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      水酶結(jié)合溶劑浸提蔓荊子油工藝的研究

      2017-11-09 07:21:56曾善榮胡居吾
      生物化工 2017年5期
      關(guān)鍵詞:蔓荊子正己烷溶劑

      曾善榮,胡居吾

      (1、贛州市食品藥品檢驗檢測中心,江西贛州 341000;2.江西省科學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所,江西南昌 330096)

      水酶結(jié)合溶劑浸提蔓荊子油工藝的研究

      曾善榮1,胡居吾2

      (1、贛州市食品藥品檢驗檢測中心,江西贛州 341000;2.江西省科學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所,江西南昌 330096)

      以蔓荊子為原料,采用水酶結(jié)合溶劑的方法從蔓荊子中提取蔓荊子油??疾炝肆弦罕?、酶解時間及酶用量對蔓荊子油得率的影響,并采用響應(yīng)面法建立了蔓荊子油得率與料液比、酶解時間及酶用量之間的關(guān)系,得到了最佳萃取工藝條件:液料比8.4:1、酶解時間105 min、酶用量1.1%,蔓荊子油的得率達(dá)到4.35%,本方法與直接用正己烷提取蔓荊子相比,所得蔓荊子油具有色澤透明、產(chǎn)品純度高、收率高、污染少等的優(yōu)點。

      蔓荊子;響應(yīng)面法

      引言

      蔓荊子別名:蔓荊實、荊子、萬荊子、蔓青子、蔓荊、白背木耳、小刀豆藤、白背風(fēng)、白背草。為馬鞭草科植物單葉蔓荊或蔓荊的干燥成熟果實。主產(chǎn)于江西省、山東省、福建省和浙江省等省。具有解熱、抗炎、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、擴(kuò)管和降壓 、降血壓、祛痰平喘、延緩衰老等功效[1-7]。

      隨著生物技術(shù)的日新月異以及酶制劑發(fā)展技術(shù)的成熟,其生產(chǎn)價格逐漸下降,使得它的利用越來越普遍。因此,將相關(guān)的酶制劑應(yīng)用在植物精油方面越來越重視。采用酶法與溶劑浸提法提取蔓荊子油主要分為兩個過程:首先是酶解過程,在反應(yīng)酶的最適條件下,加入相關(guān)的酶進(jìn)行酶解。其主要機(jī)理是酶使蔓荊子的細(xì)胞壁破碎從而加強(qiáng)蔓荊子細(xì)胞中蔓荊子油脂的流動性,便于蔓荊子油從蔓荊子細(xì)胞中游離出來。最后是浸提過程,當(dāng)酶解結(jié)束后,向酶解液中加入少量正己烷溶劑,使酶解液中游離出來的蔓荊子油溶解在正己烷中,再利用漏斗分離和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到蔓荊子油。

      本文先進(jìn)行單因素實驗,再采用響應(yīng)面優(yōu)化實驗以確定水酶結(jié)合溶劑法浸提蔓荊子油的最佳參數(shù)。本方法與直接采用正己烷提取蔓荊子油的方法相比,所得蔓荊子油具有色澤透明,雜質(zhì)少、收率高、產(chǎn)品純度高、污染小等的優(yōu)點。

      1 材料與方法

      1.1 實驗原料

      蔓荊子,江西省都昌縣。

      1.2 儀器與試劑

      木瓜蛋白酶(酶活力>3萬U/g),纖維素酶(酶活力>3萬U/g),均購于上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司;實驗所用試劑均為分析純。

      B-260型恒溫水浴鍋,上海亞榮生化儀器廠;DEF-6020型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱,上海博迅實業(yè)有限公司;BSA-224S型分析天平,梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司;TGL-20B-C型離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠;PBS-3C型pH計,上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠。

      1.3 實驗方法

      1.3.1 水酶結(jié)合溶劑浸提蔓荊子油[8]

      將蔓荊子粉碎,將一定量的水加入粉碎后的蔓荊子中,用1mol/L鹽酸調(diào)反應(yīng)體系的pH在5.0,往反應(yīng)體系中加入一定量的纖維素酶在設(shè)定的溫度下進(jìn)行酶解所需的時間后,再調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值為6.5,隨后將木瓜蛋白酶加入其中,再在所設(shè)定的溫度下進(jìn)行酶解所需的時間后,對反應(yīng)體系進(jìn)行滅酶處理。反應(yīng)體系冷卻后進(jìn)行離心(離心轉(zhuǎn)速為4 000 r/min,離心時間為10min),收集上層液,并加入適量的正己烷溶劑(用量為:蔓荊子重量/正己烷體積比=1:2,g/ml),然后在常溫下進(jìn)行萃取,萃取結(jié)束后去除正己烷溶劑,獲得蔓荊子油產(chǎn)品。

      1.3.2 蔓荊子油得率的測定

      蔓荊子油的得率采用所獲得的蔓荊子油油重與進(jìn)行實驗原料蔓荊子重的比值來測定,具體計算公式如下:

      得率(%)=(蔓荊子油重/蔓荊子重)×100%

      1.3.3 酶搭配方式的選擇

      反應(yīng)體系中料液比為1:5,酶解時間為3h,酶解溫度為50℃。表1是本實驗當(dāng)中酶的添加方式以及各酶的加入量和酶反應(yīng)pH的值。

      表1 酶的種類的篩選Table 1 The selection of enzyme

      根據(jù)表1的實驗方法進(jìn)行實驗,最后通過蔓荊子油的得率高低來確定較佳的酶種搭配方式。

      1.3.4 提取工藝的單因素實驗

      1.3.4.1 料液比對蔓荊子油得率的影響

      調(diào)節(jié)料液比分別為1:4、1:5、1:6、1:7、1:8,混合酶加入量為1.0%,pH6.0,酶解溫度為50℃,酶解時間為2h。在不同料液比情況下測定并計算蔓荊子油得率。

