益氣活血組方對(duì)大鼠缺血心肌血管新生作用及對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和堿性成纖維生長(zhǎng)因子的影響

胡國(guó)恒 朱榮華 肖 青 邊冠積

(1 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，長(zhǎng)沙，410007； 2 湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，長(zhǎng)沙，410208)

益氣活血組方對(duì)大鼠缺血心肌血管新生作用及對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和堿性成纖維生長(zhǎng)因子的影響

胡國(guó)恒1朱榮華2肖 青2邊冠積2

(1 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，長(zhǎng)沙，410007； 2 湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，長(zhǎng)沙，410208)

目的：探討益氣活血組方對(duì)急性心肌梗死后大鼠缺血心肌組織血管新生作用和對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)表達(dá)的影響。方法：建立心梗模型后，將40只雄性SD大鼠，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為4組：模型組、假手術(shù)組、麝香保心丸、益氣活血組方。運(yùn)用免疫組化法檢測(cè)梗死心肌邊緣區(qū)微血管計(jì)數(shù)(MVC)和微血管密度(MVD)及VEGF和bFGF表達(dá)；同時(shí)應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測(cè)各組大鼠缺血心肌VEGF和bFGF蛋白質(zhì)水平表達(dá)變化。結(jié)果：益氣活血組方和麝香保心丸組分別與模型組比較，梗死心肌邊緣區(qū)微血管計(jì)數(shù)和微血管密度都顯著高于后者(P<0.01)。益氣活血組方、麝香保心丸組中缺血心肌VEGF和bFGF表達(dá)以及其蛋白表達(dá)水平較其余組顯著升高(P<0.01)。結(jié)論：益氣活血組方能明顯促進(jìn)心梗后大鼠缺血心肌血管新生，上調(diào)心肌VEGF和bFGF蛋白表達(dá)可能是其中一個(gè)重要的作用機(jī)制。

益氣活血；血管新生；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；堿性成纖維生長(zhǎng)因子

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)益氣活血組方對(duì)急性心肌梗死大鼠缺血心肌血管新生的影響的觀察，并且應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)大鼠缺血心肌微血管計(jì)數(shù)(MVC)和微血管密度(MVD)及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)表達(dá)，更進(jìn)一步地解釋益氣活血組方保護(hù)缺血心肌細(xì)胞，恢復(fù)心肌細(xì)胞功能，以及促進(jìn)血管新生的機(jī)制，為急性心肌梗死的中醫(yī)治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 健康雄性SD大鼠，體重(230±20)g，所有實(shí)驗(yàn)大鼠均由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。

1.1.2 藥物 益氣活血組方(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院研制)總共由4味藥組成：黃芪50 g、當(dāng)歸10 g、川芎25 g、丹參25 g；麝香保心丸：批準(zhǔn)文號(hào)為國(guó)藥準(zhǔn)字Z31020068；由上海和黃藥業(yè)有限公司提供。

1.1.3 試劑與儀器 進(jìn)口石蠟購(gòu)于徠卡儀器有限公司(德國(guó))；蘇木素-伊紅購(gòu)于Sigma公司(美國(guó))；兔抗鼠多克隆抗體CD34、VEGF、bFGF，山羊抗兔IgG均購(gòu)于Proteintech三鷹(德國(guó))；DAB顯色試劑盒購(gòu)于博士德生物公司(武漢)；紅細(xì)胞裂解液購(gòu)于Solarbio公司(上海)；DH-140小動(dòng)物呼吸機(jī)購(gòu)于奧爾特生物科技公司(上海)；Nihon Kohden型心電圖機(jī)購(gòu)于光電醫(yī)用電子儀器公司(上海)；低溫高速臺(tái)式離心機(jī)購(gòu)于賀利氏公司(德國(guó))；石蠟切片機(jī)、石蠟包埋機(jī)及冷凍臺(tái)購(gòu)于Leica公司(德國(guó))；流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀購(gòu)于BD公司(美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將40只雄性SD大鼠采用完全隨機(jī)的原則，共等分成假手術(shù)組、模型組、麝香保心丸組、益氣活血組方組，每組10只大鼠。大鼠飼養(yǎng)1周后開(kāi)始造模，心肌梗死模型參照文獻(xiàn)[1-2]復(fù)制。首先用10%水合氯醛按0.3 mL/100 g比例，經(jīng)腹腔麻醉動(dòng)物,然后氣管切開(kāi)，插管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，在第3～4肋間逐層打開(kāi)胸腔，剪開(kāi)心包膜、徹底暴露心臟，最后用1根零號(hào)醫(yī)用縫合線結(jié)扎左前降支，以心電圖出現(xiàn)QRS波群增高、增寬、ST段抬高為結(jié)扎成功標(biāo)志，逐層關(guān)胸。假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎，余步驟基本相同。

