楊永凱 張 帆* 韋 浩 周曉輝 陳春美 王春華

（1 福建醫(yī)科大學(xué)附屬福州市第一醫(yī)院神經(jīng)外科，福建 福州 350009；2 福建省神經(jīng)外科研究所，福建 福州 350001）

· 實驗研究 ·

高壓氧對大鼠顱腦損傷后神經(jīng)功能缺損的影響

楊永凱1張 帆1* 韋 浩1周曉輝1陳春美2王春華2

（1 福建醫(yī)科大學(xué)附屬福州市第一醫(yī)院神經(jīng)外科，福建 福州 350009；2 福建省神經(jīng)外科研究所，福建 福州 350001）

目的觀察高壓氧及Notch信號阻斷劑（DAPT）對大鼠顱腦損傷后神經(jīng)功能缺損的影響。方法成年健康Wistar大鼠應(yīng)用改良的自由落體方法制備腦損傷模型，隨機(jī)分為假手術(shù)組、顱腦損傷組、DAPT組及高壓氧組，運用改良大鼠神經(jīng)功能缺損評分來評價損傷前1 d、傷后1 d、7 d、14 d及21 d的神經(jīng)功能。結(jié)果在傷前1 d和傷后1 d時，顱腦損傷組神經(jīng)功能缺損評分為0和（10.00±1.58）分，DAPT組神經(jīng)功能缺損評分為0和（10.46±1.71）分，高壓氧組神經(jīng)功能缺損評分為0和（10.33±2.13）分，和顱腦損傷組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。在顱腦損傷后7 d、14 d及21 d時，DAPT組神經(jīng)功能缺損評分（9.17±2.35，7.91±2.48，6.18±0.60）顯著高于顱腦損傷組（6.32±1.16，5.71±0.69，5.04±1.83）（P＜0.05）；高壓氧組神經(jīng)功能缺損評分（4.67±0.84，2.85±1.91，2.06±1.39）顯著低于顱腦損傷組（6.32±1.16，5.71±0.69，5.04±1.83）（P＜0.05）。結(jié)論高壓氧能促進(jìn)顱腦損傷大鼠神經(jīng)功能缺損恢復(fù)，Notch信號阻斷劑抑制了顱腦損傷大鼠神經(jīng)功能缺損恢復(fù)。

高壓氧；顱腦損傷；神經(jīng)干細(xì)胞；Notch信號通路

急性顱腦損傷是神經(jīng)外科的常見疾病，其致死率、致殘率為各類臟器損傷之首[1]。降低顱腦損傷患者致死率及致殘率、改善患者生存質(zhì)量已成為神經(jīng)外科的重要課題之一，傳統(tǒng)手術(shù)及藥物的治療效果仍不盡滿意，因此有必要尋找其他有效的治療方法。

干細(xì)胞治療是目前認(rèn)為對顱腦損傷患者比較有效的治療方法。干細(xì)胞治療分為內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞原位激活和外源性干細(xì)胞移植兩大類，內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞沒有外源性干細(xì)胞帶來的免疫排斥、倫理學(xué)道德問題，更適合于臨床運用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞終生存在于側(cè)腦室室管膜下區(qū)（subventricular zone，SVZ）和海馬齒狀回（dentate gyrus，DG）等腦內(nèi)某些特定的區(qū)域。腦損傷后可誘導(dǎo)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞開始增殖、分化來進(jìn)行修復(fù)[2]。根據(jù)Urrea等[3]的研究，腦外傷后海馬齒狀回內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞增殖在傷后早期即開始增殖，于2～3 d時達(dá)到高峰。但是顱腦損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化能力十分有限，遠(yuǎn)不能達(dá)到臨床恢復(fù)的要求。因此，研究如何促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化，從而提高機(jī)體這種自身修復(fù)能力將為內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞治療帶來廣闊的前景。

