對照的2倍，相對電導率為對照植株的57.7%，且耐鹽性得到顯著提高[10]?？梢?，植物通過調(diào)節(jié)根部不同的離子吸收途徑，保持體內(nèi)較高的K+/Na+，從而保證植物在高鹽環(huán)境中更好的生存。

K+吸收主要包括內(nèi)向整流K+通道KIRCs和外向整流K+通道KORCs[11]。KIRCs被質(zhì)膜超極化激活，鹽脅迫下能介導K+和Na+內(nèi)流；而KORCs在質(zhì)膜去極化時被激活，可同時介導K+外流和Na+內(nèi)流[12]。Schachtman等[13]發(fā)現(xiàn)NaCl引起小麥質(zhì)膜去極化、K+外流，Na+順電化學勢梯度內(nèi)流，是鹽脅迫下Na+進入胞內(nèi)的重要途徑。鉀載體蛋白屬于高親和K吸收系統(tǒng)，在根際K+濃度小于0.1 mmol/L時介導K+吸收，最常見的是KUP/HAK/KP家族蛋白，在多種植物中存在，大麥HAK是最早發(fā)現(xiàn)的調(diào)控K+吸收的高親和吸收載體蛋白[14]。高親和系統(tǒng)還包括一些具有鈉運輸功能或鉀鈉共轉(zhuǎn)運功能的家族，比如HKT和NHX家族，其中NHX家族是Na+/H+和K+/H+逆向轉(zhuǎn)運體[15-16]，HKT家族在植物中表達量較低，可以介導K+、Na+共轉(zhuǎn)運，尤其是在K+缺少時，可以吸收Na+來代替K+的作用。Shen等[17]和Wang等[18]對水稻OsHAK21和OsHKT1的研究發(fā)現(xiàn)，HAK定位于根中的木質(zhì)部薄壁組織和內(nèi)皮層的通道細胞，高NaCl脅迫誘導表達量明顯上升，具有K+吸收特性，在維持鹽脅迫下體內(nèi)K+/Na+中起重要作用；而HKT定位于水稻葉片韌皮部，在鹽脅迫下韌皮部中轉(zhuǎn)運Na+，以減少光合組織中的Na+毒害。

無論是離子通道還是轉(zhuǎn)運蛋白，離子轉(zhuǎn)運均依賴膜上H+-ATPase和H+-PPases水解ATP或焦磷酸[19]。H+-PPase廣泛存在于多種植物膜上，最早在液泡膜上發(fā)現(xiàn)，近年來在質(zhì)膜上被報道[20]。Yu等[1]對甘薯耐鹽性研究發(fā)現(xiàn)，耐鹽性高的甘薯根中質(zhì)膜H+-ATPase基因表達水平和H+外流更強，H+-ATPase的上調(diào)有助于減少鉀離子外流。質(zhì)膜Na+外流和液泡膜的Na+區(qū)隔化均由質(zhì)膜H+-ATPase、液泡膜H+-ATPase和H+-PPase提供能量[21]。

盡管近年來對鹽脅迫下作物膜系統(tǒng)上K+運輸途徑的研究較多，但是鹽脅迫下不同耐鹽性小麥K+吸收途徑的差異性方面報道不多。為此本試驗選取耐鹽性不同的2個小麥品種，借助不同離子吸收抑制劑處理，通過測定并分析鹽脅迫下不同品種K+、Na+含量及其比值以及質(zhì)膜相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白活性及其變化，以期探明鹽脅迫下耐鹽性不同的小麥根系K+吸收的異同性。

1 材料和方法

1.1試驗材料

供試小麥品種為滄6005(耐鹽品種)和矮抗58(鹽敏感品種)，由滄州市農(nóng)林科學院提供。

1.1.1 小麥幼苗培養(yǎng) 精選大小一致、籽粒飽滿的小麥種子，清水沖洗干凈，經(jīng)0.1%HgCl2浸泡10 min表面消毒后，沖洗干凈，室溫浸泡12 h，轉(zhuǎn)雙層濾紙上于黑暗中催芽，待根長至1 cm時播至塑料盆紗網(wǎng)上，用Hoagland營養(yǎng)液水培，培養(yǎng)室溫度22～25 ℃，相對濕度60%～70%，光照時間晝夜16 h/8 h，光照強度300 μmol/(m2·s)，通氣泵24 h通氣。

