張 旻，王 姝，王 娜，景宏麗，徐立蒲，吳 紹

（1.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動(dòng)物檢疫研究所，北京 100176；2.北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，北京 100176）

金魚(yú)造血器官壞死病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立

張 旻1，王 姝2，王 娜1，景宏麗1，徐立蒲2，吳 紹1

（1.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動(dòng)物檢疫研究所，北京 100176；2.北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，北京 100176）

金魚(yú)造血器官壞死病毒（Goldfish haematopoietic necrosis virus，GFHNV）是一種可感染金魚(yú)等鯉科魚(yú)類(lèi)，并可導(dǎo)致其死亡的皰疹病毒。為了快速檢測(cè)病原，本研究根據(jù)GFHNV的主要衣殼蛋白（Major captor protein，MCP）序列中的一段保守基因序列，設(shè)計(jì)引物和TaqMan探針，建立了GFHNV特異性的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法；并利用PCR反應(yīng)擴(kuò)增出的MCP基因，制備了pUC-GFHNV重組質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照。經(jīng)試驗(yàn)，該方法檢測(cè)限最低可達(dá)10個(gè)拷貝數(shù)的目的基因，而且與錦鯉皰疹病毒（Koi herpesvirus，KHV）、甲魚(yú)虹彩病毒（Softshell turtle iridovirus，STIV）、流行性造血器官壞死病毒（Epizootic haematopoietic necrosis，EHNV）、斑點(diǎn)叉尾鮰病毒（Channel catfish virus，CCV）以及白斑綜合癥病毒（White spot syndrome virus，WSSV）等5種水生動(dòng)物病毒無(wú)交叉反應(yīng)。該方法具有簡(jiǎn)便、快速、敏感、特異等優(yōu)點(diǎn)，為該病的診斷與病原檢測(cè)提供了一個(gè)重要手段。

魚(yú)類(lèi)病毒??；金魚(yú)造血器官壞死病毒；主要衣殼蛋白；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；TaqMan探針

金魚(yú)造血器官壞死病毒（Goldfish haematopoietic necrosis virus，GFHNV）是第 2個(gè)分離自鯉科魚(yú)類(lèi)的皰疹病毒，為有囊膜的雙鏈DNA病毒。其基因組大小約290.3 kb，外形呈二十面體，直徑約120 nm[1]。國(guó)際病毒系統(tǒng)分類(lèi)與命名委員會(huì)將其命名為鯉皰疹病毒2型（Cyprinid herpesvirus 2，CyHV 2），隸 屬于 皰疹病毒目（Herpesvirales）異皰疹病毒科（Alloherpesviridae）鯉皰疹病毒屬（Cyprinivirus）[2]。

GFHNV是金魚(yú)造血器官壞死?。℅oldfish haematopoietic necrosis，GFHN）的病原，可以感染金魚(yú)、異育銀鯽以及鯽魚(yú)的其它變種，最適發(fā)病水溫為15～25 ℃。該病一旦暴發(fā)，導(dǎo)致的死亡率可達(dá)80%以上[3]。患病魚(yú)臨床癥狀包括活動(dòng)減弱，體表、下頜充血等。將病魚(yú)解剖后可見(jiàn)肝臟、脾臟和腎臟腫大，有出血點(diǎn)，嚴(yán)重時(shí)魚(yú)鰾中分布有大量出血點(diǎn)[4]。

目前，日本、美國(guó)、英國(guó)、澳大利亞等國(guó)家均有GFHNV流行[1，5]。近年來(lái)我國(guó)江蘇省也發(fā)現(xiàn)存在GFHNV[3]。為有效防控流行，建立切實(shí)有效的GFHNV檢測(cè)方法非常重要。目前，由于缺乏針對(duì)GFHNV的敏感細(xì)胞系和抗體，通常使用分子生物學(xué)方法來(lái)檢測(cè)。

本研究綜合前人的研究經(jīng)驗(yàn)，建立了一種GFHNV特異性實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。該方法檢測(cè)限可達(dá)10個(gè)拷貝數(shù)的目的基因，且不與其它病毒，特別是同為皰疹病毒的錦鯉皰疹病毒（KHV）發(fā)生交叉反應(yīng)，是一種比較實(shí)用的檢測(cè)方法?；谠摲椒ǎ兄屏私痿~(yú)造血器官壞死病毒檢測(cè)試劑盒，并獲國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利（ZL201410773825.7）。