1.2.2 給藥方法 假手術(shù)組：每日用等體積蒸餾水灌胃。模型組：每日用等體積蒸餾水灌胃。麝香保心丸組：正常60 kg體重的成人，每日所需劑量為135 mg，大鼠給藥劑量的換算按成人與大鼠劑量的體表面積系數(shù)來(lái)計(jì)算，大鼠每日所需劑量為3.10 mg，將其溶于等體積蒸餾水中灌胃。益氣活血組方：正常60 kg體重成人，每日劑量為原方粉碎后100 g，計(jì)算方法同上，換算成大鼠的劑量為2.29 g，同樣溶于等體積蒸餾水中灌胃。手術(shù)后24 h開(kāi)始進(jìn)行灌胃，每天只灌胃1次，持續(xù)2周。

1.2.3 標(biāo)本留取 最后1次灌胃后，所有大鼠禁止喂食24 h，只給水，予以頸髓離斷法處死后，立即開(kāi)胸，留心臟標(biāo)本。因造模手術(shù)后大鼠死亡及取材時(shí)心臟標(biāo)本篩選，最后從4個(gè)組里面選取了6個(gè)心臟標(biāo)本用于指標(biāo)檢測(cè)。在約為心臟乳頭肌平面將心臟橫切為上下兩份,近心尖部梗死區(qū)用10%甲醛液固定，4 ℃冰箱保存,用于免疫組織化學(xué)染色及心肌微血管數(shù)及微血管密度等檢測(cè)；近心底部迅速凍存于-80 ℃冰箱。

1.2.4 大鼠梗死心肌邊緣區(qū)MVC和MVD指標(biāo)和檢測(cè)方法 血管內(nèi)皮細(xì)胞被CD34標(biāo)記后，采用免疫組織化學(xué)染色的方法，通常會(huì)被染成棕黃色。至于判斷微血管的標(biāo)準(zhǔn)以及微血管計(jì)數(shù)的方法則完全按照參考文獻(xiàn)[3-4]進(jìn)行。每張切片采用隨機(jī)的原則，選取5個(gè)視野，分別測(cè)定MVC、MVD的數(shù)值，取它們的平均數(shù)作為最后的數(shù)據(jù)。

1.2.5 大鼠梗死心肌邊緣區(qū)VEGF和bFGF表達(dá)的檢測(cè)(免疫組織化學(xué)法) 在光鏡下面觀察，VEGF和bFGF的陽(yáng)性表達(dá)以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或黃色顆粒沉著。最后使用病理圖像分析系統(tǒng)，計(jì)算梗死邊緣區(qū)心肌每視野(×400)中平均吸光度。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，取其平均值作為本例大鼠的吸光度(A)值。

1.2.6 大鼠梗死心肌邊緣區(qū)VEGF和bFGF蛋白水平檢測(cè)(Western blot) 首先將心肌勻漿蛋白從-80 ℃冰箱中取出后，然后對(duì)漿液進(jìn)行復(fù)溫處理，取蛋白上清，按照SDS-PAGE凝膠配置試劑盒說(shuō)明書的要求，進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，然后加入一抗(1∶1 000)(兔抗鼠VEGF、bFGF)，將其放置在室溫環(huán)境下，孵育2 h，洗滌后加入二抗，同樣在室溫條件下再孵育2 h，再洗滌，放置ECL發(fā)光劑中，顯影，定影，蒸餾水沖洗終止，再使用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析結(jié)果。內(nèi)參使用β-actin，以VEGF/β-actin和bFGF/β-actin灰度比值作為統(tǒng)計(jì)量。

