人乳頭瘤病毒31和33亞型L1基因?qū)胨炯稗D(zhuǎn)基因植株的鑒定

孟鳳麗，張改平，劉運(yùn)超，陳玉梅，王聚財(cái)，祁艷華，冉云偉，王愛萍

1.鄭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002

人乳頭瘤病毒31和33亞型L1基因?qū)胨炯稗D(zhuǎn)基因植株的鑒定

孟鳳麗1，張改平2，劉運(yùn)超2，陳玉梅1，王聚財(cái)2，祁艷華1，冉云偉1，王愛萍1

1.鄭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002

目的：結(jié)合水稻胚乳生物反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)，將人乳頭瘤病毒（HPV）31、33亞型的L1蛋白編碼基因?qū)胨荆瑯?gòu)建HPV31 L1、HPV33 L1植物表達(dá)載體，最終實(shí)現(xiàn)其在水稻胚乳表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)。方法：利用生物信息學(xué)方法分析并優(yōu)化合成HPV31及HPV33 L1蛋白編碼基因，將其重組于中間載體pMP3和植物表達(dá)載體pCAMBIA1300中，分別構(gòu)建植物雙元表達(dá)載體pCAMBIA1300-pMP3-HPV-31 L1和pCAMBIA1300-pMP3-HPV-33 L1，采用遺傳轉(zhuǎn)化法經(jīng)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻TP309種子的愈傷組織，經(jīng)共培養(yǎng)、潮霉素篩選和分化再生，獲得潮霉素抗性植株。結(jié)果和結(jié)論：構(gòu)建了HPV31 L1、HPV33 L1的植物表達(dá)載體，經(jīng)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻TP309種子的愈傷組織，獲得轉(zhuǎn)基因植株。

人乳頭瘤病毒L1基因；根癌農(nóng)桿菌；水稻胚乳表達(dá)系統(tǒng)；遺傳轉(zhuǎn)化；植物表達(dá)載體

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，在全球女性癌癥死亡率中居第2位，僅次于乳腺癌[1-2]，全球每年約有50萬新發(fā)病例，約20萬死于宮頸癌。宮頸癌與生殖道人乳頭瘤病毒（human papil?lomavirus，HPV）感染有密切關(guān)系，99.7％以上的宮頸癌病例伴有HPV感染[3]。HPV屬于乳頭瘤病毒科、乳頭瘤空泡病毒A屬，是一類雙鏈小分子DNA病毒，直徑45～55nm，衣殼呈二十面體立體對稱，含72個(gè)衣殼亞單位，沒有囊膜。該病毒有嚴(yán)格的種屬特異性，主要感染人的皮膚和黏膜組織，引起相應(yīng)部位上皮組織的增生性病變[4]。近年來，HPV感染呈明顯增多趨勢，因此HPV預(yù)防性疫苗的研究成為防控宮頸癌研究的熱點(diǎn)[5-6]。重組表達(dá)的HPV L1蛋白可在體外自組裝成病毒樣顆粒（virus-like particles，VLPs），并誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答[7-8]，可有效預(yù)防HPV感染。

轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)系統(tǒng)是一種高效、廉價(jià)的制備外源蛋白的表達(dá)系統(tǒng)，在生物制藥、疫苗等研究領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。植物的轉(zhuǎn)基因操作主要有基因槍法、PEG法、電極法等[9]。雙子葉植物的轉(zhuǎn)基因主要采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法。Mason等利用煙草和馬鈴薯表達(dá)了乙型肝炎病毒抗原和諾沃克病毒HBsAg抗原成分[10-11]；Warzecha等利用馬鈴薯表達(dá)了HPV11-L1-NLS L1蛋白[12]，并證實(shí)所表達(dá)的病毒衣殼蛋白能組裝成VLPs。鑒于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移是雙子葉植物中運(yùn)用廣泛而有效的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，因此有許多學(xué)者嘗試將這一體系用于水稻的基因轉(zhuǎn)化[14]。Yang等利用水稻表達(dá)了重組人血清白蛋白OsrHSA[13]，Huang等則利用水稻表達(dá)了人乳鐵蛋白[15]。

在本研究中，我們利用生物信息學(xué)方法分析HPV31、HPV33不同變異株的L1基因序列，再根據(jù)水稻密碼子偏愛性和mRNA結(jié)構(gòu)優(yōu)化并合成HPV31和HPV33的L1基因，分別克隆于植物表達(dá)載體，通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法將其轉(zhuǎn)入水稻種子愈傷組織，獲得表達(dá)HPV31 L1、HPV33 L1蛋白的轉(zhuǎn)基因水稻植株，為開發(fā)HPV31 L1、HPV33 L1疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

