胡余敏，朱君飛

（1.臨海市第一人民醫(yī)院，浙江 臨海 317000；2.臺(tái)州市中心醫(yī)院，浙江 臺(tái)州 318000）

非小細(xì)胞肺癌中叉頭框蛋白Q1和β連環(huán)蛋白的表達(dá)及臨床意義

胡余敏1，朱君飛2

（1.臨海市第一人民醫(yī)院，浙江 臨海 317000；2.臺(tái)州市中心醫(yī)院，浙江 臺(tái)州 318000）

目的探討非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）組織中叉頭框蛋白Q1（FOXQ1）和β連環(huán)蛋白（β-catenin）的表達(dá)及其臨床意義。方法采用免疫組化En Vision法檢測(cè)60例NSCLC和對(duì)應(yīng)癌旁組織中FOXQ1和β-catenin的表達(dá)情況，并結(jié)合NSCLC患者臨床病理資料進(jìn)行分析。結(jié)果NSCLC組織中FOXQ1和β-catenin陽性表達(dá)率分別為63.33%（38/60）和 71.67%（43/60），均明顯高于對(duì)應(yīng)癌旁正常組織的 13.33%（9/60）和 0.00%（0/60），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）；FOXQ1和β-catenin蛋白表達(dá)均與臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān) （P＜0.05）；NSCLC組織中FOXQ1和 βcatenin之間的表達(dá)呈顯著正相關(guān)（r＝0.662，P＜0.01）。結(jié)論NSCLC組織中FOXQ1和β-catenin表達(dá)升高，其異常表達(dá)與NSCLC的轉(zhuǎn)移和臨床分期密切相關(guān)，F(xiàn)OXQ1有望成為NSCLC新的治療靶點(diǎn)。

非小細(xì)胞肺癌；叉頭框蛋白Q1；β連環(huán)蛋白

非小細(xì)胞肺癌（non-smallcelllungcancer，NSCLC）約占肺癌的80%～85%[1]。盡管分子機(jī)制的研究和綜合治療取得了進(jìn)展，但5年生存率仍然較低[2]。因此，有必要尋找可用于NSCLC臨床診斷和治療的新分子靶點(diǎn)。叉頭框蛋白Q1（Forkhead box Q1，F(xiàn)OXQ1）是FOX家族的新成員，屬一種腫瘤癌基因，參與多種信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、血管生成和凋亡等，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3-4]。β-連環(huán)蛋白（βcatenin）是連環(huán)蛋白家族成員之一，參與Wnt信號(hào)通路，通過與Wnt靶基因作用，誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)錄，在腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用[4-5]。本研究采用免疫組化En Vision法檢測(cè)FOXQ1和β-catenin在NSCLC和癌旁組織中的表達(dá)特點(diǎn)及其與NSCLC臨床病理因素的關(guān)系，進(jìn)一步分析兩者的相關(guān)性，初步探討FOXQ1和β-catenin表達(dá)與NSCLC發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2008年1月～2015年12月臨海市第一人民醫(yī)院20例和臺(tái)州市中心醫(yī)院40例手術(shù)切除的NSCLC標(biāo)本，具有完整臨床資料，均經(jīng)病理明確診斷，術(shù)前未接受放療和化療。60例NSCLC中，男 35例，女 25例，年齡 30～80歲，中位年齡48歲，＜60歲20例，≥60歲40例。參照2004年WHO肺腫瘤組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)[6]：鱗癌24例，腺癌36例。高中分化42例，低分化18例。依據(jù)2010年國際抗癌聯(lián)盟（UICC）肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)[7]：Ⅰ期19例，Ⅱ期20例，Ⅲ期21例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者27例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者33例。同時(shí)另取同期距離腫塊邊緣5cm外的癌旁正常組織60例作為對(duì)照。

1.2 方法 （1）主要試劑：兔抗人FOXQ1單克隆抗體（ab99536）購自英國Abcam公司，鼠抗人βcatenin單克隆抗體（M-0442）購自美國Santa Cruz公司，即用型羊抗兔和兔抗鼠免疫組化En VisionTM檢測(cè)試劑盒和DAB顯色劑均購自北京中杉金橋生物科技有限公司。（2）檢測(cè)方法:所有標(biāo)本均采用10%的中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片、染色。取石蠟組織常規(guī)連續(xù)切片，厚約4μm，采用免疫組化En Vision二步法，實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒說明書操作。用已知陽性片作陽性對(duì)照，以PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定 免疫組化染色陽性信號(hào)為出現(xiàn)黃色至棕黃色顆粒。FOXQ1陽性表達(dá)位于細(xì)胞漿。FOXQ1細(xì)胞漿染色陽性細(xì)胞數(shù)≥10%為陽性，＜10%為陰性。β-catenin≥90%細(xì)胞膜連續(xù)染色為正常表達(dá)，＜90%細(xì)胞膜著色或無表達(dá)或胞質(zhì)或胞核染色為異常表達(dá)，β-catenin胞質(zhì)或胞核染色陽性細(xì)胞數(shù)≥10%為陽性，＜10%為陰性。觀察5個(gè)以上高倍視野（×400），每個(gè)視野計(jì)數(shù)≥200個(gè)細(xì)胞。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件對(duì)計(jì)數(shù)資料進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，F(xiàn)OXQ1和β-catenin表達(dá)的相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。

