低穩(wěn)定性綠色熒光蛋白EGFP-PEST的載體構(gòu)建及表達(dá)驗(yàn)證

袁龍，鄭幽，范杰，梁劍青，牛祖彪，高麗華，黃紅艷，陳昭烈，管靜芝，孫強(qiáng)

1.山西醫(yī)科大學(xué) 第二臨床醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030001；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100071；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，腫瘤治療性疫苗北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100038；4.解放軍第309醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，北京 100091

低穩(wěn)定性綠色熒光蛋白EGFP-PEST的載體構(gòu)建及表達(dá)驗(yàn)證

袁龍1,2，鄭幽2，范杰2，梁劍青2，牛祖彪2，高麗華2，黃紅艷3，陳昭烈2，管靜芝4，孫強(qiáng)2

1.山西醫(yī)科大學(xué) 第二臨床醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030001；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100071；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，腫瘤治療性疫苗北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100038；4.解放軍第309醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，北京 100091

目的：構(gòu)建含有蛋白降解基序PEST序列的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）融合基因表達(dá)載體pQCXIP-EGFPPEST-N1，并檢測(cè)其對(duì)蛋白穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)。方法：以NFATx6-mPro-EGFP-PEST-YES為模板，PCR擴(kuò)增EGFP-PEST序列，克隆入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pQCXIP-EGFP-N1構(gòu)建pQCXIP-EGFP-PEST-N1，病毒包裝后感染293FT細(xì)胞獲得穩(wěn)定細(xì)胞系；用蛋白酶體抑制劑MG-132處理細(xì)胞，Western印跡檢測(cè)EGFP的表達(dá)變化。結(jié)果：構(gòu)建獲得逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pQCXIP-EGFP-PEST-N1，感染293FT細(xì)胞后，與對(duì)照組相比，EGFP表達(dá)顯著降低，并且該降低可被MG-132處理逆轉(zhuǎn)。結(jié)論：構(gòu)建了EGFP-PEST蛋白的表達(dá)載體，PEST可以介導(dǎo)EGFP蛋白發(fā)生蛋白酶體依賴(lài)的降解。為實(shí)現(xiàn)基因編輯效果的可視化篩選奠定了基礎(chǔ)。

PEST序列；基因編輯；蛋白酶體；綠色熒光蛋白

PEST序列是許多短周期蛋白中相對(duì)保守的一段區(qū)域，它富含脯氨酸（P）、谷氨酸（E）、絲氨酸（S）、蘇氨酸（T）、天冬酰胺（N）、谷氨酰胺（Q），兩側(cè)一般由精氨酸和賴(lài)氨酸構(gòu)成。早在1986年，Rogers等通過(guò)對(duì)PEST穩(wěn)定性及序列的研究，推測(cè)PEST可能能夠調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的蛋白表達(dá)水平[1]。隨后越來(lái)越多的研究證明PEST序列可通過(guò)泛素蛋白酶體途徑引起蛋白降解，其主要過(guò)程是：泛素被泛素激活酶（E1）激活后，可轉(zhuǎn)移到泛素結(jié)合酶（E2）并與之結(jié)合，隨后E2與泛素連接酶（E3）共同識(shí)別PEST序列并使其泛素化，最后含泛素化PEST序列的蛋白被26S蛋白酶體降解[2-3]。去除或突變PEST序列均會(huì)增強(qiáng)蛋白的穩(wěn)定性，減少蛋白的降解[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)含PEST序列的蛋白與其他蛋白在物理結(jié)構(gòu)上發(fā)生緊密結(jié)合時(shí)，也會(huì)增加其結(jié)合蛋白的降解[6]。但并非所有含PEST序列的蛋白都會(huì)直接通過(guò)泛素蛋白酶體途徑降解，一些PEST序列只有在被激酶磷酸化后才會(huì)通過(guò)泛素蛋白酶體途徑引起蛋白降解；并且PEST序列中磷酸化位置的不同也會(huì)產(chǎn)生不同的結(jié)果，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子PEST序列中的酪氨酸位點(diǎn)被磷酸化后使蛋白更加穩(wěn)定，而它的絲氨酸位點(diǎn)被磷酸化后會(huì)引起蛋白降解[7]。因此，可以通過(guò)融合PEST序列來(lái)調(diào)節(jié)特定蛋白的表達(dá)水平。

