成偉偉，陳伯祥，楊 明，李 杰

（甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅平?jīng)?744000）

山羊痘病毒P32蛋白的原核表達(dá)及其免疫原性研究

成偉偉，陳伯祥，楊 明，李 杰

（甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅平?jīng)?744000）

為表達(dá)山羊痘病毒P32蛋白并研究其免疫原性，構(gòu)建了含有P32基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-P32，誘導(dǎo)表達(dá)和純化了P32蛋白；分別運(yùn)用SDS-PAGE和Western blot，對該蛋白進(jìn)行了分析和生物活性鑒定；用分析鑒定后的P32蛋白免疫BALB/c小鼠，然后采集小鼠血清，用間接ELISA進(jìn)行抗體檢測；用小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)，檢測該蛋白對機(jī)體的細(xì)胞免疫活性。結(jié)果顯示：表達(dá)純化的含有GST標(biāo)簽的P32重組蛋白，大小約39 kDa；Western blot顯示 P32重組蛋白具有較好的特異性；間接ELISA抗體檢測和小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)表明P32重組蛋白具有良好的免疫原性。本試驗(yàn)結(jié)果為深入研究P32蛋白的生物學(xué)功能以及對山羊痘的診斷與防治奠定了基礎(chǔ)。

山羊痘病毒；P32蛋白；免疫原性

山羊痘是由痘病毒科羊痘病毒屬山羊痘病毒（Goatpox virus，GTPV）引起山羊及綿羊的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病[1]。該病以全身皮膚和黏膜部位出現(xiàn)典型痘疹為主要臨床特征[2]，具有較高的發(fā)病率與死亡率，被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為必須報告的動物疫病，被我國列為一類動物疫病[3]。該病呈全球分布，流行廣泛[4]，對養(yǎng)羊業(yè)造成嚴(yán)重危害和巨大經(jīng)濟(jì)損失。

GTPV為線性雙股DNA病毒，基因組大小約為143～147 kb[5]。GTP 間的核心編碼區(qū)和兩端的反向末端重復(fù)序列（Inverted terminal repeat，ITR）構(gòu)成?；蚪M中間核心區(qū)域（ORFs024-123）比較保守，主要調(diào)控病毒的復(fù)制、包裝和釋放；兩端的反向重復(fù)序列（ORFs001-023和ORFs124-147）具有較高的變異性，主要決定病毒毒力和宿主范圍[6-7]。P32基因位于GTPV基因組的64～65 kb處，是GPTV主要的保護(hù)性抗原基因，由其編碼的P32蛋白是病毒的囊膜蛋白，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生中和抗體[8-9]。目前，雖然已有很多關(guān)于P32蛋白的研究報道，可是P32蛋白表達(dá)比較困難，表達(dá)效率較低，所以P32蛋白的高效表達(dá)對該蛋白的功能研究以及山羊痘疫苗的研制具有重大意義，其免疫原性研究也將會進(jìn)一步明確該蛋白在山羊痘診斷與防治中的作用。本研究進(jìn)行了GTPV P32基因擴(kuò)增，構(gòu)建了P32基因的原核表達(dá)載體pET-P32，并將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌（E.coli）BL21中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；運(yùn)用Western-blot檢測了P32蛋白的表達(dá)情況與特異性，運(yùn)用ELISA檢測方法和小鼠淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)對該蛋白的免疫原性進(jìn)行了檢測。

1 材料與方法

1.1 毒株、菌株和質(zhì)粒

山羊痘病毒株（GTPV-S-1），由甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所動物醫(yī)學(xué)研究室保存；工程菌DH5α、BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，均購自寶生物工程（大連）有限公司；質(zhì)粒pET-28a（+），購自Thermo Fisher 科技公司。

1.2 主要試劑

DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒，均購自AXYGEN公司；2×P?uPCR Master Mix、T4 DNA連接酶和限制性內(nèi)切酶NcoⅠ、XhoⅠ，均購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA Marker 和蛋白Marker，購自生工生物工程（上海）股份有限公司；異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、His-Bind Column（Ni-NTA）樹脂，購自北京索萊寶科技有限公司；HRP標(biāo)記的兔抗小鼠IgG、弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑，均購自Sigma公司。

1.3 試驗(yàn)動物

SPF級BALB/c小鼠，雌性，4～6周齡，體重16～18 g，購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.4 方法

