王 羽 ， 董文龍 ， 王 巍 ， 張喜慶 ， 田佳琪 ， 馬紅霞 ， 高云航

(吉林農業(yè)大學動物科學技術學院 ， 吉林 長春 130118)

牛源多殺性巴氏桿菌莢膜血清型及毒力基因檢測

王 羽 ， 董文龍 ， 王 巍 ， 張喜慶 ， 田佳琪 ， 馬紅霞 ， 高云航

(吉林農業(yè)大學動物科學技術學院 ， 吉林 長春 130118)

為了確定12株牛源多殺性巴氏桿菌的血清型及毒力基因的攜帶情況，本研究采用PCR技術對12株牛源多殺性巴氏桿菌(pasteurella maltocida,Pm)進行莢膜血清型鑒定和6種毒力基因(tbpA、hgbA、hgbB、ptfA、pfhA、toxA)的檢測，并對其序列進行比對分析。結果顯示：12株多殺性巴氏桿菌均為莢膜血清A型；100%的莢膜血清A型Pm攜帶hgbA毒力基因和pfhA毒力基因；41.67%的莢膜血清A型Pm攜帶nanH毒力基因；58.33%的莢膜血清A型Pm攜帶ptfA毒力基因；而對于tbpA與toxA兩種毒力基因在12株牛源莢膜血清A型Pm中均未檢測到。

多殺性巴氏桿菌 ； 莢膜血清型 ； 毒力基因

多殺性巴氏桿菌是重要的畜禽致病菌，可引起多種動物出現(xiàn)巴氏桿菌病。根據菌株間抗原差異，多殺性巴氏桿菌可分為多個血清型。根據被動血凝試驗對莢膜抗原(K抗原)可分為A、B、D、E和F 5個血清型，用凝集反應對菌體抗原(O抗原)分類，可分為12個血清型，用瓊脂擴散試驗對熱浸出菌體抗原分類可分為16個血清型[1]。多殺性巴氏桿菌血清型與致病性存在一定的相關性，如A型可以引起禽霍亂、豬肺疫；B型可以引起牛和豬等動物的敗血癥；D和E型可以引起豬、牛、兔、羊等動物的肺炎和敗血癥；F型主要發(fā)生于火雞，其致病作用目前尚不清楚[2]。同時相關試驗已廣泛證實，Pm的莢膜在抗吞噬作用中也起著重要作用，且菌體抗吞噬作用的敏感性與莢膜的存在及厚度有關[3]。各血清型多殺性巴氏桿菌的流行性存在較大差異，具有明顯的地方特性，故相同血清型不同地方分離的菌株毒力可能不同[1，4]。

Faham Khamesipour等從333頭健康及患病牛體內分離了30株多殺性巴氏桿菌，并進行了莢膜基因及23個毒力相關基因的檢測，23株為莢膜A型多殺性巴氏桿菌，56.5%菌株攜帶pfhA基因，78.3%菌株攜帶tbpA和nanH基因，ptfA及nanH基因攜帶率為82.6%，87.0%菌株攜帶hgbA基因，hgbB基因攜帶率高達100%，但只有13.0%菌株攜帶toxA基因[5]。本研究對從吉林省不同地區(qū)分離得到的牛源莢膜血清A型多殺性巴氏桿菌的毒力基因進行檢測，為客觀評估牛巴氏桿菌病的危害提供依據。

1 材料與方法

1.1 菌種 經分離并鑒定的12株牛源多殺性巴氏桿菌保存于吉林農業(yè)大學動物科學技術學院預防獸醫(yī)學研究室。

1.2 主要試劑 胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)，購自青島高科園海博生物技術有限公司；胎牛血清，購自北京元亨圣馬生物技術研究所；ExTaq酶、dNTPs、DNA Marker 2 000、6×ExBuffer等，購自TaKaRa公司；膠回收試劑盒等，購自上海生工生物工程技術服務有限公司。

1.3 致病性試驗 將分離純化的菌株接種到TSA培養(yǎng)基(含50 mL//L 胎牛血清)，37 ℃培養(yǎng)24 h。并進行擴菌培養(yǎng)，并將菌液按10倍系數(shù)倍比稀釋。隨機將小鼠分為13組，每組5只。試驗組每只注射0.3 mL 多殺性巴氏桿菌，對照組每只小鼠接種0.3 mL 生理鹽水。觀察并記錄各組小鼠的發(fā)病及死亡情況，以寇氏改良法計算半數(shù)致死量(LD50) ， 同時采集死亡小鼠的肝臟、心臟進行細菌的分離鑒定。