2 結(jié)果

2.1 大鼠梗死心肌邊緣區(qū)MVC和MVD比較 益氣活血組方分別與模型組和假手術(shù)組比較，麝香保心丸與模型組和假手術(shù)比較，益氣活血組方與麝香保心丸組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 大鼠梗死心肌邊緣區(qū)VEGF和bFGF的表達(dá) 在光鏡下，4組大鼠心肌組織都可見(jiàn)棕黃色或黃色陽(yáng)性表達(dá)。益氣活血組方分別與假手術(shù)組和模型組比較，麝香保心丸分別與假手術(shù)和模型組比較，益氣活血組方與麝香保心丸組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表1 4組大鼠梗死心肌邊緣區(qū)微血管計(jì)數(shù)(MVC)和微血管密度(MVD)比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與麝香保心丸組比較，▲P<0.05

表2 4組大鼠梗死心肌邊緣區(qū)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)的表達(dá)

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與麝香保心丸組比較，▲P<0.05

2.3 VEGF和bFGF的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 鏡下觀察(×400)，在假手術(shù)組中，可見(jiàn)少許散在的棕黃色淡染細(xì)胞；模型組可見(jiàn)梗死周邊陽(yáng)性細(xì)胞有少量片狀分布；麝香保心丸組見(jiàn)梗死周邊區(qū)有較多VEGF陽(yáng)性表達(dá)；益氣活血方組見(jiàn)梗死周邊有大量VEGF陽(yáng)性表達(dá)。bFGF與VEGF陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果相近，益氣活血方組稍高于麝香保心丸組，兩者陽(yáng)性表達(dá)顯著高于假手術(shù)組和模型組(圖1，圖2)。

圖1 4組心肌VEGF免疫組織化學(xué)染色(×400)

圖2 4組心肌bFGF免疫組織化學(xué)染色(×400)

2.4 4組大鼠的梗死心肌的邊緣區(qū)域VEGF，bFGF蛋白的表達(dá) 益氣活血組方分別與假手術(shù)組和模型組比較，麝香保心丸組與假手術(shù)組和模型組比較；模型組和假手術(shù)組比較，差異均統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3，圖4)。

3 討論

急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction，AMI)是心肌的急性缺血性壞死，它是在冠狀動(dòng)脈病變的基礎(chǔ)上，出現(xiàn)冠狀動(dòng)脈供血急劇減少或者中斷[5]。目前治療AMI的方法主要有以下4種：藥物治療；經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(PCI)；經(jīng)冠狀動(dòng)脈旁路銜移植術(shù)(CABG)；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCS)移植術(shù)。由于受多種因素應(yīng)用的限制，目前臨床常應(yīng)用前3種治療方案進(jìn)行治療[6]。藥物治療是最基本的治療措施，西藥治療有許多不良反應(yīng)，且單用西藥療效不是很好，在這方面，中醫(yī)藥對(duì)AMI的治療具有良好的療效。