水稻種子TP309、根癌農(nóng)桿菌EHA105、中間載體pMP3、植物表達(dá)載體pCAMBIA1300由武漢禾元科技股份有限生物公司提供；大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購于TaKaRa公司；質(zhì)粒pUC57-HPV31 L1及pUC57-HPV33 L1由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。各種工具酶購自NEB公司；PCR beads購自Amersham Phar?macia公司；頭孢霉素（Cef）、羧芐青霉素（Cb）、卡那霉素（Kan）、乙酰丁香酮（AS）和植物激素6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、激動(dòng)素（KT）等購自Biosharp公司；潮霉素（Hyg）購自Roche公司；質(zhì)粒提取試劑盒、切膠回收試劑盒購自Axygen公司。

研究過程所用培養(yǎng)基按文獻(xiàn)方法配制[16-17]。MS為基本培養(yǎng)基，各培養(yǎng)基附加蔗糖30g/L、瓊脂7.5g/L，pH值調(diào)至5.8。種子發(fā)芽培養(yǎng)基為1/2MS；種子誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L；共培養(yǎng)基為MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L；選擇培養(yǎng)基為MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L+Hyg 10 mg/L+Cb 400 mg/L；生根培養(yǎng)基為1/2 MS+NAA 0.05 mg/L+Hyg 10 mg/L+Cb 200 mg/L。

1.2 目的基因及引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)大腸桿菌密碼子的偏愛性優(yōu)化HPV31及HPV33的L1蛋白編碼區(qū)基因，委托上海生工生物工程有限公司合成，合成的基因分別命名為pUC57-HPV31 L1和pUC57-HPV33 L1。在合成基因的5'端和3'端分別引入MlyⅠ、XhoⅠ酶切位點(diǎn)，并設(shè)計(jì)合成相應(yīng)的鑒定用引物（表1）。

1.3 構(gòu)建HPV31、HPV33 L1中間載體

將優(yōu)化合成的pUC57-HPV31 L1和pUC57-HPV33 L1基因用XhoⅠ和MlyⅠ雙酶切，獲得HPV L1蛋白編碼區(qū)基因序列；將pMP3載體用XhoⅠ和NaeⅠ雙酶切，獲得含有啟動(dòng)子Gt13a、信號肽序列SP的序列；將上述雙酶切的序列用T4DNA連接酶于16℃連接過夜，連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，構(gòu)建含有啟動(dòng)子Gt13a、信號肽序列SP的中間載體pMP3-HPV31 L1和pMP3-HPV33 L1，經(jīng)菌液PCR鑒定和雙酶切鑒定后用于構(gòu)建植物表達(dá)載體。

1.4 構(gòu)建HPV31、HPV33 L1重組植物表達(dá)載體載體

將構(gòu)建的中間載體和含有潮霉素抗性基因的植物表達(dá)載體pCAMBIA1300用HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切，切膠回收目的基因，用T4DNA連接酶于16℃連接過夜，構(gòu)建含有水稻特異性啟動(dòng)Gt13a、信號肽序列SP、潮霉素抗性基因及HPV31 L1和HPV33 L1基因的水稻胚乳特異性表達(dá)載體，經(jīng)菌液PCR鑒定和雙酶切及測序鑒定，將構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pCAM?BIA1300-pMP3-HPV-31L1和pCAMBIA1300-pMP3-HPV-33 L1。

1.5 重組植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105

分別用電穿孔法將構(gòu)建的水稻胚乳特異性表達(dá)載體pCAMBIA1300-pMP3-HPV-31 L1和pCAMBIA1300-pMP3-HPV-33 L1導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞，涂于含鏈霉素（100 mg/L）及卡那霉素（50 mg/L）的YEB選擇培養(yǎng)基，經(jīng)PCR及酶切鑒定后的陽性菌落用于植物轉(zhuǎn)化。