1 材料與方法

1.1 病毒DNA

GFHNV、 KHV、甲魚(yú)虹彩病毒（Softshell turtle iridovirus，STIV）、流行性造血器官壞死病毒（Epizootic haematopoietic necrosis，EHNV）、斑點(diǎn)叉尾鮰病毒（Channel catfish virus，CCV）以及白斑綜合癥病毒（White spot syndrome virus，WSSV）等6種病毒DNA，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 引物和探針的設(shè)計(jì)

根 據(jù)GenBank中GFHNV全 基 因 序列（NC_019495.1），在病毒主要衣殼蛋白（Major captor protein，MCP） 基 因 保 守 區(qū) 內(nèi)選擇一段158 bp的片段，使用DNAStar和Primer Primer 5.0軟件，設(shè)計(jì)并合成實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 的特 異性 Taqman 探針：Probe（5′-FAM－TTGGATCTGCTGCGCCCTGTTTGACAGT A M R A-3′） 和 1 對(duì) 引 物：F（5′-CAAACCCAGCACCGTCAG ATGGT-3′）和 R（5′- ATCCGGCACAGGTGGCGTGT-3′）；探針的5′端用羧基熒光素（Carboxyf l uorescein，F(xiàn)AM）標(biāo)記，3′端用羧基四甲基羅丹明（Carboxytetramethylrhodamine，TAMRA）標(biāo)記。所有探針和引物均由上海生工有限公司合成、標(biāo)記。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化

以GFHNV基因組為模板，設(shè)立25 μL的初始反應(yīng)體系（表1）和反應(yīng)條件。反應(yīng)條件為：95 ℃3 min（1個(gè)循環(huán)）；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s（40個(gè)循環(huán)）。

表1 GFHNV熒光定量PCR檢測(cè)方法初始反應(yīng)體系

1.3.1 退火溫度的優(yōu)化。將退火溫度分別設(shè)置為：65.0、64.5、63.3、61.4、58.9、57.1 和 55.0 ℃，進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，選擇Ct值最低的退火溫度作為最終退火溫度。

1.3.2 反應(yīng)體系中的Mg2+濃度優(yōu)化。將反應(yīng)體系中Mg2+終濃度設(shè)置為1.5、2.5、3.5、4.5 mmol/mL，分別進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，選擇Ct值最低的Mg2+濃度作為反應(yīng)體系的最終Mg2+濃度。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)品的制備

目的基因序列：

下劃線部分為引物序列，方框內(nèi)部分為探針序列。

目的基因由上海生工有限公司合成，并連接入載體pUC57。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及靈敏度檢測(cè)

將重組質(zhì)粒pUC/GFHNV進(jìn)行10倍系列稀釋?zhuān)謩e以 101、102、103、104、105、106、107、108拷貝數(shù)重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，以空質(zhì)粒樣品為陰性對(duì)照。使用1.3節(jié)確立的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀自帶軟件Bio-Rad iQ5 Optical System Software繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以確定該檢測(cè)方法的靈敏度。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的特異性試驗(yàn)

為了檢查該方法與其它水生動(dòng)物病毒之間是否存在交叉反應(yīng)，分別以EHNV，STIV，WSSV，KHV，CCV DNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。體系及反應(yīng)條件同1.5。

1.7 臨床樣品檢測(cè)

利用本研究建立的GFHNV實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法和通常使用的PCR方法，對(duì)從江蘇省和北京市采集的10尾鯽魚(yú)樣品進(jìn)行檢測(cè)，并比對(duì)檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.1.1 退火溫度的優(yōu)化。使用Bio-Rad iQ5熒光定量PCR儀，將退火溫度設(shè)置為65.0、64.5、63.3、61.4、58.9、57.1和55.0 ℃，分別進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)體系見(jiàn)1.3。結(jié)果如圖1所示：退火溫度為58.9 ℃時(shí)，Ct值最低，為24.15。因此，將該方法退火溫度設(shè)置為59 ℃。

