張二芹 ， 滕 蔓 ， 羅 俊 ， 趙孟孟 ， 許倩茹 ， 趙 東 ， 鄧瑞廣 ， 張改平

(1.河南省農業(yè)科學院 河南省動物免疫學重點實驗室 農業(yè)部動物免疫學重點實驗室 ， 河南 鄭州 450002 ；2.河南農業(yè)大學牧醫(yī)工程學院 ， 河南 鄭州 450002)

豬乙型腦炎病毒EDⅢ蛋白的原核表達、純化及活性檢測

張二芹1，2， 滕 蔓1， 羅 俊1， 趙孟孟2， 許倩茹2， 趙 東1， 鄧瑞廣1， 張改平2

(1.河南省農業(yè)科學院 河南省動物免疫學重點實驗室 農業(yè)部動物免疫學重點實驗室 ， 河南 鄭州 450002 ；2.河南農業(yè)大學牧醫(yī)工程學院 ， 河南 鄭州 450002)

在大腸桿菌BL21(DE3)中表達乙腦病毒(JEV)EDⅢ蛋白、鎳柱純化并檢測表達蛋白。采用RT-PCR方法擴增EDⅢ基因片段，構建重組表達載體pET-28a-EDⅢ并轉化到BL21(DE3)菌，經IPTG誘導蛋白表達，表達可溶性產物經Ni-NTA親和層析純化，最后通過SDS-PAGE和Western-Blot檢測表達蛋白。結果成功構建原核表達載體pET-28a-EDⅢ；EDⅢ蛋白在BL21(DE3)菌已表達，經Ni-NTA獲得純化蛋白，并經Western-Blot檢測具有反應活性。

乙腦病毒 ； EDⅢ蛋白 ； 表達蛋白

乙腦是由日本乙型腦炎病毒引起的一種急性人獸共患傳染病。經三帶喙庫蚊等蚊蟲叮咬傳播感染中樞神經系統(tǒng)。JEV屬于黃病毒科黃病毒成員,乙腦病毒為球形，直徑40 nm，單股正鏈RNA病毒。病毒基因組全長約為11 kb，自5′至3′依次編碼結構蛋白C、M、E及非結構蛋白NS1-NS5。結構蛋白E[1-8]是JEV的主要保護性抗原，E糖蛋白上有中和抗原表位和血凝抗原表位，可誘發(fā)機體產生中和抗體和血凝抑制抗體，從而保護機體免受病毒的攻擊。研究發(fā)現,E蛋白的抗原決定簇分為3個區(qū)域，即EDⅠ,EDⅡ和EDⅢ。其中EDⅢ蛋白具有免疫球蛋白樣結構，包含有中和抗原表位，可作為黃病毒科血清學診斷抗原及免疫接種該蛋白可抗病毒。因此本試驗進行了EDⅢ原核表達、純化及生物活性檢測，為進一步研究病毒的特性、診斷試劑及新型疫苗等奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 pET-28a表達載體和BL21(DE3)宿主菌為本實驗室保存。EDⅢ-F，EDⅢ-R引物合成及測序由上海生工生物工程技術服務有限公司完成；限制性內切酶EcoRⅠ和XhoⅠ，Ex-Taq聚合酶、連接試劑盒及反轉錄試劑盒，購自寶生物工程(大連)有限公司；JEV兔源多克隆抗體由本實驗室保存；羊抗兔二抗，購自北京博奧星生物技術有限責任公司。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 根據GenBank登錄JEV株SA-14-14-2 EDⅢ序列合成一對引物，序列如下：

EDⅢ-F：5′- ccggaattcgacaaactggctctgaaag-3′(下劃線為EcoRⅠ酶切位點)。

EDⅢ-R：5′- atactcgagcgtgcttccagctttgtg-3′(下劃線為XhoⅠ酶切位點)。

1.2.2 EDⅢ基因的擴增及pET-28a載體的構建

根據TRIZol試劑盒說明書提取JEV RNA，合成cDNA的條件如下：模板RNA 10μL，EDⅢ-R引物1μL,70 ℃水浴10 min,冰上放置5 min,加6 μL預混液(4uL 5×Buffer,1μL dNTP,0.5 μL RNase inhibitor, 0.5 μL M-MLV)42 ℃水浴1 h，72 ℃滅活10 min。進行RT-PCR擴增，反應條件：95 ℃ 5 min;94 ℃30 s,53 ℃ 40 s,72 ℃45 s,30個循環(huán)72 ℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠分析擴增產物，EcoRⅠ和XhoⅠ酶切回收EDⅢ和pET-28a，連接，轉化EcoliBL21(DE3)感受態(tài)細胞。挑取單菌落，菌液PCR，提質粒和酶切鑒定重組載體，測序，保留陽性菌種。