1.4.1 GTPV P32基因的擴(kuò)增。參照GenBank中公布的GTPV P32基因序列，分析表達(dá)載體pET-28a（+）的酶切位點(diǎn)序列；應(yīng)用Primer 5.0軟件，設(shè)計P32基因的原核表達(dá)引物。序列如下：5′-ATCCATGGCAGATATCCCATTATATG-3′（下劃線處為NcoⅠ）；下游引物：5′-ATCTCGAGTCTAT GAGCCATCCATTTTC-3′（下劃線處為XhoⅠ）。上述引物由蘇州泓訊生物科技有限公司合成。收集GTPV病毒液，運(yùn)用DNA提取試劑盒（Qiagen公司）提取GTPV DNA；以提取的GTPV DNA為模板，加入上下游引物，配置反應(yīng)體系，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化回收。

1.4.2 GTPV P32基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建。將純化回收的P32基因擴(kuò)增產(chǎn)物和pET-28a（+）分別進(jìn)行NcoⅠ+XhoⅠ雙酶切；將酶切產(chǎn)物回收，用T4 DNA連接酶16 ℃恒溫連接；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行平板培養(yǎng)，挑取單個菌落進(jìn)行搖菌培養(yǎng)；提取菌液的重組質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定；將鑒定正確的重組質(zhì)粒送上海桑尼生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序；測序正確后將其保存?zhèn)溆?，并將重組質(zhì)粒命名為pET-P32。

1.4.3 重組蛋白的表達(dá)純化。將構(gòu)建的pET-P32重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌BL21（DE3）中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600nm值為0.4～0.9，此時加入IPTG 至終濃度為1.0 mol/L；分別誘導(dǎo)培養(yǎng)3、4、5、6 h，同時設(shè)pET-28a（+）空載體轉(zhuǎn)化菌的誘導(dǎo)對照，于4℃離心，收集菌體；最后一次收集菌體后，將其置于冰浴中超聲裂解（400 W功率）3 s，間隔15 s，超聲40 min；然后10 000 g 離心10 min，分別收集上清與沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE鑒定；然后利用北京索萊寶科技有限公司的鎳柱His-Bind Column（Ni-NTA）純化系統(tǒng)，純化P32重組蛋白。

1.4.4 重組蛋白的Western blot鑒定。取純化后的P32重組蛋白稀釋液（1∶100）50 μL與等體積的2×SDS-PAGE上樣緩沖液混勻，并用50 μL ddH2O與等體積的2×SDS-PAGE上樣緩沖液混勻作為陰性對照，均沸水煮10 min后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析；電泳分析后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，置于5%的脫脂奶粉溶液，4 ℃過夜封閉。用PBST洗膜3次，每次10 min；加入GTPV全病毒血清，置于37 ℃孵育2 h后，用PBST洗膜3次；將HRP標(biāo)記的兔抗小鼠IgG，用PBST以1∶4 000稀釋后加入，置37 ℃孵育2 h，用PBST洗膜3次；最后用15 mg DAB粉末和9 mg CoCl2·6H2O溶于30 mL PBS，混勻，再加入10 μL過氧化氫配置的顯色液進(jìn)行顯色，最后用PBS終止反應(yīng)。

1.4.5 重組蛋白免疫小鼠血清抗體ELISA檢測。將40只4～6周齡雌性BALB/c小鼠，隨機(jī)分為4組。A組：p32重組蛋白免疫組；B組：山羊痘活疫苗免疫組；C組：GST標(biāo)簽蛋白免疫組；D組：PBS免疫組。按照各組對應(yīng)抗原，共免疫3次：初免按照100 μg∕只的劑量，將各組對應(yīng)抗原與等體積的弗氏完全佐劑充分乳化后，經(jīng)腹股溝和腳掌板皮下免疫小鼠；初次免疫后14 d，將各組對應(yīng)抗原與等體積的弗氏不完全佐劑充分乳化后等劑量加強(qiáng)免疫1次；初次免疫后21 d，將各組對應(yīng)抗原等劑量再加強(qiáng)免疫1次。在第3次免疫后0、7、14、21、28 d，分別采集小鼠尾靜脈血，分離血清，采用間接ELISA方法檢測各組血清抗體。