1.1.2 小麥幼苗處理 小麥幼苗長至二葉一心時，分別進行如下處理：250 mmol/L NaCl根部處理，分別于處理后1，3，5，7 d剪取根部，測定K+和Na+含量，以正常生長的小麥作為對照；先用4 mmol/L四乙基氯化銨(Tetraethylammonium chloride，TEA，鉀離子通道抑制劑)、1 mmol/L N-乙基馬來酰亞胺(N-Ethylmaleimide，NEM，鉀轉(zhuǎn)運載體抑制劑)和2.3 mmol/L Ba(NO3)2(NSCCs抑制劑)[7]分別預(yù)處理12 h，再用250 mmol/L NaCl處理，處理后7 d剪取根系，用蒸餾水快速洗去表面培養(yǎng)液，濾紙吸干表面水分，部分烘干用于離子含量測定，剩余部分置于液氮速凍，-80 ℃保存，用于質(zhì)膜蛋白提取。每個處理均設(shè)正常生長的小麥作為對照。

1.2測定指標與方法

1.2.1 鉀鈉離子含量測定 分別剪取根系，放入105 ℃干燥箱中殺青10 min，再于80 ℃烘箱中烘干至恒重，干樣經(jīng)球磨機(型號：MM400，購自Retsch公司)研成粉末，用原子吸收光譜法測定K+和Na+含量[9]。

1.2.2 質(zhì)膜蛋白提取和純化 小麥根系質(zhì)膜蛋白的提取和純化參考Zhang等[9]和周小華等[22]的方法，使用Bradford比色法測定質(zhì)膜蛋白的濃度，測定質(zhì)膜蛋白H+-ATPase和H+-PPase的活性。稱取干凈的小麥根5 g，在液氮中迅速研磨成粉末，轉(zhuǎn)入EP管，加入提取液10 mL，4 ℃、5 000 r/min離心20 min，上清液以4 ℃、18 000 r/min離心35 min，棄上清；沉淀用1 mL懸浮液溶解，把懸浮好的勻漿小心平鋪到兩相液表面，4 ℃、1 150 r/min離心10 min；將上清液轉(zhuǎn)至EP管中，用稀釋液稀釋5倍，4 ℃、28 800 r/min離心40 min，棄上清；沉淀用稀釋液懸浮，即為質(zhì)膜微囊制劑。檢測蛋白濃度，分裝并于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

提取液配制：蔗糖300 mmol/L、Hepes 50 mmol/L、EDTA 8 mmol/L、PMSF 2 mmol/L、DTT 4 mmol/L(使用前加入)、PVPP 1.5%、BSA 0.2%，Tris調(diào)pH值為7.0；懸浮液配制：蔗糖300 mmol/L、KH2PO45 mmol/L、KCl 5 mmol/L、EDTA 0.1 mmol/L、DTT 1 mmol/L；兩相液配制：DextranT500 6.2%、PEG3350 6.2%，用懸浮液溶解；稀釋液配制：蔗糖 300 mmol/L、Hepes 5 mmol/L、DTT 1 mmol/L，用Tris調(diào)pH值為7.0。

將50 μL質(zhì)膜蛋白加入到0.5 mL反應(yīng)體系中啟動反應(yīng)，反應(yīng)體系成分包括：100 mmol/L Hepes、20 mmol/L MgSO4、500 mmol/L KNO3、5mmol/L NaN3和1 mmol/L鉬酸銨，以50 μL 20 mmol/L ATP-Tris(pH值7.5)啟動反應(yīng)，混勻后于37 ℃反應(yīng)20 min，再于100 ℃煮沸10 min終止反應(yīng)，取反應(yīng)液0.2 mL在黑暗處于5 mL顯色體系中進行顯色反應(yīng)15 min，顯色體系成分：0.5 mol/L NaHCO30.8 mL、顯色劑0.5 mL、ddH2O 3.5 mL，分光光度計在OD600測定H+-ATPase活性，將37 ℃反應(yīng)條件下、1 min內(nèi)每毫克質(zhì)膜蛋白催化ATP分解釋放出無機磷酸的微摩爾數(shù)作為1個單位的酶活性。將啟動反應(yīng)的20 mmol/L ATP-Tris替換為3 mmol/L Na4PPi即可測定H+-PPase活性。