高壓氧是目前治療顱腦損傷比較有效的治療方法，國內(nèi)大量臨床報道也表明高壓氧可以降低中樞神經(jīng)損傷的傷殘率和病死率。劉海等[4]研究認(rèn)為高壓氧使大鼠脊髓損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化加強，脊髓損傷后的神經(jīng)功能得到改善，提示高壓氧的治療作用可能與激活內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖有關(guān)。本研究采用大鼠顱腦損傷模型，用高壓氧干預(yù)顱腦損傷后大鼠，觀察高壓氧對神經(jīng)功能缺損的影響，為高壓氧治療顱腦損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組：健康清潔級雄性Wistar大鼠80只，體質(zhì)量300～400 g，月齡3～4個月，由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供。采用完全隨機(jī)設(shè)計將大鼠分為4個組，分別為：①假手術(shù)組（n=20）：僅切開頭皮和顱骨開窗而不致腦損傷；②顱腦損傷組（n=20）：按顱腦損傷模型方法建立；③DAPT組（n=20）：大鼠顱腦損傷模型成功后腹腔注射DAPT，每次腹腔注射100 mg/kg體質(zhì)量[5]，隔日注射1次，連續(xù)21 d。④高壓氧組（n=20）：大鼠顱腦損傷模型成功后3小時內(nèi)行高壓氧治療，每日1次，連續(xù)21 d。以上4組根據(jù)顱腦損傷后處死動物的時間（顱腦損傷后24 h，7 d，14 d，21 d）隨機(jī)分為4個亞組，每個亞組5只大鼠。

1.2 主要試劑及儀器：DAPT購自美國Calbiochem公司；顱腦定位儀（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；-20 ℃冰箱（青島海爾股份有限公司）；SHC2600/7500-8型醫(yī)用空氣加壓氧艙（上海七零一所楊園高壓氧艙有限公司）。

1.3 大鼠顱腦損傷模型的制作：在傳統(tǒng)的Feeley's自由落體方法上略作改動制作腦損傷動物模型，將麻醉動物的頭顱固定后，常規(guī)消毒鋪巾，沿中線矢狀切開頭皮，剝離骨膜，顯露右側(cè)顱骨，用牙科鉆沿前囟前5.0 mm，向右旁開3.0 mm處做一直徑約5.0 mm的骨窗，將20 g打擊錘從40 cm高度自由落下撞擊安置在頭顱部位硬膜上的撞墊，由撞墊將力傳遞至顱腦，造成局灶性腦損傷。術(shù)后用雙氧水及生理鹽水清洗創(chuàng)口，止血、縫合頭皮，動物清醒后分籠喂養(yǎng)。該模型可按打擊錘重量乘以落高來分級。

1.4 高壓氧治療方法：首先用純氧充分洗艙10 min后，在20 min內(nèi)勻速加壓至2.0ATA（0.2 MPa）穩(wěn)壓60 min，其間用純氧通風(fēng)10 min，艙內(nèi)氧濃度＞96%。穩(wěn)壓結(jié)束后用20 min勻速減壓至常壓出艙。每天1次，共21次。

1.5 大鼠神經(jīng)功能評估：在大鼠顱腦損傷前1 d、傷后1 d、7 d、14 d、21 d應(yīng)用改良神經(jīng)功能（mNSS）評分表進(jìn)行神經(jīng)功能損傷評分，評分標(biāo)準(zhǔn)參見[6]，該量表通過運動試驗、感覺試驗、平衡木試驗等反射喪失和不正常運動，綜合評價神經(jīng)系統(tǒng)損傷的嚴(yán)重程度，評分在13～18分為重度損傷、7～12分為中度損傷、1～6分為輕度損傷。本實驗選擇改良神經(jīng)功能損傷評分（mNSS）為7～12分的大鼠列為研究對象。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS18.0軟件來處理數(shù)據(jù)，計量資料以（±s）表示，各組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

表1 4組大鼠不同時間神經(jīng)功能缺損評分比較（±s）

表1 4組大鼠不同時間神經(jīng)功能缺損評分比較（±s）

注：與顱腦損傷組比較aP＜0.05，bP＜0.05

組別 n 傷前1 d 傷后1 d 傷后7 d 傷后14 d 傷后21 d假手術(shù)組 20 0 0 0 0 0顱腦損傷組 20 0 10.00±1.58 6.32±1.16 5.71±0.69 5.04±1.83 DAPT組 20 0 10.46±1.71 9.17±2.35a 7.91±2.48a 6.18±0.60a高壓氧組 20 0 10.33±2.13 4.67±0.84b 2.85±1.91b 2.06±1.39b