1.4 PCR鑒定 參考Laxmi Narayan Sarangi[5]等報道的多殺性巴氏桿菌莢膜血清型基因hyaD-hyaC、bcbD、dcbF、ecbJ、fcbD(如表1)和毒力基因tbpA、hgbA、hgbB、ptfA、pfhA、toxA設計引物(如表2)，并送往(上海)生工生物工程技術服務有限公司合成。

表1 莢膜血清型基因引物序列及預計大小

表2 毒力基因引物序列及預計大小

1.5 DNA提取及毒力基因擴增 挑取單個菌落接種于TSB液體培養(yǎng)基中(含50 mL//L 胎牛血清)，置于37 ℃水平搖床(170 r/min)增菌培養(yǎng)。取1.6 mL菌液12 000 r/min離心，棄上清，運用酚-氯仿法提取分離菌株DNA。

以提取的DNA為模板，對莢膜血清型和毒力基因進行擴增。PCR擴增條件為94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s；退火(退火溫度如表1、2)45 s；72 ℃ 45 s；30個循環(huán)；72 ℃延伸10min；4 ℃保存。隨后用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。對PCR產物進行膠回收純化，將純化的PCR產物和pMD-18T連接過夜，將連接產物轉化到E.coli.DH5α 感受態(tài)細胞，按照試劑盒提取質粒進行驗證，并送至上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

2 結果

2.1 致病性試驗結果 12株多殺性巴氏桿菌的LD50分別為6.29×105CFU/mL，2.1×103CFU/mL，3.5×105CFU/mL，7.1×108CFU/mL，4.32×105CFU/mL，1.23×104CFU/mL，2.9×105CFU/mL，6.78×105CFU/mL，1.42×104CFU/mL，9.3×105CFU/mL，1.9×106CFU/mL，4.5×105CFU/mL 。剖檢病死小鼠，觀察病變，并進行細菌分離及分子生物學鑒定，確定為多殺性巴氏桿菌。

2.2 莢膜血清型PCR擴增結果 以基因組DNA為模板，采用PCR技術對12株Pm進行莢膜型基因進行擴增，均擴增出1 000 bp大小左右的片段。擴增序列與GenBank上已公布的莢膜血清型特異性基因hyaD-hyaC多殺性巴氏桿菌(AY225345.1)序列同源性達到99%，據此可鑒定該菌為A型多殺性巴氏桿菌。hyaD-hyaC基因擴增結果如圖1。

圖1 hyaD-hyaC 基因擴增結果M:DL-2 000 Marker; Pm-1—Pm-2:多殺性巴氏桿菌

2.3 毒力基因擴增結果

2.3.1hgbA基因PCR擴增及序列檢測結果 10株菌擴增出約700 bp的片段，與預期片段大小相符，根據BLAST對比結果可知，菌株Pm-1、Pm-3、Pm-5、Pm-6、Pm-7、Pm-9、Pm-11擴增序列與GenBank上已公布的Pm毒力基因hgbA(登錄號AF237923.1)同源性為100%，Pm-2、Pm-4、Pm-8、Pm-10、Pm-12擴增序列與登錄號AF237923.1同源性為99%。hgbA基因擴增結果如圖2。

圖2 hgbA 基因擴增結果M:DL-2 000 Marker; Pm-1—Pm-2:多殺性巴氏桿菌

2.3.2nanH基因PCR擴增及序列檢測結果 菌株Pm-1、Pm-3、Pm-7、Pm-11、 Pm-12株Pm均擴增出900 bp左右的片段，該基因片段測序后使用BLAST對其堿基序列進行分析，其結果顯示，所擴增的nanH相應序列與GenBank上已公布的Pm毒力基因nanH(登錄號AF274869.1)序列同源性為95%。nanH基因擴增結果如圖3。