顯色劑配制：在400 mL水中緩慢加入208.3 mL濃硫酸，冷卻至室溫，同時取20 g鉬酸銨溶于60 ℃水中，然后將冷卻的硫酸加入鉬酸銨溶液中，不斷攪拌，再加入100 mL 0.5%的酒石酸銻鉀溶液，定容至1 L，保存于棕色瓶中。使用前取100 mL溶解1.5 g抗壞血酸即為顯色劑。

1.2.3 K+/H+轉(zhuǎn)運載體活性測定 參考Lin等[23]熒光淬滅法，將100 μg質(zhì)膜蛋白加入2 mL反應(yīng)體系中，反應(yīng)體系內(nèi)含250 mmol/L蔗糖、100 mmol/L KNO3、1 mmol/L NaN3、3 mmol/L MgSO4、20 mmol/L N-三(羥甲基)甲基甘氨酸和5 μmol/L吖啶橙，用Tris調(diào)pH值為7.5，用ATP-Tris啟動反應(yīng)，終濃度為3 mmol/L，用日立F-4600型熒光分光光度計記錄熒光淬滅值ΔF，激發(fā)光為495 nm，發(fā)射光為540 nm，狹縫為2.5 nm。當熒光值穩(wěn)定時，加入終濃度為3 mmol/L的EGTA，螯合Mg2+清除質(zhì)膜H+-ATPase活性，迅速加入葡萄糖酸鉀使其終濃度為20 mmol/L，記錄熒光恢復值ΔF’，用1 μg質(zhì)膜蛋白每分鐘產(chǎn)生的熒光淬滅值ΔF’/ΔF來表示K+/H+轉(zhuǎn)運載體活性。

1.3數(shù)據(jù)分析

使用Excel對數(shù)據(jù)進行整理，SPSS 19.0 進行單因素方差分析，Turkey檢驗法進行多重比較和差異顯著性分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1鹽脅迫下不同耐鹽小麥根系K+/Na+比值

通過對250 mmol/L NaCl脅迫下不同耐鹽小麥根系K+/Na+比值的變化分析發(fā)現(xiàn)(圖1)，正常生長條件下，滄6005根系K+/Na+比值略高于矮抗58；隨著NaCl處理時間延長，兩品種根系K+/Na+比值均呈逐漸降低趨勢，處理第7 天時，滄6005比處理前降低58.91%，矮抗58比處理前降低74.57%，滄6005的K+/Na+比值顯著高于矮抗58，說明滄6005在NaCl處理下能保持體內(nèi)較高的K+/Na+比值。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。表1-2、圖2-4同。Different lowercases show the significant difference (P<0.05). The same as Tab.1-2，F(xiàn)ig.2-4.

2.2不同鉀離子吸收抑制劑對K+/Na+的抑制率

表1可見，正常條件下，滄6005和矮抗58根系K+/Na+比值約為1.44和1.96，隨植株生長逐漸升高，第7天時，分別達到5.32和7.97，變化率為269.85%和306.58%；鉀離子通道抑制劑TEA 和NSCCs抑制劑Ba(NO3)2處理，均抑制K+/Na+比值的變化率，Ba(NO3)2抑制效果更明顯，矮抗58和滄6005中變化率分別為158.86%和179.01%。當用NEM抑制鉀載體活性時，兩品種K+/Na+比值的升高幅度卻顯著高于對照(P<0.05)，變化率依次為393.64%，464.42% 。

表2可見，鹽脅迫下，當鉀離子通道被抑制時，兩品種的K+/Na+下降幅度低于單獨鹽處理(P<0.05)；鉀載體活性被抑制時，滄6005和矮抗58的K+/Na+的變化率顯著高于對照(P<0.05)，其中矮抗58比單獨鹽處理高7.64個百分點，滄6005比對照高12.22個百分點；不同于單獨鹽處理，當NSCCs途徑被抑制時，滄6005的K+/Na+變化幅度顯著高于鹽處理(P<0.05)，而矮抗58的K+/Na+變化幅度顯著低于鹽處理(P<0.05)。

表1 正常條件下不同抑制劑預(yù)處理對小麥根系K+/Na+比值的影響Tab.1 Effects of K+ absorption inhibitors treatment on K+/Na+ ratios in wheat roots

表2 250 mmol/L NaCl脅迫下不同抑制劑預(yù)處理對小麥根系K+/Na+比值的影響Tab.2 Effects of K+ absorption inhibitors pretreatment and NaCl treatment on K+/Na+ ratios in wheat roots