在進(jìn)行基因編輯時(shí)，我們常使用增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）作為報(bào)告分子。但由于EGFP蛋白相對(duì)穩(wěn)定，降低了其對(duì)微弱基因編輯效果的報(bào)告敏感性。為此，我們嘗試構(gòu)建EGFP-PEST融合蛋白表達(dá)載體，利用PEST序列可通過(guò)泛素蛋白酶體途徑降解蛋白的功能，加快EGFP的降解，從而使得EGFP能夠更為靈敏地指示基因編輯效果，為實(shí)現(xiàn)基因編輯的可視化篩選奠定基礎(chǔ)。

為了獲得穩(wěn)定表達(dá)EGFP-PEST的細(xì)胞系，我們構(gòu)建了逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pQCXIP-EGFP-PESTN1，用所產(chǎn)生的病毒感染293FT細(xì)胞建立穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，以此為基礎(chǔ)檢測(cè)PEST序列對(duì)EGFP表達(dá)水平的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

人胚腎細(xì)胞293FT來(lái)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)（采用Hyclones公司的DMEM-High Glucose培養(yǎng)基培養(yǎng)）；pQCXIP-EGFP-N1和NFATx6-mPro-EGFPPEST-YES載體均由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；蛋白酶體抑制劑MG-132、EGFP抗體購(gòu)自Sigma公司；胎牛血清購(gòu)自德國(guó)PAN公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購(gòu)自田根生化科技有限公司；Q5高保真DNA聚合酶、限制性?xún)?nèi)切酶、T4DNA連接酶均購(gòu)自NEB公司；pGEM-T載體購(gòu)自Promega公司；脂質(zhì)體LipofectAMINE 2000購(gòu)自Invitrogen Technolo?gy公司；引物由北京博邁德生物技術(shù)有限公司合成；測(cè)序由北京擎科生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 EGFP-PEST序列的擴(kuò)增及pQCXIP-EGFPPEST載體的構(gòu)建

以NFATx6-mPro-EGFP-PEST-YES載體為模板，設(shè)計(jì)上游引物（5'-ACCGGTCGCCACCATGGT GAGCAAGG-3'）和下游引物（5'-CAATTGTTAGA CGTTGATCCTGGCGCTG-3'），利用PCR擴(kuò)增獲得EGFP-PEST的編碼序列（擴(kuò)增條件：98℃預(yù)變性30s；98℃變性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s，循環(huán)30次；72℃終延伸120s），PCR反應(yīng)采用Q5高保真DNA聚合酶進(jìn)行。用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，Taq酶加A后連入pEGM-T載體，雙酶切及測(cè)序結(jié)果鑒定正確后分別用AgeⅠ/MfeⅠ雙酶切，回收目的片段連入pQCXIP-EGFP-N1載體的AgeⅠ/MfeⅠ位點(diǎn)，獲得逆轉(zhuǎn)錄表達(dá)載體pQCXIP-EGFP-PEST-N1（圖1）。

1.3 病毒包裝、感染

將1×106/孔293FT細(xì)胞接種于六孔板，12h后進(jìn)行病毒包裝。將400ng目的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體（pQCXIP-EGFP-N1和pQCXIP-EGFP-PESTN1）與200ng Gag/Pol、250ng VSV-G加入100μL Opti-MEM中 ，再將2.5μL LipofectAMINE 2000加入100μL Opti-MEM中，靜置5min；將上述2種液體輕輕混勻，室溫放置25min，向混合液中補(bǔ)加800μL Opti-MEM，最后將混合液加入已接種細(xì)胞的六孔板中。6h后更換成有血清的DMEM培養(yǎng)基，24、48h后分別收取病毒上清，用4.5μm濾器過(guò)濾備用。靶細(xì)胞293FT按2×105/孔接種六孔板，12h后取上述病毒上清1mL+1mL全培養(yǎng)基+2μL Polybrene混合后感染293FT細(xì)胞，6h后換2mL新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)，感染后24h用1μg/mL嘌呤霉素篩選3d，獲得穩(wěn)定細(xì)胞系。