1.2.3EcoliBL21(DE3)的誘導表達 取鑒定正確的菌種過夜培養(yǎng)，按1∶100比例加入新鮮LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當OD600=0.4～0.6時，加入IPTG終濃度為0.5 mmol/L，誘導8 h。10 000 r/min離心1 min收集菌體，PBS溶解，超聲破碎，收集沉淀，加入 5×SDS上樣緩沖液進行樣品處理，取上述樣品做SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色，最后脫色，觀察結果。

1.2.4 表達蛋白的純化 離心收集菌體，用50 mmol/L的PBS重懸菌液，超聲破碎(破碎5s，間隔5s，共10 r/min),10 000 r/min離心10 min，收集上清，鎳離子親和層析柱(Ni-NTA)純化蛋白，20 mmol/L咪唑漂洗液平衡鎳柱，最后用100 mmol/L咪唑洗脫液洗脫蛋白，收集洗脫液，取不同濃度咪唑洗脫液進行SDS-PAGE分析。

1.2.5 Western-Blot檢測EDⅢ 按文獻[7]的方法進行。

2 結果

2.1 RT-PCR擴增EDⅢ JEV的EDⅢ基因的RT-PCR擴增產物于1%瓊脂糖凝膠中電泳，結果大約在約330 bp處有一條電泳帶, 與預期片段大小相符(圖1)。

圖1 JEV EDⅢ基因的RT-PCR擴增產物1:標準DNA分子質量； 2.EDⅢ基因RT-PCR產物

2.2 重組表達質粒pET-28a-EDⅢ的鑒定 將EDⅢ與表達載體pET-28a連接，并轉化至大腸桿菌BL21(DE3)，挑單菌落培養(yǎng)后,通過菌液PCR擴增及重組質粒酶切鑒定，可見2條分別為5 300 bp和330 bp左右的片段，與預期結果一致(圖2)。

圖2 重組質粒pET-28a-EDⅢ的鑒定1,4：標準DNA分子質量 ；2：菌液的PCR擴增產物；3：重組質粒pET-28a-EDⅢ的酶切產物；

2.3 表達產物SDS-PAGE分析 鑒定的陽性菌株EcoliBL21(DE3)經0.5 mmol/L的IPTG誘導8 h后，SDS-PAGE分析表達蛋白，結果大約在13 ku處有一條明顯的特異性蛋白條件，大小與預期結果相符(圖3)。

2.4 EDⅢ融合蛋白的純化 利用Ni-NTA agarose柱,通過親和層析純化EDⅢ融合蛋白，表達菌體BL21(DE3)經沉淀、超聲、變性、純化得到EDⅢ蛋白，純化的蛋白透析和濃縮后，應用紫外光吸收定量法測得蛋白濃度為1.9 g/L(圖4)。

圖3 EDⅢ蛋白的SDS-PAGE分析1：預染蛋白質Marker; 2：未誘導的pET-28a-EDⅢ;3：誘導的pET-28a-EDⅢ

圖4 EDⅢ融合蛋白的純化1：預染蛋白質Marker; 2：流穿樣品r； 3,4： 平衡Buffer；5-9：洗脫的蛋白

2.5 Wetsrn-Blot檢測EDⅢ蛋白 表達產物經過純化、濃縮后，經過Western-Blot分析，結果與JEV兔源多克隆抗體呈現陽性反應，而且無非特異性條帶，顯示表達產物的抗原性較好(圖5)。

圖5 表達產物的Western-Blot 分析1：預染蛋白質Marker； 2：EDⅢ蛋白； 3：陰性對照

3 討論

乙腦是由乙腦病毒經三帶喙庫蚊等蚊蟲叮咬傳播而引起的一種中樞神經系統(tǒng)感染的急性傳染病，也是一種人獸共患的自然疫源性疾病。豬感染乙腦后，其主要特征為高熱、流產、死胎和公豬睪丸炎,因此對養(yǎng)豬業(yè)也造成重大的經濟損失。