2.3不同鉀離子吸收抑制劑處理對質(zhì)膜H+-ATPase活性的影響

從圖2-A可見，對于單個品種而言，正常條件下不同處理盆中幼苗根系H+-ATPase活性相當，不同品種比較，小麥滄6005質(zhì)膜H+-ATPase活性高于矮抗58；隨植株生長，H+-ATPase活性均升高，矮抗58上升幅度更大。單獨TEA處理可明顯降低矮抗58酶活性(P<0.05)，而對滄6005酶活性影響不明顯；250 mmol/L NaCl處理顯著第7天降低兩品種質(zhì)膜H+-ATPase活性(P<0.05)，其中滄6005降低58.2%，矮抗58降低76.8%；TEA和NaCl聯(lián)合處理同時降低兩品種質(zhì)膜H+-ATPase酶活性，但與單獨NaCl處理相比差異不明顯。

圖2 250 mmol/L NaCl脅迫下不同抑制劑處理對不同耐鹽性小麥根系質(zhì)膜H+-ATPase活性的影響Fig.2 Effects of 250 mmol/L NaCl and TEA/NEM/Ba(NO3)2 on the activities of root plasma membrane H+-ATPase in wheat roots of salt-tolerant and sensitive wheat seedlings

單獨NEM、NaCl以及NEM和NaCl聯(lián)合處理(圖2-B)，均能顯著降低兩品種根系質(zhì)膜H+-ATPase酶活性(P<0.05)，與單獨NaCl處理相比，當NEM和NaCl聯(lián)合處理后，滄6005酶活性顯著降低(P<0.05)，矮抗58沒有明顯差異，與單獨NEM處理相比也沒有明顯差異。

單獨Ba(NO3)2處理(圖2-C)，滄6005和矮抗58的質(zhì)膜H+-ATPase活性與各自的正常生長對照相比均沒有明顯的差異；單獨NaCl處理以及Ba(NO3)2和NaCl聯(lián)合處理后，兩品種質(zhì)膜H+-ATPase活性與正常生長對照相比均顯著下降(P<0.05)，而Ba(NO3)2和NaCl聯(lián)合處理后的矮抗58和滄6005酶活性與單獨NaCl處理無明顯差異。

2.4不同抑制劑處理對根系質(zhì)膜H+-PPase活性的影響

從圖3-A可見，對于單個品種而言，處理前不同處理盆中幼苗根系H+-PPase活性相當。正常條件下，兩品種根系質(zhì)膜H+-PPase活性差異不大，隨植株生長，酶活性略有升高，滄6005升高幅度較大。TEA處理均使得兩品種酶活性升高；250 mmol/L NaCl處理，矮抗58質(zhì)膜H+-PPase活性顯著高于對照(P<0.05)，而滄6005酶活性顯著低于對照(P<0.05)，數(shù)值接近處理前對照值；TEA和NaCl聯(lián)合處理對兩品種H+-ATPase酶活性影響不明顯。

單獨NEM處理顯著降低兩品種質(zhì)膜H+-PPase活性(P<0.05)，矮抗58酶活性降低約85.4%，滄6005酶活性降低約71.4%(圖3-B)； NEM和NaCl聯(lián)合處理后，酶活性顯著下降(P<0.05)，數(shù)值略高于單獨NEM處理。

單獨Ba(NO3)2處理顯著降低矮抗58酶活性(P<0.05)(圖3-C)；Ba(NO3)2和NaCl聯(lián)合處理后，矮抗58酶活性接近單獨Ba(NO3)2，而滄6005酶活性接近單獨NaCl處理，品種間呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律。

2.5不同抑制劑處理對質(zhì)膜K+/H+轉(zhuǎn)運蛋白的影響

由圖4可見，對于單個品種而言，處理前不同處理盆中幼苗根系K+/H+轉(zhuǎn)運蛋白活性相當。正常條件下，滄6005質(zhì)膜K+/H+轉(zhuǎn)運蛋白活性高于矮抗58，隨植株生長，酶活性略有升高；1 mmol/L NEM處理7 d后，矮抗58小麥根質(zhì)膜K+/H+轉(zhuǎn)運蛋白活性顯著低于正常生長對照(P<0.05)，滄6005則與其正常生長的對照組無明顯差異；250 mmol/L NaCl處理7 d后，質(zhì)膜K+/H+轉(zhuǎn)運蛋白活性變化不同，矮抗58品種根蛋白活性在第7天顯著低于對照(P<0.05)，滄6005品種根蛋白活性顯著高于對照(P<0.05)；NEM和NaCl聯(lián)合處理后，兩品種質(zhì)膜K+/H+轉(zhuǎn)運蛋白活性均顯著下降(P<0.05)，其中與各自單獨NaCl處理相比，矮抗58下降約29.1%，滄6005蛋白下降達77.3%。