1.4 Western印跡檢測(cè)

獲得穩(wěn)定細(xì)胞系后，將細(xì)胞按照5×105/孔接種于六孔板中，12h給予MG-132（終濃度為4μmol/L）處理，24h后收集細(xì)胞蛋白（每孔加入100μL含蛋白酶抑制劑和蛋白磷酸酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，冰上裂解30min后于4℃、12 000r/min離心15min，取上清進(jìn)行蛋白定量，各樣品按照上樣量10μg進(jìn)行蛋白電泳并轉(zhuǎn)印至PVDF膜，經(jīng)封閉、一抗過(guò)夜孵育（1∶1000稀釋?zhuān)?、二抗孵育等步驟后進(jìn)行ECL顯色）。

2 結(jié)果

2.1 pQCXIP-EGFP-PEST表達(dá)載體的構(gòu)建

以NFATx6-mPro-EGFP-PEST-YES為模板，PCR擴(kuò)增EGFP-PEST的編碼序列，獲得約850bp片段（圖2A），與預(yù)期大?。?43bp）相符，提示擴(kuò)增成功。將目的片段連入pGEM-T載體，挑取2個(gè)克隆測(cè)序，結(jié)果均正確（測(cè)序結(jié)果未示）。將鑒定正確的克隆連入逆轉(zhuǎn)錄載體pQCXIP-EGFP-N1，挑取8個(gè)克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定，得到與預(yù)期相符合的條帶（圖2B），隨后將鑒定正確的克隆送測(cè)序并進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果與預(yù)期相符（圖2C），序列正確（圖2D），提示pQCXIP-EGFPPEST-N1表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖1 pQCXIP-EGFP-PEST-N1表達(dá)載體構(gòu)建示意圖

2.2 PEST序列功能的檢測(cè)

為了檢測(cè)EGFP-PEST融合蛋白中PEST序列的功能，將載體pQCXIP-EGFP-N1和pQCXIPEGFP-PEST-N1進(jìn)行病毒包裝進(jìn)而感染293FT細(xì)胞，獲得穩(wěn)定細(xì)胞系。熒光顯微鏡下觀察2種細(xì)胞的GFP熒光強(qiáng)度，顯示EGFP-PEST的熒光強(qiáng)度明顯低于EGFP（圖3）。提示PEST的融合表達(dá)能夠降低細(xì)胞中EGFP的表達(dá)水平。

2.3 PEST序列作用機(jī)制檢測(cè)

為了檢測(cè)PEST對(duì)EGFP表達(dá)的影響是否通過(guò)泛素蛋白酶體途徑實(shí)現(xiàn)，我們用MG-132處理細(xì)胞，收集蛋白后用Western印跡檢測(cè)EGFP的表達(dá)變化，結(jié)果（圖4）顯示，MG-132處理后EGFPPEST的表達(dá)明顯上調(diào)，而EGFP的表達(dá)水平?jīng)]有明顯改變。說(shuō)明PEST序列對(duì)EGFP蛋白表達(dá)水平的調(diào)節(jié)依賴(lài)于蛋白酶體降解途徑。

3 討論

圖2 EGFP-PEST的PCR擴(kuò)增和表達(dá)載體構(gòu)建

圖3 EGFP-PEST熒光減弱（熒光顯微鏡20×）

圖4 EGFP-PEST的降解依賴(lài)于蛋白酶體通路

蛋白質(zhì)的降解在生物學(xué)過(guò)程中起重要作用，尤其是信號(hào)通路中的一些調(diào)節(jié)蛋白的水解會(huì)激活或失活下游信號(hào)分子，引發(fā)一系列生物反應(yīng)。PEST序列廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)多種蛋白中，它作為泛素蛋白酶體途徑的降解信號(hào)，參與細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、應(yīng)激、代謝、增殖分化等過(guò)程[2,4-5,8]。

在以EGFP作為基因編輯效果報(bào)告分子時(shí)，由于EGFP表達(dá)穩(wěn)定，使得微弱的基因編輯效果難以被有效捕捉。為此，我們構(gòu)建了EGFP-PEST融合蛋白，PEST序列能夠被蛋白酶體識(shí)別，進(jìn)而降解融合表達(dá)的EGFP，使細(xì)胞內(nèi)的EGFP熒光強(qiáng)度顯著減弱甚至消失。較短的半衰期使得EGFP-PEST的水平能夠及時(shí)靈敏地反映新合成蛋白的表達(dá)水平，為基因編輯的可視化篩選奠定了基礎(chǔ)。