1.4.6 重組蛋白刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖。將斷頸法處死的小鼠，在75%的乙醇中浸泡 5 min 左右；無菌取出小鼠脾臟，用 1 mL RPMI-1640 培養(yǎng)液沖洗脾臟，然后將其轉(zhuǎn)移到裝有200目尼龍網(wǎng)的小培養(yǎng)皿內(nèi)；加入 1 mL RPMI-1640 培養(yǎng)液，用玻璃針芯充分研磨；吸取淋巴細(xì)胞懸液至2 mL離心管內(nèi)，4 ℃ 2 000 r/min 離心 5 min；用移液器吸棄上清液，加入2 mL紅細(xì)胞裂解液，重懸沉淀，37 ℃水浴 3～5 min；之后立即 4 ℃ 2 000 r/min 離心 5 min；用移液器吸棄上清液，加入1 mL RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，4 ℃ 2 000 r/min離心5 min；重復(fù)該步驟，一次完全去除紅細(xì)胞裂解液；用移液器吸棄上清液，加入1 mL RPMI-1640 培養(yǎng)液（含10%犢牛血清）重懸細(xì)胞，冷卻后80倍稀釋成單細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)；用RPMI-1640（含 10%犢牛血清）培養(yǎng)液將計數(shù)的淋巴細(xì)胞懸液濃度調(diào)整為2×106個/mL；將淋巴細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中（100 μL/孔）；對應(yīng)孔中分別加入100 μL特異性刺激原重組P32蛋白（100 μg/mL）、100 μL非特異性刺激原ConA（刀豆蛋白10 μg/mL）及100 μL PRMI-1640培養(yǎng)液；對不同刺激原，重復(fù)3個孔，同時以只加200 μL PRMI-1640培養(yǎng)液、無淋巴細(xì)胞的孔作為本底，于37℃ CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)68 h；每孔加入20 μL濃度為5 mg/mL的MTT（3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2、5-二苯基溴化四唑），避光培養(yǎng)4 h；每孔吸棄100 μL培養(yǎng)液，加入DMSO（二甲基亞砜）100 μL；10 min內(nèi)，用酶標(biāo)儀測定各孔的OD490nm；計算刺激指數(shù)（SI）。SI=（刺激組OD值-本底值）/（未刺激組OD值-本底值）。

2 結(jié)果

2.1 GTPV P32基因的擴(kuò)增

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為882 bp（圖1），與預(yù)期的P32基因的大小一致。

圖1 P32基因的PCR擴(kuò)增

2.2 GTPV P32基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建

將重組質(zhì)粒pET-P32進(jìn)行XhoⅠ和NcoⅠ雙酶切。電泳鑒定顯示有5 369 bp和882 bp的載體和目的片段，與預(yù)期結(jié)果一致（圖2），表明表達(dá)載體pET-P32構(gòu)建成功。

圖2 重組質(zhì)粒pET-P32酶切鑒定

2.3 重組蛋白的表達(dá)純化

SDS-PAGE分析表明：誘導(dǎo)后的重組菌pET-P32/BL21（DE3）在相對分子質(zhì)量約39 kDa處，可見1條特異的蛋白條帶；其大小與預(yù)期一致，且主要以包涵體的形式存在，并得到純化（圖3）。

圖3 重組蛋白P32表達(dá)與純化SDS-PAGE分析

2.4 重組蛋白的Western blot鑒定

Western-blot結(jié)果顯示：制備的重組蛋白可與GTPV全病毒血清發(fā)生特異性反應(yīng)；在相對分子質(zhì)量約39 kDa處可見反應(yīng)條帶，而陰性對照未見該條帶（圖4）。結(jié)果證實(shí)P32蛋白在該系統(tǒng)中獲得了表達(dá)，且具有較強(qiáng)的特異性。

圖4 Western-blot鑒定重組蛋白P32

2.5 重組蛋白免疫小鼠血清抗體ELISA檢測

各試驗(yàn)組小鼠血清抗體的ELISA檢測結(jié)果見表1。免疫后7 d，注射重組蛋白P32免疫組和山羊痘疫苗組的抗體水平開始升高，顯著高于GST標(biāo)簽蛋白免疫組和PBS組，14 d抗體水平達(dá)到最高；山羊痘活疫苗組的抗體水平也顯著高于重組P32蛋白組，而GST標(biāo)簽蛋白免疫組和PBS組的抗體水平?jīng)]有明顯變化。