圖3 250 mmol/L NaCl脅迫下不同抑制劑處理對不同耐鹽性小麥根系質(zhì)膜H+-PPase活性的影響Fig.3 Effects of 250 mmol/L NaCl and TEA/NEM/Ba(NO3)2 on the activities of root plasma membrane H+-PPase in wheat roots of salt-tolerant and sensitive wheat seedlings

3 討論

K+/Na+比值是研究植物耐鹽性中一個非常重要的指標，在高NaCl環(huán)境下，植物體通過一系列應(yīng)激反應(yīng)和離子吸收來保證體內(nèi)足夠的K+，維持細胞的新陳代謝[24]。一些耐鹽性很高的植物，可能具有更好的保K+排Na+的能力，即使處于高NaCl環(huán)境，胞質(zhì)仍可維持一定的K+/Na+比[25]。

圖4 250 mmol/L NaCl和NEM聯(lián)合處理對小麥根系K+/H+蛋白活性的影響Fig.4 Effects of 250 mmol/L NaCl and NEM on the activities of root K+/H+antiporter in wheat roots of salt-tolerant and sensitive wheat seedlings

很多研究證明，細胞通過Na+外排和液泡Na+區(qū)隔化來提高耐鹽性。Zhu[26]的研究發(fā)現(xiàn)，SOS家族主要參與質(zhì)膜對Na+的外排和Ca2+介導的耐鹽信號轉(zhuǎn)導途徑，NHX家族參與液泡膜上Na+的轉(zhuǎn)運，在水稻[27-28]、苜蓿[9]、玉米[29]和小麥[15，30]中對NHX家族的研究發(fā)現(xiàn)，液泡膜通過Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運體的作用將Na+儲存在液泡中，降低細胞質(zhì)內(nèi)的Na+濃度，提高耐鹽性。與Na+相比，K+是植物必需的大量元素，植物體具有多樣且高效的K+吸收途徑[31]。處于外界高Na+環(huán)境中的植物根系可能更依賴于加強對K+的吸收或者液泡對K+的外排，來維持胞質(zhì)內(nèi)的高K+/Na+[32]。本試驗結(jié)果顯示，250 mmol/L NaCl處理后，滄6005根中的K+/Na+比值降低58.91%，明顯少于矮抗58的74.57%。比較離子含量測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NaCl脅迫下2種小麥根中Na+增加量沒有明顯區(qū)別，滄6005根中的Na+略低于矮抗58，但對K+的吸收卻明顯高于矮抗58，從而維持較高的K+/Na+比值，可見耐鹽品種通過增加K+減少Na+來維持胞內(nèi)離子平衡，K+增加可能是主要原因。

K+吸收途徑主要有鉀離子通道、鉀轉(zhuǎn)運載體和NSCCs，各個途徑對K+的親和力不同[33]。一般植物根系細胞內(nèi)都能夠聚集高于外界土壤的K+來維持滲透壓，這很大程度上依賴細胞質(zhì)膜上承擔主動運輸任務(wù)的鉀轉(zhuǎn)運載體[34]。鉀離子通道和NSCCs作為被動運輸，依賴跨膜的電位差，當植物根系處于高Na+環(huán)境時，低親和力的離子通道途徑對離子的運輸更快，可能在維持細胞內(nèi)正常滲透壓過程中發(fā)揮作用，但是由于其對陽離子分辨能力較低，會導致胞內(nèi)K+和Na+的失衡。本試驗選擇3種不同抑制劑來抑制相應(yīng)的鉀吸收途徑，抑制率越高，說明小麥對相應(yīng)的鉀吸收途徑越依賴，該途徑對鉀吸收的貢獻越大。對K+/Na+比值研究結(jié)果表明，正常條件下鹽敏感品種和耐鹽品種都主要以鉀轉(zhuǎn)運載體作為主要的K+吸收途徑，而鉀離子通道和NSCCs在鉀轉(zhuǎn)運載體途徑被抑制時，利用細胞內(nèi)外的陽離子濃度差大量吸收K+，另外NSCCs可能在敏感品種中更多參與K+吸收[25]。