1.6 水稻的遺傳轉(zhuǎn)化

選取飽滿、大小一致、新鮮的水稻種子置于37℃恒溫箱中1～2d；在無菌條件下先后用75％乙醇對水稻種子消毒30s、20％次氯酸鈉消毒（加入1～2滴吐溫 20）10min，無菌水沖洗 4～5次，用無菌濾紙吸干水分后，接種于種子誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于26℃光照預(yù)培養(yǎng)10d；挑取淡黃色的生長狀態(tài)良好的愈傷組織，置于含重組質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌EHA105（D600nm=0.6～0.8）侵染液中侵染30～45min，侵染期間須不時(shí)搖動(dòng)；侵染結(jié)束后，棄菌液，用無菌濾紙吸干殘留菌液，接種于共培養(yǎng)基上，于25℃暗培養(yǎng)3～4d；用無菌水洗去未侵入愈傷組織的農(nóng)桿菌，然后用加了頭孢霉素的無菌水抑制農(nóng)桿菌的生長，用無菌濾紙吸干水分后轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基，26℃暗培養(yǎng)30d；挑選新長出來的朝下與篩選培養(yǎng)基表面接觸的嫩黃色凝結(jié)成塊的愈傷組織，將其轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基，于26℃光照條件下培養(yǎng)30d；將分化成的苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，于26℃光照條件下生根培養(yǎng)30d；將水稻苗移栽至土壤中，溫室培養(yǎng)。

表1 所用引物列表

1.7 轉(zhuǎn)基因水稻的PCR檢測

剪取200 mg新鮮葉片，65℃干燥后研磨成粉末，用CTAB法提取總DNA，干燥后溶于100μL TE中。取1μL總DNA作為模板，用HPV31、HPV33 L1上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增（擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性 10min；95℃ 30s，55℃ 30s，72℃90s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸 10min），PCR 產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

2 結(jié)果

2.1 中間載體的構(gòu)建與鑒定

中間表達(dá)載體pMP3-HPV-31-L1和pMP3-HPV-33-L1含有啟動(dòng)子Gt13a、信號肽序列SP及L1蛋白編碼區(qū)基因（圖1A），經(jīng)化學(xué)轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，其菌液PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分析，在約458、445bp處可見特異性條帶，大小與預(yù)期相符（圖1B）。提取質(zhì)粒用HindⅢ/EcoRⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分析，可見2條與預(yù)期相符的條帶（圖1C）。測序（序列未示）證實(shí)HPV31 L1和HPV33 L1編碼區(qū)基因成功插入中間載體pMP3。

2.2 植物表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-pMP3-HPV-31 L1和pCAMBIA1300-pMP3-HPV-33 L1含有水稻特異性啟動(dòng)Gt13a、信號肽序列SP、潮霉素抗性基因及L1蛋白編碼區(qū)基因（圖2A），經(jīng)化學(xué)轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，其菌液PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分析，在約458、445bp處可見特異性條帶，大小與預(yù)期相符（圖2 B）。提取質(zhì)粒用HindⅢ/EcoRⅠ雙酶切，有2條與預(yù)期大小相符的條帶（圖2C）。測序（序列未示）證實(shí)HPV31 L1和HPV33 L1編碼區(qū)基因成功插入植物載體pCAMBIA1300。

2.3 植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105

將構(gòu)建的水稻特異性表達(dá)載體用電穿孔法[12]轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105，挑取單克隆，菌液PCR可擴(kuò)增到HPV31、HPV33 L1基因片段（圖3），證實(shí)植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-pMP3-HPV-31 L1和pCAMBIA1300-pMP3-HPV-33 L1已導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌，與根癌農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒共同構(gòu)成植物表達(dá)雙元載體。

2.4 轉(zhuǎn)基因水稻植株的PCR鑒定

分別用含有pCAMBIA1300-pMP3-HPV-31 L1和pCAMBIA1300-pMP3-HPV-33 L1的根癌農(nóng)桿菌EHA105浸染水稻種子愈傷組織，經(jīng)篩選、分化、生根培養(yǎng)，移栽至土壤中，采取葉片提取其基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果如圖4、5所示。經(jīng)T0代HPV31葉片PCR鑒定，共篩選出35株HPV31 L1基因（458bp左右有目的條帶）PCR陽性的轉(zhuǎn)基因水稻植株；經(jīng)T0代HPV33葉片PCR鑒定，共篩選出38株HPV33 L1基因（445bp左右有目的條帶）PCR陽性的轉(zhuǎn)基因水稻植株。

圖1 中間載體pMP3-HPV31 L1、pMP3-HPV 33 L1的構(gòu)建及鑒定

3 討論

圖2 植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-pMP3-HPV31 L1、pCAMBIA1300-pMP3-HPV33 L1的構(gòu)建及鑒定

HPV感染與宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，因此研制預(yù)防性疫苗以防止HPV的感染極為重要。HPV預(yù)防性疫苗主要是基于L1蛋白自組裝或L1、L2蛋白共同組裝形成的VLP疫苗[7-8]。研究證實(shí)，這類VLP疫苗能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生持久的保護(hù)性免疫反應(yīng)，從而阻斷病毒入侵宿主細(xì)胞[18-19]。用酵母表達(dá)系統(tǒng)或桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)獲得的L1 VLP疫苗已獲批進(jìn)入市場，但這種疫苗的生產(chǎn)成本較高，使其在發(fā)展中國家的推廣應(yīng)用受到限制。因此，嘗試發(fā)展新的廉價(jià)表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)疫苗仍是目前研究的熱點(diǎn)。