圖3 4組Western blot結(jié)果條帶

注：A為假手術(shù)組,B為模型組(B)，C為益氣活血組方組，D為麝香保心丸組

圖4 4組大鼠梗死心肌的邊緣區(qū)域VEGF，bFGF蛋白表達(dá)比較

AMI在中醫(yī)屬于為“胸痹”“心痛”范疇，張仲景就曾在《金匱要略》中寫道：“夫脈當(dāng)取太過(guò)不及，陽(yáng)微陰弦，即胸痹而痛”[7]。陽(yáng)微即是本虛，陰弦即是標(biāo)實(shí)，而氣虛血瘀是AMI最常見(jiàn)的發(fā)病機(jī)制。一切疾病的發(fā)生都離不開(kāi)邪盛與正虛2個(gè)方面，因此治療上應(yīng)祛邪與扶正相結(jié)合。益氣活血組方正是基于此病機(jī)而創(chuàng)立的，全方由黃芪、當(dāng)歸、丹參、川芎四藥組成。全方共奏益氣活血通絡(luò)。本方中黃芪[8-9]、當(dāng)歸[10-11]、川芎[12]等藥物，能夠增加側(cè)支循環(huán)，增加血流灌注量，保護(hù)缺血心肌。并且既往實(shí)驗(yàn)研究表明[13]，益氣活血組方可以通過(guò)防治和逆轉(zhuǎn)心肌缺血這一機(jī)制得以防止心梗癥狀的加重,且其改善心肌缺血與促進(jìn)缺血心肌血管新生具有相關(guān)性，提示益氣活血中藥治療冠心病的重要機(jī)制之一可能就是促血管新生。

VEGF和bFGF是促血管新生因子中最主要的2個(gè)。在血管新生中，VEGF是最為關(guān)鍵的一個(gè)因子，它可以調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞胞外基質(zhì)溶解、內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增生和管腔形成。bFGF是當(dāng)前研究最多、生物效應(yīng)最強(qiáng)、作用最廣泛的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)之一[14]，在體內(nèi)和體外均能明顯促進(jìn)新生血管形成[15]。近來(lái)有研究證實(shí)，兩者在促進(jìn)血管新生方面有著十分緊密的聯(lián)系。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：益氣活血組方與模型組比較，微血管計(jì)數(shù)與微血管密度顯著增加(P<0.01)；益氣活血組方稍高于麝香保心丸組(P<0.05)；表明益氣活血組方確實(shí)能夠促進(jìn)血管新生。通過(guò)對(duì)各組大鼠梗死邊緣區(qū)心肌VEGF和bFGF表達(dá)的檢測(cè)，結(jié)果顯示：益氣活血組方與模型組比較，心梗邊緣區(qū)域VEGF和bFGF陽(yáng)性表達(dá)顯著增加(P<0.01)；益氣活血組方與麝香保心丸比較陽(yáng)性表達(dá)稍高(P<0.05)；表明益氣活血組方促進(jìn)血管新生，可能與促進(jìn)VEGF和bFGF的表達(dá)有關(guān)。同時(shí)通過(guò)運(yùn)用Western blot技術(shù)，檢測(cè)各組大鼠梗死心肌邊緣區(qū)域中的VEGF，bFGF的蛋白水平，結(jié)果顯示:益氣活血組方大鼠梗死心肌邊緣區(qū)域VEGF和bFGF蛋白水平顯著提升，明顯高于模型組(P<0.01)，稍高于麝香保心丸組(P<0.05)。通過(guò)對(duì)本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，分析，不難得出MVC、MVD與VEGF和bFGF蛋白表達(dá)呈正相關(guān)這一結(jié)論，這一結(jié)果表明益氣活血組方促進(jìn)缺血心肌血管新生的機(jī)制與促進(jìn)VEGF和bFGF蛋白的表達(dá)相關(guān)。但具體作用機(jī)制，還有待進(jìn)一步研究。

[1]李鑫輝，張炳填，喻嶸.栝蔞薤白半夏湯對(duì)急性心肌缺血大鼠保護(hù)作用的研究[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2009,29(1):19-21,25.

[2]臧文華，殷沈華，唐德才，等.補(bǔ)氣活血藥對(duì)急性心肌梗死模型大鼠梗死心肌邊緣區(qū)域新生血管的影響[J].中國(guó)中藥雜志,2014,39(5):901-906.

[3]胡國(guó)恒，胡哲，盛望，等.益氣活血方對(duì)大鼠缺血心肌血管新生及HGF影響的研究[J].中國(guó)中醫(yī)急癥,2013,22(9):1478-1479,1484.

[4]何濤,胡姍,侯小濤,等.甘蔗葉多糖對(duì)大鼠心肌梗死心電圖及微血管生成的影響[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2016,33(2):229-231.