用抑制劑和NaCl聯(lián)合處理發(fā)現(xiàn)，在鉀轉(zhuǎn)運載體被抑制時，兩品種均表現(xiàn)出最大的K+/Na+比值下降率，在鉀離子通道被抑制時K+/Na+比值下降率最小，說明在NaCl脅迫下小麥的K+吸收主要依賴鉀轉(zhuǎn)運載體。對鉀載體被抑制時下降率差值的比較發(fā)現(xiàn)，耐鹽品種下降程度要大于敏感品種，進一步說明耐鹽品種中鉀載體途徑占據(jù)著更加重要的地位。對于NSCCs而言，2個品種是不同的，在NSCCs被抑制時，敏感品種K+/Na+比值下降率降低，耐鹽品種K+/Na+比值下降率升高，說明敏感品種中NSCCs是Na+進入的途徑之一，耐鹽品種Na+進入細胞可能主要通過鉀離子通道。丁同樓等[7]發(fā)現(xiàn)NSCCs是鹽脅迫下小麥吸收Na+的主要途徑，即NSCCs對K+、Na+區(qū)分度要明顯低于鉀離子通道和轉(zhuǎn)運載體，K+的吸收更依賴于鉀離子通道和鉀轉(zhuǎn)運載體途徑。通過以上分析推測，耐鹽品種滄6005可能通過提高鉀轉(zhuǎn)運載體途徑活性即可維持K+/Na+平衡、進而在NaCl早期維持細胞內(nèi)的K+穩(wěn)態(tài)；而敏感品種的鉀轉(zhuǎn)運載體活性較低，導致體內(nèi)K+降低，造成質(zhì)膜內(nèi)外較大的K+濃度差，而Na+順著離子濃度梯度通過鉀離子通道和NSCCs進入胞內(nèi)。

植物體吸收K+離不開質(zhì)膜上質(zhì)子泵為其提供膜內(nèi)外的質(zhì)子梯度和電勢差[19]。其中質(zhì)膜H+-ATPase是一種非常重要的質(zhì)膜蛋白，被稱為“主宰酶”，在維持細胞質(zhì)pH值、跨膜質(zhì)子驅(qū)動力和細胞伸長生長等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。H+-PPase最早發(fā)現(xiàn)于液泡膜上，最近研究發(fā)現(xiàn)在擬南芥的質(zhì)膜上也存在H+-PPase，可能與植物抗逆有關(guān)[35]，質(zhì)子泵活性與植物耐鹽性存在密切聯(lián)系。

本試驗結(jié)果顯示，250 mmol/L NaCl處理后小麥根部質(zhì)膜H+-ATPase活性明顯降低，且矮抗58的下降程度要大于滄6005，說明前者對NaCl更加敏感。NEM和NaCl聯(lián)合處理，兩品種的酶活性下降趨勢更加明顯，但敏感品種下降程度反而小于耐鹽品種，與單獨NaCl脅迫相反，說明鉀轉(zhuǎn)運載體可能在耐鹽品種中發(fā)揮著更大的作用，一旦該途徑被抑制，能量和H+的需求量下降，H+-ATPase活性、H+-PPase活性和K+吸收都會降低，進一步證明了上述結(jié)果。另外2種抑制劑處理的結(jié)果顯示，在NaCl和抑制劑聯(lián)合作用下酶活性并沒有進一步降低，說明鉀離子通道和NSCCs對質(zhì)子泵活性的依賴程度較低，因為正常條件下離子通道運輸陽離子主要依賴質(zhì)子泵提供的胞內(nèi)外H+濃度差和電位差，而NaCl脅迫下胞外存在大量陽離子，離子通道不再需要胞外H+即可打開，因此，質(zhì)子泵活性并沒有因為這2個途徑被抑制而降低。