表1 ELISA檢測血清抗體OD492值

2.6 重組蛋白刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖

將分離的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)2 d后，顯微鏡下可見用ConA及P32重組蛋白刺激孔內(nèi)的淋巴細(xì)胞開始增殖，出現(xiàn)細(xì)胞團(tuán)，而無刺激源的孔內(nèi)淋巴細(xì)胞不增殖。68 h后，加入MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再加入DMSO，用酶標(biāo)儀測OD490nm，計算淋巴細(xì)胞分裂指數(shù)。結(jié)果顯示：特異性刺激組小鼠淋巴細(xì)胞分裂指數(shù)均值為5.2，非特異性刺激組均值為2.1（圖5），兩者差異極顯著（P＜0.05）。結(jié)果證明，用重組蛋白P32作為特異性刺激源刺激后，淋巴細(xì)胞發(fā)生分裂增殖。

圖5 淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)

3 討論

山羊痘是主要引起山羊和綿羊全身起痘、發(fā)熱等癥狀的一種烈性傳染病，呈世界性分布，常呈暴發(fā)性或地方性流行[10]。被感染的山羊和綿羊通過口腔、鼻腔和眼分泌物排毒，并通過氣溶膠和直接接觸傳播[11]。本病具有較高的死亡率，可使羔羊100%死亡，嚴(yán)重制約了我國養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展[12]。P32蛋白是GTPV的主要囊膜蛋白，在病毒感染早期能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫[13-14]。研究表明，P32蛋白是目前分離鑒定的所有山羊痘病毒株中共有的特異性高、免疫原性強(qiáng)的結(jié)構(gòu)蛋白[9，15]。目前，針對P32蛋白的研究已有很多報道，但是P32蛋白的體外表達(dá)效率不高，而針對P32蛋白的免疫原性系統(tǒng)研究卻鮮有報道。原核表達(dá)的重組蛋白產(chǎn)物保持了很完整的抗原性，甚至生物學(xué)活性，可以用于制備針對特定蛋白的多抗血清。P32蛋白原核高效誘導(dǎo)表達(dá)可為山羊痘的診斷與疫苗研究奠定基礎(chǔ)。其免疫原性研究也進(jìn)一步奠定了該蛋白在山羊痘診斷與疫苗研究方面的不可替代作用。

本試驗(yàn)將P32基因克隆入原核表達(dá)載體pET-28a（+）。為了高效表達(dá)出P32蛋白，進(jìn)行了表達(dá)條件優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)在IPTG濃度為1.0 mmol/L、低溫低轉(zhuǎn)速長時的誘導(dǎo)表達(dá)效率最高。P32蛋白的高效表達(dá)，為P32蛋白的功能研究以及山羊痘疫苗研制提供了重要的實(shí)驗(yàn)材料。運(yùn)用GTPV全病毒血清作為一抗，進(jìn)行Western-blot鑒定，發(fā)現(xiàn)表達(dá)的P32蛋白具有較強(qiáng)的特異性與生物學(xué)活性。將P32重組蛋白、山羊痘活疫苗、GST標(biāo)簽蛋白和PBS免疫小鼠，然后采集小鼠血清，運(yùn)用ELISA進(jìn)行抗體檢測，發(fā)現(xiàn)P32重組蛋白免疫組與GST標(biāo)簽蛋白以及PBS免疫組抗體水平差異顯著。這表明P32蛋白能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫。P32重組蛋白刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果顯示，特異性刺激組與非特異性刺激組小鼠淋巴細(xì)胞分裂指數(shù)差異顯著，表明P32蛋白能夠引起機(jī)體較強(qiáng)的細(xì)胞免疫。這兩項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果均表明該蛋白具有良好的免疫原性。

[1] TUPPURAINEN E S M，VENTER E H，SHISLER J L，et al.Review：Capripoxvirus diseases∶ current status and opportunities for control[J]. Transboundary & emerging diseases，2017，4（3）：64（3）：729-745.

[2] 陳伯祥，楊明，賀泂杰，等. 抗山羊痘病毒P32蛋白雜交瘤細(xì)胞的構(gòu)建及其單克隆抗體的制備[J]. 中國動物檢疫，2015，32（12）：66-68.