PEST在疾病的發(fā)生和治療中也有著關(guān)鍵作用。已有研究報(bào)道，將亨廷頓蛋白抗體編碼序列與PEST融合表達(dá)，可長(zhǎng)時(shí)間而高效地降解亨廷頓蛋白，達(dá)到治療小鼠模型舞蹈病的效果[9]；淋巴細(xì)胞白血病基因1（lymphoblastic leukemia1，LYL1）編碼的蛋白是一種與白血病發(fā)展密切相關(guān)的促腫瘤轉(zhuǎn)錄因子，其蛋白序列中包含PEST序列，并且可通過(guò)泛素蛋白酶體途徑降解，提示PEST序列與白血病的發(fā)生密切相關(guān)[10]；真核翻譯起始因子4E-結(jié)合蛋白會(huì)引起糖尿病誘導(dǎo)的視力障礙，通過(guò)對(duì)這種蛋白序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)其中存在PEST區(qū)域，而當(dāng)PEST上蘇氨酸糖基化時(shí)可阻斷該蛋白通過(guò)泛素蛋白酶體途徑降解，這一結(jié)果提示PEST序列可能與糖尿病誘導(dǎo)的視力障礙發(fā)生有關(guān)[11]。因此，本研究有望為探究疾病機(jī)理提供新的工具。

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Constructing Vector for the Expression of EGFP-PEST,a Modified Enhanced Green FluorescentProtein with Low Stability

YUAN Long1,2,ZHENG You2,FAN Jie2,LIANG Jian-Qing2,NIU Zu-Biao2,GAO Li-Hua2,HUANG Hong-Yan3,CHEN Zhao-Lie2,GUAN Jing-Zhi4*,SUN Qiang2*
1.Second Medical College,Shanxi Medical University,Taiyuan 030001;2.Beijing Institute of Biotechnology,Bei?jing 100071;3.Department of Medical Oncology,Beijing Shijitan Hospital,Capital Medical University,Beijing Key Laboratory of Cancer Therapeutic Vaccine,Beijing 100038;4.Department of Medical Oncology,PLA 309 Hos?pital,Beijing 100091;China
*Co-corresponding authors,GUAN Jing-Zhi,E-mail:jzjz1970@hotmail.com;SUN Qiang,E-mail:sunq@bmi.ac.cn

Objective:To construct retroviral vector pQCXIP-EGFP-PEST-N1 for the expression of EGFP-PEST protein,and examine the effects of PEST motif on EGFP stability.Methods:DNA fragment containing EGFPPEST was amplified by PCR from NFATx6-mPro-EGFP-PEST-YES as template,and then cloned into the retrovi?ral expression vector pQCXIP-EGFP-N1 to generate pQCXIP-EGFP-PEST-N1,which was packaged into retrovirus to infect 293FT cells.Western blot was employed to examine changes at protein level upon treatment of protea?some inhibitor（MG-132）.Results:Compared with pQCXIP-EGFP-N1 virus,retroviral vector of pQCXIP-EGFPPEST-N1 produced significantly lower EGFP in 293FT cells,and MG-132 treatment reverted the expression of EGFP-PEST but not EGFP,suggesting effective PEST-mediated degradation via proteasome.Conclusion:A vector has been constructed to express EGFP-PEST,and PEST motif has been proved to effectively mediate EGFP degra?dation in a proteasome-dependent manner.This work set a basis for visualing target screen in gene edition.

PEST motif;gene edition;proteasome;EGFP

Q78

A

1009-0002（2017）04-0405-05

2017-01-12

國(guó)家自然科學(xué)基金（81572799，31671432）；國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2016YFC1303303）

袁龍（1989- ），男，碩士研究生，（E-mail）1020264077@qq.com；鄭幽（1989- ），女，助理研究員，（E-mail）zhengyousic@163.com

管靜芝，（E-mail）jzjz1970@hotmail.com；孫強(qiáng)，（E-mail）sunq@bmi.ac.cn

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.001