通過測定質(zhì)膜上K+/H+轉(zhuǎn)運蛋白活性表明，250 mmol/L NaCl處理7 d后，耐鹽品種小麥根部質(zhì)膜K+/H+轉(zhuǎn)運蛋白活性明顯高于正常生長，敏感品種則明顯低于正常生長，說明耐鹽品種可能通過增加質(zhì)膜K+/H+轉(zhuǎn)運蛋白活性來保持較高的耐鹽能力；而NEM和NaCl聯(lián)合處理后，滄6005的K+/H+轉(zhuǎn)運蛋白活性下降程度要明顯大于矮抗58，說明鹽脅迫下抑制劑對滄6005的抑制作用更強，滄6005對鉀轉(zhuǎn)運載體途徑的依賴程度更大。鉀轉(zhuǎn)運載體作為高親和鉀吸收途徑，通過主動運輸對K+的吸收具有高度的專一性[36]。鹽脅迫環(huán)境下，植物根系處于一個高Na+(低K+)環(huán)境，大量Na+進入根系細胞內(nèi)，K+/Na+降低，植物體主要通過主動運輸來加強對K+的吸收[37-38]。在外界高Na+環(huán)境下，離子通道可能會成為Na+進入胞內(nèi)的一個主要途徑[7]，同時由于其對K+的親和性較低，如果通道門控打開，大量Na+迅速進入胞內(nèi)，會引起胞內(nèi)Na+濃度過高，破壞胞內(nèi)離子平衡。因此，在鹽脅迫條件下植物體更傾向選擇親和性和分辨能力更高的轉(zhuǎn)運載體途徑來增加K+的吸收，從而達到胞質(zhì)內(nèi)較高的K+/Na+。

小麥作為一種非耐鹽作物，對NaCl比較敏感，本研究通過對不同鉀吸收途徑的研究發(fā)現(xiàn)，小麥主要通過鉀轉(zhuǎn)運載體來吸收K+，通過離子通道途徑來吸收Na+。在高NaCl環(huán)境中，細胞質(zhì)膜質(zhì)子泵主要為鉀轉(zhuǎn)運載體途徑提供能量，而鉀轉(zhuǎn)運載體途徑活性的提高對于維持K+/Na+具有重要作用。

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EffectsofK+AbsorptionInhibitorsonK+/Na+RatiosandActivitiesofPlasmaMembraneProteinsunderSaltStressinTriticumaestivumL.

ZHANG Huaning1，LI Mengjun2，GUO Xiulin1，ZHANG Yanmin1，LIU Zihui1

(1.Institute of Genetics and Physiology，Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Plant Genetic Engineering Center of Hebei Province，Shijiazhuang 050051，China;2.Shijiazhuang Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Shijiazhuang 050000，China)

In order to examine the effects of different K+uptake pathways on the mechanism of salt-tolerance of wheat. Winter wheat cultivars salt-tolerant C6005 and salt-sensitive AK58 were used to investigate the contents of K+and Na+and K+/Na+ratios and plasma membrane proteins activities under NaCl stress and co-treatments with TEA (Tetraethylammonium chloride，K+passway inhibitor)，NEM (N-Ethylmaleimide，transporter inhibitor) and Ba (NO3)2(NSCCs inhibitor)respectively in the study.The major results were as follows：250 mmol/L NaCl treatment for 7 days significantly (P<0.05) decreased the K+/Na+ratios of root both salt-tolerant and sensitive cultivars compared with their controls，and C6005 could retain higher K+/Na+ratios than AK58 under NaCl stress. Comparatively，NEM had greater inhibition on both K+contents and K+/Na+ratios than TEA and Ba(NO3)2in both salt-tolerant and sensitive cultivars. Under NaCl stress，when K+transporters were inhibited，K+/Na+ratios of C6005 were decreased more obviously than that of AK58，the activities of plasma membrane H+- ATPase and H+-PPase in both cultivars were decreased，and the change extend was larger in C6005. Meanwhile，the activities of K+/H+transporters in C6005 were inhibited more violently than that in AK58 when pretreated with NEM under stress. The results suggested that K+transporters were the primary approach for K+absorption under salt stress in wheat，especially in salt-tolerant cultivar，and the energy mainly came from H+-ATPase and H+-PPase of proton pump of plasma membranes under salt stress. This work will provide theoretical basis for further analyzing the mechanism of salt-tolerance of wheat.

Wheat; Salt stress; K+/Na+; Plasma membrane proteins; K+absorption

2017-08-02

河北省自然科學基金項目(C2015301014)；河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程項目(2017038997；F17C10006)

張華寧(1988-)，男，河北平山人，助理研究員，碩士，主要從事作物抗逆生理與分子生物學研究。

劉子會(1978-)，女，河北棗強人，副研究員，碩士，主要從事作物抗逆生理與分子生物學研究。

S512.01

A

1000-7091(2017)05-0154-09

10.7668/hbnxb.2017.05.024