圖3 nanH基因擴增結果M:DL-2 000 Marker; Pm-1—Pm-2:多殺性巴氏桿菌

2.3.3pfhA基因PCR擴增及序列檢測結果 12株Pm均擴增出800 bp左右的片段，根據BLAST對比結果可知，菌株Pm-1、Pm-2、Pm-4、Pm-5、Pm-10、Pm-12與GenBank上已公布的Pm毒力基因pfhA(登錄號AF237929.1)同源性為100%，Pm-3、Pm-6、Pm-7、Pm-8、Pm-9、Pm-11與登錄號AF237929.1同源性為99%。12株Pm的pfhA基因擴增結果如圖4。

圖4 pfhA基因擴增結果M:DL-2 000 Marker;Pm-1—Pm-2:多殺性巴氏桿菌

2.3.4ptfA基因PCR擴增及序列檢測結果 菌株Pm-1、Pm-2、Pm-4、Pm-5、Pm-9、Pm-10、Pm-11均擴增出約400 bp左右大小的片段，進行BLAST分析，其結果顯示7株菌擴增序列與GenBank上已公布的Pm毒力基因ptfA(登錄號KP726888.1)同源性均為100%。ptfA基因擴增結果如圖5。

圖5 ptfA基因擴增結果M:DL-2 000 Marker;Pm-1—Pm-2:多殺性巴氏桿菌

2.3.5tbpA基因及toxA基因PCR擴增結果 以基因組DNA為模板，采用PCR技術對tbpA基因與toxA基因進行擴增，均未檢測到。

3 討論

多殺性巴氏桿菌是一種有莢膜的革蘭陰性桿菌，由于莢膜血清型決定病原菌的免疫原性，各血清型之間交叉免疫保護性較低，對該致病菌進行莢膜分型就顯得尤為重要[6]。1984 年Carter G R 等[7]提出多殺性巴氏桿菌血清型的標準定名，分為A、B、D、E 和F 5 個莢膜血清型。近年來在牛群中流行的主要是以引起肺部感染為主的莢膜血清A型巴氏桿菌[8]。本研究對在不同地區(qū)分離到12株多殺性巴氏桿菌進行血清分型，12株菌均為莢膜A型。

自從1959年世界衛(wèi)生組織(WHO)將巴氏桿菌病定為一類重要動物傳染病，Pm就一直受到各國學者的關注[9]。在本研究中對6種毒力基因的檢測結果顯示,12株牛源莢膜A型多殺性巴氏桿菌均擴增出pfhA基因和基因hgbA，菌株Pm-1、Pm-2、Pm-4、Pm-5、Pm-9、Pm-10、Pm-11含有基因ptfA，菌株Pm-1、Pm-3、Pm-7、Pm-11和Pm-12含有nanH基因。12株菌株均未擴增出toxA和tbpA基因。菌株Pm-1、Pm-2、Pm-4、Pm-9有相同的毒力基因，動物試驗結果表明不同菌株間其毒力存在一定差異，菌株2毒力最強，菌株4毒力最弱。通過本試驗可得出兩種推斷:(1)菌株2和4毒力差異可能與基因表達程度以及調控不同而造成;(2)可能還有其他基因參與。毒力因子之間的相互作用還有待于進一步研究。

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CapsularSerotypeandVirulenceGeneDetectiononBovineSourcePasteurellamultocida

WANG Yu , DONG Wen-long , WANG Wei , ZHANG Xi-qing , TIAN Jia-qi , MA Hong-xia , GAO Yun-hang

(College of Animal Science and Technology,Jilin Agricultural University, Changchun 130118,China)

To determine the serotype and virulence genes of 12 strains ofPasteurellamultocida. We use PCR technology for detection and sequence analysis of 12 Bovine sourcePasteurellamultocida(Pm)of capsular serotype and 6 virulence genes (ptfA,pfhA,hgbA,hgbB,tbpA,toxA).The results showed that all 12Pmstrains are capsular serotype A, 100% of the bovine source capsular serotype APmstrains carry virulence genespfhAand virulence genes hgbA；41.67% of bovine source capsular serotype APmstrains carry virulence genes nanH; 58.33% of bovine source capsular serotype APmstrains carry virulence genes ptfA; tbpA and toxA was not detected in 12 bovine source capsular serotype APmstrains.

Pasteurella multocida; capsular serotype;virulence genes

GAO Yun-hang

S852.65+3 文獻杯志碼：A

0529-6005(2017)09-0016-04

2017-03-12

王羽(1993-)，女，碩士生，研究方向為動物疫病防治，E-mail：1846020084@qq.com

高云航，E-mail：gaoyunhang@163.com