近年來，轉(zhuǎn)基因植物作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用生物大分子的研究在不斷深入，利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)HPV VLP疫苗是一條可探索的途徑。水稻是分子生物學(xué)研究的模式作物之一，遺傳轉(zhuǎn)化已成為水稻分子生物學(xué)研究和基因工程的必需手段。He等應(yīng)用水稻胚乳表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的人血清白蛋白OsrHSA產(chǎn)量可達(dá)2.75g/kg，占水稻可溶性蛋白總量的10.58％，且純度高達(dá)99.9％[13]；An等應(yīng)用水稻胚乳表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的堿性成纖維細(xì)胞生長因子OsrbFGF產(chǎn)量可達(dá)8.33 mg/kg，純度高達(dá)95％[20]，表明水稻胚乳表達(dá)系統(tǒng)作為一種新的植物表達(dá)系統(tǒng)可表達(dá)外源重組蛋白。

我們構(gòu)建的植物重組表達(dá)載體pCAM?BIA1300-pMP3-HPV-31L1及pCAMBIA1300-pMP3-HPV-33 L1具有完整的植物表達(dá)調(diào)控元件，如組成型啟動(dòng)子Gt13a、植物篩選標(biāo)志及左右邊界序列，同時(shí)含有目的蛋白HPV31 L1或HPV33 L1的編碼區(qū)基因，可與農(nóng)桿菌中的Ti輔助質(zhì)粒構(gòu)成植物雙元表達(dá)載體，為HPV31或HPV33 L1基因轉(zhuǎn)入水稻胚乳奠定了基礎(chǔ)。隨后我們用轉(zhuǎn)化的含有HPV31、HPV33 L1基因的重組表達(dá)菌株分別浸染水稻種子愈傷組織，最終得到了含有目的基因的水稻植株，說明我們構(gòu)建的植物雙元表達(dá)載體適用于根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化，為HPV31或HPV33亞型L1蛋白在水稻胚乳表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。

圖3 根癌農(nóng)桿菌EHA105菌液PCR鑒定

圖4 T0代HPV31轉(zhuǎn)基因水稻植株葉片DNA的PCR鑒定

圖5 T0代HPV33轉(zhuǎn)基因水稻植株葉片DNA的PCR鑒定

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Construction and Identification of HPV31 L1 and HPV33 L1 Transgenic Rice Plants

MENG Feng-Li1,ZHANG Gai-Ping2,LIU Yun-Chao2,CHEN Yu-Mei1,WANG Ju-Cai2,QI Yan-Hua1,RAN Yun-Wei1,WANG Ai-Ping1*
1.School of Life Science,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001;2.Key Laboratory of Animal Immunology,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002;China
*Corresponding author,E-mail:pingaw@126.com

Objective:Based on the advantages of rice endosperm bioreactor,we constructed human papillomavi?rus（HPV） 31 L1 and HPV33 L1 plant expression vectors by introducing the HPV31 L1,HPV33 L1 genes into rice,for expressing the HPV31 L1,HPV33 L1 protein in rice endosperm expression system.Methods:The encod?ing genes of HPV31 and HPV33 L1 protein were synthesized by using bioinformatics analysis and optimization,and subcloned into the intermediate vector pMP3 and expression vector pCAMBIA1300.The binary expression vec?tors pCAMBIA1300-pMP3-HPV-31 L1 and pCAMBIA1300-pMP3-HPV-33 L1 were transformated into TP309 rice seed callus via Agrobacterium-mediated method.Some hygromycin-resistance plants were obtained by antibiotic screening and calli regenerated.Results&Conclusion:The HPV31 and HPV33 L1 genes were introduced into rice via Agrobacterium-mediated transformation by using the rice mature embryo-derived callus as explants.

human papillomavirus L1 gene;Agrobacterium tumefaciens;rice endospermcells bioreactor;genetic transformation;plant expression vector

Q943.2

A

1009-0002（2017）04-0465-06

2017-01-12

河南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)和創(chuàng)新人才支持計(jì)劃（14HASTIT027）

孟鳳麗（1990- ），女，碩士，（E-mail）2298273675@qq.com

王愛萍，（E-mail）pingaw@126.com

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.012