圖1 FOXQ1在NSCLC組織中的陽性表達(dá)（En Vision×400）

表1 NSCLC和癌旁正常組織中FOXQ1和β-catenin的表達(dá)（n，%）

2 結(jié)果

2.1 NSCLC和癌旁正常組織中FOXQ1和βcatenin表達(dá)的比較 FOXQ1細(xì)胞漿出現(xiàn)黃色至棕黃色顆粒 （圖1），β-catenin在NSCLC組織中主要于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)呈現(xiàn)黃色至棕黃色顆粒 （圖2）。NSCLC組織中FOXQ1和β-catenin陽性表達(dá)率均明顯高于對(duì)應(yīng)癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＜0.05）。 詳見表 1。

圖2 β-catenin在NSCLC組織中的陽性表達(dá)（En Vision×400）

2.2 FOXQ1和β-catenin表達(dá)與NSCLC臨床病理因素的關(guān)系 隨著NSCLC臨床分期進(jìn)展及發(fā)生淋巴結(jié)癌轉(zhuǎn)移，F(xiàn)OXQ1和β-catenin蛋白陽性表達(dá)率進(jìn)一步升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而在不同年齡、性別、組織學(xué)類型及分化程度間的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。詳見表2。

表2 FOXQ1和β-catenin表達(dá)與NSCLC臨床病理因素的關(guān)系（n，%）

2.3 NSCLC組織中FOXQ1和β-catenin表達(dá)的相關(guān)性 60例NSCLC組織中FOXQ1和β-catenin表達(dá)共陽性者36例，共陰性者15例，NSCIC組織中FOXQ1 和 β-catenin 表達(dá)呈正相關(guān)（r＝0.662，P＜0.01）。

表3 NSCLC組織中FOXQ1和β-catenin表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

FOXQ1是FOX超家族的成員之一，廣泛存在于人體的多種組織和器官，參與胚胎干細(xì)胞和脊椎動(dòng)物的發(fā)育過程。FOXQ1定位于6p25.3，僅包含1個(gè)外顯子，編碼403個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。FOXQ1通過靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的GC盒等核心元件，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，參與細(xì)胞周期、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等多種生物學(xué)功能[8]。FOXQ1與腫瘤關(guān)系的研究近年來備受關(guān)注。研究證實(shí)，F(xiàn)OXQ1在大腸癌[9]、胃癌[10]等多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)，與腫瘤的分化程度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并且FOXQ1高表達(dá)者預(yù)后差。Pei等[11]報(bào)道，與癌旁組織比較，F(xiàn)OXQ1在食道癌組織中呈高表達(dá)。FOXQ1過度表達(dá)促進(jìn)食道鱗癌腫瘤細(xì)胞的增殖，而沉默F(xiàn)OXQ1表達(dá)能預(yù)防食管癌細(xì)胞增殖。FOXQ1可以作為轉(zhuǎn)錄抑制因子結(jié)合到CDH1啟動(dòng)子并阻止其轉(zhuǎn)錄。因此，F(xiàn)OXQ1可作為癌基因，通過負(fù)調(diào)節(jié)CDH1促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。本研究顯示，NSCLC組織中FOXQ1表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織 （P＜0.05），與文獻(xiàn)報(bào)道[10-11]一致。通過分析FOXQ1表達(dá)與NSCLC臨床病理因素的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FOXQ1蛋白表達(dá)在NSCLC患者不同臨床分期和淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而在患者不同年齡、性別、組織學(xué)類型及分化程度上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與一些文獻(xiàn)報(bào)道“FOXQ1表達(dá)與腫瘤的分化程度有關(guān)”不一致，可能與不同部位來源的腫瘤有關(guān)[9-10]。表明FOXQ1蛋白表達(dá)越高，腫瘤淋巴結(jié)相對(duì)更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，且臨床分期更高，預(yù)后較差。

β-catenin是一種連接蛋白，主要表達(dá)于細(xì)胞膜，參與細(xì)胞間的連接。由于游離的β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中經(jīng)磷酸泛素化，進(jìn)而被蛋白酶體水解，因此始終保持在較低水平[12]。而在病理情況下，Wnt信號(hào)通路被激活時(shí)，起著向細(xì)胞核傳遞信號(hào)的作用。β-catenin在細(xì)胞膜中的正常表達(dá)下降，而在細(xì)胞漿和細(xì)胞核中異常增多，參與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移過程，分化程度越低的腫瘤組織中βcatenin的異常表達(dá)率越高[13]。本研究中β-catenin在NSCLC組織中的異常表達(dá)率顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。β-catenin異常表達(dá)在NSCLC患者不同臨床分期和淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而與患者年齡、性別、組織類型及分化程度無關(guān)。提示β-catenin在胞質(zhì)或胞核的異常表達(dá)與NSCLC的發(fā)生、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期密切相關(guān)。

Spearman等級(jí)相關(guān)分析結(jié)果顯示，NSCLC組織中FOXQ1和β-catenin表達(dá)呈正相關(guān)，是一對(duì)協(xié)同作用的因素，提示FOXQ1和β-catenin在NSCIC的發(fā)生、發(fā)展過程起正向調(diào)控作用。ChIP和熒光素報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示[14]，TCF-4高度保守的結(jié)合區(qū)域（TCAAAG）可結(jié)合FOXQ1基因啟動(dòng)子區(qū)域，直接導(dǎo)致β-catenin啟動(dòng)FOXQ1基因的轉(zhuǎn)錄。故βcatenin通過調(diào)控FOXQ1在腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展中發(fā)揮作用，這也提示FOXQ1有望成為NSCLC新的治療靶點(diǎn)。

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