為了減少養(yǎng)豬業(yè)的經濟損失，應在潛伏期或更早階段進行檢測和鑒別診斷，以便進行積極預防。乙腦病毒E囊膜結構蛋白分為3個抗原域，其中EDⅢ區(qū)域8有中和抗原表位、可作為黃病毒科血清學診斷抗原及免疫接種該蛋白可抗病毒。Senji Tafuku9等人用大腸桿菌表達JEV的EDⅢ蛋白免疫小鼠，具有保護作用。本研究將EDⅢ基因定向克隆到pET-28a載體中，轉到入BL21(DE3)菌，對表達產物經過可溶性鑒定，以可溶的形式存在，Ni-NTA純化的EDⅢ蛋白，經SDS-PAGE檢測，純度可達到95%以上。通過Western-Blot鑒定，在13 ku處有條帶，與預期結果相符。表達的蛋白能與JEV的兔源多克隆抗體反應，表明具有較好的反應原性，這為以后作為診斷試劑及新型疫苗奠定基礎。

[1] 閆麗萍, 華榮虹, 亓文寶,等.乙型腦炎病毒E蛋白抗原優(yōu)勢區(qū)域的鑒定[J].中國動物傳染病學報，2009,17(3)：8-12.

[2] Lin C W, Wu S C.A functional epitope determinant on domain Ⅲ of the Japanese encephalitis virus envelope interacted with neutralizing-antibody combining sites[J]. J.Virol, 2003, 77 (4):2 600-2 606.

[3] Alka, Bharati K, Malik Y P,etal.Immunogenicity and protective efficacy of the E.coli expressed domain Ⅲ of Japanese encephalitis virus envelope protein in mice[J].Med Microbiol Immunol,2007,196:227-231.

[4] Verma S K, Kumar S, Gupta N,etal. Bacterially expressed recombinant envelope protein domain Ⅲ of Japanese encephalitis virus(rJEV-DⅢ) elicits Th1 type of immune response [J]. Vaccine,2009,27:6 905-6 909.

[5] Wei J C, Huang Y Z, Zhong D K,etal. Design and evaluation of multi-epitope peptide against Japanese encephalitis virus infection in BALB/c mice[J].Biochem and Biophy Res Commun, 2010, 396:787-792.

[6] 劉昊，尹革芬，魯會軍，等.乙型腦炎病毒E蛋白基因的原核表達及ELISA抗體檢測方法的建立[J].中國獸醫(yī)科學，2010,40(4)：390-394.

[7] F.奧斯伯，R.布倫特，R.E.金斯頓，等.精編分子生物學實驗指南[M].顏子穎，王海林譯.北京：科學出版社.1999:366-373.

[8] Chávez J H, Silva J R, Amarilla A A,etal. Domain Ⅲ peptides from flavivirus envelope protein are useful antigens for serologic diagnosis and targets for immunization [J]. Biologicals, 2010,38:613-618.

[9] Tafuku S, Miyata T, Tadano M,etal. Japanese encephalitis virus structural and nonstructural proteins expressed in Escherichia coli induce protective immunity in mice[J].Microbes and Infect,2012,14: 169-176.

ProkaryoticExpression,PurificationandActivityDetectionofPorcineJEVEDⅢProtein

ZHANG Er-qin1，2, TENG Man1, LUO Jun1, ZHAO Meng-meng2, XU Qian-ru2, ZHAO Dong1,DENG Rui-guang1, ZHANG Gai-ping2

(1.Henan Key Laboratory of Animal Immunology,Key Laboratory of Animal Immunology of the Ministry of Agriculture,Henan Academy of Agricultural Science, Zhengzhou 450002,China ； 2.College of Animal Scinece and Veterinary Medicine,Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002,China)

EDⅢ protein of Japanese encephalitis virus(JEV) was expressed, purified and identified in Escherichia coli BL21(DE3).The gene encoding EDⅢ protein was amplified with RT-PCR and the constructed recombinant plasmid pET28a-EDⅢ was transformed into BL21(DE3). EDⅢ solubility protein by IPTG was expressed, purified by Ni-NTA affinity chromatography and identified by SDS-PAGE and western-blot.The result showed that the recombinant plasmid pET28a-EDⅢ was successfully constructed, expressed in Escherichia coli BL21(DE3).The purified protein by Ni-NTA affinity chromatography possessed reactivity with its specific antibody confirmed by western-blot.

Japanese encephalitis virus ； domain Ⅲof envelope protein ; expression protein

ZHANG Gai-ping

S852.65+1

A

0529-6005(2017)09-0028-03

2016-12-16

河南省博士后科研資助項目(2013047)；河南省科技攻關計劃項目(152102110127)；河南省農業(yè)科技推廣財政補助資金項目(YCN201519111)

張二芹(1976-)，女，副教授，博士，主要從事動物分子病毒學及轉基因植物疫苗的研究，E-mail:zhangerqin76@163.com

張改平，E-mail:zhanggaiping2003@163.com