4組大鼠不同時間點神經(jīng)功能恢復(fù)程度比較：顱腦損傷組、DAPT組和高壓氧組大鼠在傷后1 d、7 d、14 d、21 d的神經(jīng)功能缺損評分均高于傷前1 d；在顱腦損傷后1 d時與假手術(shù)組比較，顱腦損傷組、DAPT組和高壓氧組神經(jīng)功能缺損評分升高，兩組之間比較神經(jīng)功能缺損評分差異無顯著性意義（P＞0.05）；在顱腦損傷后7 d、14 d及21 d時，與假手術(shù)組比較，顱腦損傷組、DAPT組和高壓氧組神經(jīng)功能缺損評分升高，分別與顱腦損傷組比較，高壓氧組評分顯著低于顱腦損傷組（P＜0.05），說明高壓氧組大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)較快，DAPT組評分顯著高于顱腦損傷組，說明DAPT組大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)較慢，見表1。

3 討 論

高壓氧是目前治療顱腦損傷比較有效的治療方法，王曉莉等[7]研究表明高壓氧可以促進(jìn)缺氧缺血性腦損傷新生大鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，其機(jī)制與Wnt信號活化有關(guān)。而Notch信號通路同Wnt信號通路類似，也與神經(jīng)發(fā)生密切相關(guān)。國內(nèi)潘長福等[8]實驗顯示小鼠顱腦損傷后海馬區(qū)Notch1及Hes1mRNA明顯增高，認(rèn)為Notch信號激活可能與傷后神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化有關(guān)，因此推測高壓氧能夠通過Notch信號的調(diào)控促進(jìn)顱腦損傷大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的增殖與分化。

Notch信號通路在腦發(fā)育過程中的神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化過程起著極為關(guān)鍵的作用[9]，激活Notch信號，可維持神經(jīng)干細(xì)胞的未分化狀態(tài)，促進(jìn)其自我增殖[10]。最近研究表明，Notch信號也在成年哺乳動物海馬區(qū)和室管膜下區(qū)表達(dá)，在成體神經(jīng)再生過程中發(fā)揮著類似的調(diào)控作用[11]。

DAPT是一種特異性抑制γ-分泌酶活性的化學(xué)分子，已經(jīng)被證實為Notch信號通路的阻斷劑，能抑制Notch信號通路，將DAPT運用于神經(jīng)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)中，鏡下可見神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量明顯減少，神經(jīng)干細(xì)胞生長過程中所形成的神經(jīng)球的直徑也明顯減小；相反的，過表達(dá)Notch1、Hes1和Hes5能夠促進(jìn)神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖和自我更新[12-16]。

本研究用高壓氧及DAPT干預(yù)顱腦損傷后大鼠，運用改良大鼠神經(jīng)功能缺損評分來評價大鼠傷后不同時間點神經(jīng)功能情況。改良大鼠神經(jīng)功能缺損評分（modified neurological severity score，mNSS），是根據(jù)運動、感覺、平衡能力及生理反射對大鼠各項生理功能進(jìn)行等級評分，分值越高表示神經(jīng)功能損害越嚴(yán)重。從本實驗的結(jié)果可以看出，在顱腦損傷后7 d、14 d及21 d時，高壓氧組大鼠的神經(jīng)功能缺損評分明顯低于顱腦損傷組，提示高壓氧能明顯改善顱腦損傷大鼠的神經(jīng)功能缺損；而DAPT組大鼠的神經(jīng)功能缺損評分明顯高于顱腦損傷組，提示DAPT抑制了顱腦損傷大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)。綜上，本研究通過高壓氧及Notch信號阻斷劑對大鼠顱腦損傷后神經(jīng)功能缺損的影響，證實了高壓氧能改善顱腦損傷大鼠神經(jīng)功能，推測其作用機(jī)制與Notch信號通路調(diào)控內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化有關(guān)，為今后進(jìn)一步深入研究Notch信號調(diào)控人神經(jīng)再生機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

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R651.1+5

B

1671-8194（2017）25-0027-02

福州市衛(wèi)生計生科研創(chuàng)新團(tuán)隊培育項目(2013-S-wt1)；福建省自然科學(xué)基金項目(2015J01498)；福建醫(yī)大非直屬附屬醫(yī)院科研發(fā)展專項課題(FZS13002Z)

*通訊作者：E-mail:zhangfan0591@sina.com