圖1 GFHNV實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法退火溫度優(yōu)化

2.1.2 反應(yīng)體系中的Mg2+濃度優(yōu)化。將反應(yīng)體系中的Mg2+終濃度設(shè)置為1.5、2.5、3.5、4.5 mmol/mL，分別進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，相應(yīng)調(diào)整水的體積，使反應(yīng)體系保持25 μL，退火溫度為59 ℃。結(jié)果如圖2所示：Mg2+終濃度為3.5 mmol/mL時(shí)，Ct值最小，為18.80。因此，將反應(yīng)體系中的Mg2+終濃度設(shè)置為3.5 mmol/mL。最終反應(yīng)體系見(jiàn)表2。反應(yīng)條件為：95℃ 3 min（1個(gè)循環(huán)）；95 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s（40個(gè)循環(huán)）。

圖2 GFHNV實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法Mg2+濃度優(yōu)化

表2 GFHNV熒光定量PCR檢測(cè)方法優(yōu)化后反應(yīng)體系

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作及檢測(cè)限

將10倍系列梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品pUC-GFHNV溶液（101～108copies）作為絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。用橫坐標(biāo)表示每個(gè)反應(yīng)的拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值，縱坐標(biāo)表示Ct值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。反應(yīng)在101～108拷貝濃度范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系，斜率為-2.173，相關(guān)系數(shù)為0.989，線形回歸方程為Y=-2.173X+31.281；最低10 copies的模板樣品有明顯熒光信號(hào)，Ct值為29左右（圖3）。因此，該定量方法最低可以定量檢測(cè)至101拷貝/反應(yīng)的目的基因。

圖3 GFHNV實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)限及標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 檢測(cè)方法特異性試驗(yàn)

以 GFHNV、EHNV、STIV、WSSV、KHV、CCV的DNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。體系及反應(yīng)條件見(jiàn)2.1.2。結(jié)果顯示，僅GFHNV模板有很明顯的擴(kuò)增曲線，其他模版均無(wú)明顯熒光信號(hào)（圖4）。結(jié)果表明，該方法與其它5種水生動(dòng)物病毒無(wú)交叉反應(yīng)。

圖4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)特異性檢測(cè)結(jié)果

2.4 臨床樣品檢測(cè)

對(duì)采集自江蘇省和北京市的10尾疑似患病鯽魚(yú)，提取腎臟組織DNA。以組織DNA作為檢測(cè)樣品，以濃度為1×107copies/μL的重組質(zhì)粒和去離子水作為陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，分別進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)和PCR檢測(cè)。按照2.1.2中的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，按照Waltzek等[7]建立的方法進(jìn)行PCR，將目的基因大小設(shè)為366 bp。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，4號(hào)和8號(hào)樣品為陽(yáng)性（圖5），Ct值分別為17.48和22.85，說(shuō)明4號(hào)樣品包含的病毒量大于8號(hào)；PCR結(jié)果顯示，只有4號(hào)和8號(hào)樣品擴(kuò)增出目的基因（圖6），4號(hào)樣品DNA條帶亮度大于8號(hào)，說(shuō)明4號(hào)樣品的模板濃度大于8號(hào)。2種檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果相同，都是4號(hào)和8號(hào)樣品為陽(yáng)性，其他8份樣品均為陰性。這說(shuō)明本研究建立的GFHNV實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法效果等同于常規(guī)的PCR檢測(cè)方法，可用于GFHNV的實(shí)際檢測(cè)。

圖5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR臨床檢測(cè)結(jié)果

圖6 PCR臨床檢測(cè)結(jié)果

3 討論

GFHNV作為一種魚(yú)類(lèi)烈性病毒性傳染病病原，國(guó)內(nèi)外一直力求建立準(zhǔn)確、高效的檢測(cè)方法，用于該病的防控。當(dāng)前，魚(yú)類(lèi)病毒的主要檢測(cè)方法包括病原分離法、基于目的基因擴(kuò)增的分子生物學(xué)檢測(cè)方法和基于抗原抗體特異性反應(yīng)的免疫學(xué)檢測(cè)方法。由于一直沒(méi)有穩(wěn)定的，針對(duì)GFHNV敏感細(xì)胞系的推廣應(yīng)用，無(wú)法使用病原分離法分離GFHNV。目前，針對(duì)GFHNV免疫學(xué)檢測(cè)方法的報(bào)道也較少。上海海洋大學(xué)制備了GFHNV VP72重組蛋白，并將其作為抗原，建立了檢測(cè)GFHNV抗體的Western blot檢測(cè)技術(shù)[6]。不過(guò)由于Western blot技術(shù)本身的實(shí)驗(yàn)特征，該方法不適合用于出入境檢驗(yàn)檢疫、國(guó)內(nèi)疫病監(jiān)測(cè)等大批量樣品檢測(cè)。