[5]王旭東.急性心肌梗死的早期診斷與治療[J].中國(guó)醫(yī)刊,2009,44(7):2-4.

[6]趙艷.急性心肌梗死治療進(jìn)展[J].數(shù)理醫(yī)藥學(xué)雜志,2016，29(4):563-564.

[7]陳穎.張仲景治療胸痹思想探析[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2015,11(6):59-60.

[8]王欣昌.參麥聯(lián)合黃芪治療對(duì)冠心病心功能不全患者BNP的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心血管病電子雜志,2015,3(35):55-56.

[9]劉暖,楊雷,毛秉豫,等.黃芪提取物對(duì)大鼠心肌梗死后心肌組織血管新生的作用[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2015,21(19):92-96.

[10]陳海軍,潘立群.當(dāng)歸補(bǔ)血微囊促血管新生中JAK2/STAT3通路的作用研究[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2016，32(4):342-346.

[11]董晴,陳明蒼.當(dāng)歸化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2016,12(2):32-34.

[12]胡代槐.川芎清腦顆粒治療椎基底動(dòng)脈供血不足致腦性眩暈的臨床觀察[J].中國(guó)醫(yī)藥，2014,9(1)：54-57.

[13]吳成哲,黃朝忠,紀(jì)凱,等.益氣活血方對(duì)實(shí)驗(yàn)性心肌梗死大鼠促血管新生機(jī)制研究[J].云南中醫(yī)中藥雜志,2014,35(9):83-85.

[14]張秋雁,蘇劍峰,王權(quán)禮,等.血府逐瘀湯超微飲片和傳統(tǒng)飲片對(duì)急性心肌缺血大鼠缺血心肌血管新生及bFGF、ANG-1表達(dá)影響的比較研究[J].中醫(yī)研究,2010,23(11):21-24.

[15]伊海英,孫曉艷,付小兵,等.堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的研究進(jìn)展[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志,2008,33(6):776-778.

EffectofYiqihuoxueDecoctiononAngiogenesisandExpressionofVEGFandbFGFintheIschemicMyocardiumofRats

Hu Guoheng1,Zhu Ronghua2,Xiao Qing2,Bian Guanji2

(1TheFirstAffiliatedHospitalofHunanUniversityofChineseMedicine,Changsha410007,China;2HunanUniversityofChineseMedicine,Changsha410208,China)

Objective:To investigate the effects of Yiqi Huoxue Decoction on the angiogenesis and the protein expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and basic fibroblast growth factor(bFGF) in the ischemic myocardium of rats with acute myocardial infarction.MethodsAfter the animal model of acute myocardial infarction (AMI) in rats is established,40 males SD rats were divided into 4 groups by random number table:model group,sham operation group,Shexiangbaoxin group and Yiqi Huoxue Formula group. The microvessel count(MVC),microvessel density (MVD) and expression of VEGF and bFGF in the ischemic myocardium were detected by immunohistochemistry.The change levels of VEGF and bFGF protein in the ischemic myocardium were detected by Western blot.ResultsYiqi Huoxue Formula group and Shexiangbaoxin group were compared with the model group,the infarcted myocardium edge area of microvessel count and microvessel density were significantly higher than that of the latter(P<0.01).The expression of VEGF and bFGF about Yiqi Huoxue Formula group and Shexiangbaoxin group and its protein expression level was significantly increased compared with the other groups(P<0.01).ConclusionYiqi Huoxue Formula group can significantly promote local angiogenesis in ischemic myocardium of rats after myocardial infarction, upregulation of myocardial VEGF and bFGF protein may be one of important mechanisms.

Yiqi Huoxue;Angiogenesis;VEGF;bFGF

湖南省科技廳計(jì)劃項(xiàng)目(2015SK20161;2015SK2016)

胡國(guó)恒(1961.09—)，男，博士，二級(jí)教授，博士研究生導(dǎo)師，心腦血管疾病的中醫(yī)藥防治研究，E-mail: hugh9198@163.com

R289.9；R364

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.10.036

(2016-12-22收稿 責(zé)任編輯：楊覺(jué)雄)