[3] TAO Z，JIA H，CHEN G，et al. Phylogenetic analysis of Chinese sheeppox and goatpox virus isolates[J]. Virology journal，2012，9（1）：1-8.

[4] KARIM A，BHATTACHARJEE U，PURO K，et al.Detection of Peste despetits ruminantsvirus and goatpox virus from an outbreak in goats with high mortality in Meghalaya state，India[J]. Veterinary world，2016，9（9）：1025-1027.

[5] ZHAO Y L，WU G H，Zhu H X，et al. Cloning and sequence analysis of a6l gene of goatpox virus[J]. China animal husbandry & veterinary medicine，2015，42（8）：1973-1978.

[6] CHI X L，ZENG X C，LI W，et al. Complete genome sequence analysis of goatpox virus isolated from China shows high variation[J]. Veterinary microbiology，2014，173（1/2）：38-49.

[7] MATHIJS E，VANDENBUSSCHE F，HAEGEMAN A，et al. Complete genome sequence of the goatpox virus strain gorgan obtained directly from a commercial live attenuated vaccine[J]. Genome announcements，2016，4（5）：e01113-01116.

[8] 蘆曉立，張強(qiáng). 羊痘病毒P32基因與羊CD58基因共表達(dá)載體的構(gòu)建[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2014，49（6）：1-4.

[9] DEZHI P U，GONG C Y，LIU Y，et al. Prokaryotic expression and bioinformatics analysis of goatpox virus p32 gene[J]. Biotechnology，2012，4）：432-453.

[10] EMBURY-HYATT C，BABIUK S，MANNING L，et al.Pathology and viral antigen distribution following experimental infection of sheep and goats with capripoxvirus[J]. Journal of comparative pathology，2012，146（2/3）：106-115.

[11] DIALLO A，VILJOEN G J. Genus capripoxvirus[J].Birkh?user basel，2007：167-181.

[12] SANTHAMANI R，YOGISHARADHYA R，VENKATESAN G，et al. Detection and differentiation of sheeppox virus and goatpox virus from clinical samples using 30 kDa RNA polymerase subunit（RPO30）gene based PCR[J]. Veterinary world，2013，6（11）：923-925.

[13] 丁軍濤，王穎，張雪彬，等. 山羊痘病毒P32抗原基因口服活載體DNA疫苗的構(gòu)建[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2017（3）：1673-4696.

[1 4] B H A N O T V，B A L A M U R U G A N V，BHANUPRAKASH V，et al. Expression of P32 protein of goatpox virus in Pichia pastoris and its potential use as a diagnostic antigen in ELISA[J]. Journal of virological methods，2009，162（1/2）：251.

[15] GUO J，ZHENG M，LIU Q. Expression of P32 gene of goatpox virus in baculovirus[J]. Chinese journal of veterinary science & technology，2005，35（9）：679-683.

（責(zé)任編輯：朱迪國）

Prokaryotic Expression and Immunogenicity Research on P32 Protein of Goatpox Virus

Cheng Weiwei，Chen Boxiang，Yang Ming，Li Jie
（Gansu Institute of Animal and Veterinary Science，Pingliang，Gansu 744000）

To study the immunogenicity and expression of P32 protein from goatpox virus，a recombinant plasmids was constructed and named as pET-P32.The P32 protein was induced expression and purified，and was analyzed by SDA-PAGE，its biological activity was determined by Western blot. BALB/c mice were immunized with the purified and determined the recombinant P32 protein to produce immune serum. Polyclonal antibody from immune serum was detected by enzyme linked immunosorbent assay（ELISA），cellular immune function of P32 protein induced organic immune system was detected by experiment of spleen lymphocyte proliferation of mice. The results indicated that the expressed P32 protein，with about 39 KDa molecular weight，showed a good antibody specificity by Western blot，the P32 protein showed a good immunogenicity by enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）and experiment of spleen lymphocyte proliferation of mice. The results laid the solid foundation for the further study on biological function of P32 protein and diagnosis and prevention of Goatpox virus.

Goatpox virus；P32 protein；immunogenicity

S851.3

A

1005-944X（2017）11-0094-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.11.025

甘肅省科技支撐計劃（1104NKCL097）

陳伯祥