目前，國(guó)內(nèi)外報(bào)道的針對(duì)GFHNV的檢測(cè)方法主要為分子生物學(xué)檢測(cè)方法，包括PCR方法[7-8]、實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法[9-12]和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法（LAMP）[13-14]等。其中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法作為一種常用的經(jīng)典分子生物學(xué)檢測(cè)方法，已在水生動(dòng)物疫病診斷中得到了廣泛應(yīng)用。本研究建立的GFHNV實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，通過(guò)擴(kuò)增曲線和Ct值來(lái)判斷樣品陰/陽(yáng)性，加樣后因PCR管全封閉，不需電泳，因此節(jié)約了制膠和電泳的時(shí)間，全程約需1.5 h，比普通PCR減少了0.5～1 h，更加高效；由于不需要開(kāi)蓋電泳，也杜絕了LAMP方法產(chǎn)生的氣溶膠污染問(wèn)題。雖然已有針對(duì)GFHNV的熒光定量PCR檢測(cè)方法的報(bào)道，但其檢測(cè)限為20～83個(gè)拷貝數(shù)的病毒核酸[9-12]。而本研究建立方法的檢測(cè)限可達(dá)10個(gè)拷貝數(shù)，且不與其它病毒，特別是同為皰疹病毒的KHV發(fā)生交叉反應(yīng)，是一種更加靈敏的檢測(cè)方法。作為陽(yáng)性參考物質(zhì)使用的pUC-GFHNV重組質(zhì)粒，易于保存且制備方便。不僅如此，基于該方法研制的金魚(yú)造血器官壞死病毒檢測(cè)試劑盒，已獲國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利授權(quán)（ZL201410773825.7），可作為檢測(cè)試劑提供給各檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室用于該病毒的研究和監(jiān)控工作。

綜上所述，根據(jù)GFHNV MCP保守基因設(shè)計(jì)引物、探針，建立的針對(duì)GFHNV的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，最低可以檢測(cè)到10個(gè)拷貝數(shù)的目的基因。特異性試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法對(duì)EHNV、KHV等病毒的DNA無(wú)反應(yīng)，具備良好的特異性。臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法的準(zhǔn)確性等同于通常的PCR方法，可以特異高效的檢測(cè)GFHNV，適用于對(duì)GFHNV的檢測(cè)和監(jiān)控。

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（責(zé)任編輯；朱迪國(guó)）

Development of Real-time PCR Assay for the Detection of Goldfish Haematopoietic necrosis Virus（GFHNV）

Zhang Min1，Wang Shu2，Wang Na1，Jing Hongli1，Xu Lipu2，Wu Shaoqiang1
（1. The Institute of Animal and Plant Quarantine，Chinese Academy of Inspection and Quarantine，Beijing 100176；2. Beijing Fisheries Technical Extension Station，Beijing 100176）

Goldfish haematopoietic necrosis virus（GFHNV）is a pathogen causing high mortalities of goldfish，which belongs to Cyprinivirus. In order to establish a high efficient and reliable diagnostic method，a real-time PCR assay for detection of GFHNV was developed in this paper. The primers and TaqMan probes were designed according to the conserved regions of major capsid protein（MCP）gene of GFHNV. And the MCP gene was ligated into the pUC57 plasmid vector to prepare of recombinant plasmid pUC-T/GFHNV as positive control. The detection limit of this Realtime PCR assay was 10 copies of viral gene segment（in pUC-GFHNV），and there was no cross reaction with other 5 aquatic viruses，such as Koi herpesvirus（KHV），Softshell turtle iridovirus（STIV），Epizootic haematopoietic necrosis（EHNV），Channel catfish virus（CCV）and White spot syndrome virus（WSSV）. It's showed that this real-time PCR assay was sensitive and specific for detection of GFHNV and provided an important means for the diagnosis and pathogen detection of the disease.

fish viral diseases；Goldfish haematopoietic necrosis virus（GFHNV）；major capsid protein（MCP）；real-time PCR；TaqMan probes

S941.41+9

B

1005-944X（2017）11-0099-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.11.026

國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2013BAD12B02）；北京市觀賞魚(yú)產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（BAIC03-2017）

吳紹強(qiáng)