      1.3.4.2 酶解時間對蔓荊子油得率的影響

      調(diào)節(jié)料液比為1:6,混合酶加入量為1.0%,酶解溫度為50℃,酶解時間分別為1.0h、1.5 h、2h、2.5h、3.0 h,在不同酶解時間情況下測定并計算蔓荊子油得率。

      1.3.4.3 纖維素酶加入量對蔓荊子油得率的影響

      調(diào)節(jié)料液比為1:6,酶解溫度為50℃,酶解時間為2h,酶用量分別為0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%,在不同酶用量情況下測定并計算蔓荊子油得率。

      1.3.5 工藝的優(yōu)化

      通過單因素實驗確定的最佳的酶加入量、料液比和酶解時間,根據(jù)響應(yīng)面實驗設(shè)計三個因素(酶加入量、料液比和酶解時間)在三個不同的水平上的響應(yīng)面優(yōu)化實驗。通過軟件分析,獲得水酶法結(jié)合溶劑浸提蔓荊子油的最優(yōu)工藝條件。

      2 實驗結(jié)果與討論

      2.1 酶的篩選

      根據(jù)實驗設(shè)計,通過測定蔓荊子油的得率高低來確定較佳的酶種搭配方式,根據(jù)具體實驗數(shù)據(jù)利用Origin7.0所做的圖表如圖1。

      圖1 不同的酶對的蔓荊子油的得率的影響Fig.1 Effect of different enzymes on the yield of viter rotundifolia oil

      蔓荊子細(xì)胞壁主要由半纖維素和纖維素組成,此外,還含有少量的蛋白質(zhì)等。存在于蔓荊子細(xì)胞內(nèi)的油脂與一些蔓荊子蛋白質(zhì)相結(jié)合,從而大大的降低了游離態(tài)的蔓荊子油。因此,我們選擇了纖維素酶和木瓜蛋白酶為浸提蔓荊子油所用的酶。由圖1可以看出:單一的使用木瓜蛋白酶和單一的使用纖維素酶時,與混合酶(木瓜蛋白酶:纖維素酶=1:1)使用時,其得率都比混合酶的得率低。因為纖維素酶對纖維素和半纖維素物質(zhì)會進(jìn)行酶解作用,同時,木瓜蛋白酶會使與蛋白結(jié)合的油脂分離開出,從而兩種酶的結(jié)合使用,使蔓荊子中結(jié)合態(tài)的油脂會游離出來,增加了正已烷溶劑的浸提效率。因此,我們選擇混合酶(木瓜蛋白酶:纖維素酶=1:1)為水酶結(jié)合溶劑浸提蔓荊子油的過程當(dāng)中的酶添加方式。

      2.2 料液比對蔓荊子油得率的影響

      在不同料液比情況下測定并計算蔓荊子油得率。結(jié)果見圖2。

      圖2 料液比對蔓荊子油得率的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on the yield of viter rotundifolia oil

      由圖2可知,在反應(yīng)體系中,料液比在1:4-1:6范圍內(nèi),蔓荊子油的得率會隨著料液比的增加而提高,得率由2.38%(料液比1:4)增大到3.51%(料液比1:6)。當(dāng)料液比低于1:4時,加入的酶和底物蔓荊子粉末幾乎黏在一起,所加入的酶發(fā)揮不了作用。只有當(dāng)反應(yīng)體系中的料液比超過1:4后,加入的酶和底物蔓荊子粉末充分發(fā)生酶解作用,使蔓荊子細(xì)胞的細(xì)胞壁得到破壞,并且使得蔓荊子中與蛋白結(jié)合的油脂之間的作用力減小,因此,蔓荊子中大量的油脂被游離出來[8]。當(dāng)料液比達(dá)到當(dāng)料液比高于1:6時,蔓荊子油提取率反而下降,因為隨著料液比的進(jìn)一步變大,酶作用底物的濃度卻開始下降,從而使酶解速率下降,導(dǎo)致蔓荊子油的提取率下降。從以上的實驗結(jié)果確定水酶法提取蔓荊子油的料液比為1:6。

      2.3 酶解時間對蔓荊子油得率的影響

      在不同酶解時間情況下測定并計算蔓荊子油得率。結(jié)果見圖3。

      圖3 酶解時間對蔓荊子油得率的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis time on the yield of viter rotundifolia oil

      由圖3可知,酶解時間在1.0h到2.0h的范圍內(nèi),酶解時間越長,所得到的蔓荊子油得率增加,當(dāng)酶解時間為1.0h時,所得的蔓荊子油得率為1.98%,當(dāng)酶解時間到達(dá)2.0h時,所得的蔓荊子油得率達(dá)到3.42%。但是,當(dāng)反應(yīng)體系中的酶解時間超過2h以后,蔓荊子油得率反而會略有下降,因為隨著酶解時間的延長,體系中游離出來的蔓荊子油會與一些蛋白質(zhì)和其他色素等雜質(zhì)相結(jié)合在一起,使蔓荊子油的得率會有所降低。因此,綜合考慮,選擇復(fù)合酶酶解時間為2h。

      2.4 酶用量對蔓荊子油得率的影響

      調(diào)節(jié)料液比為1:6,酶解溫度為50℃,酶解時間為2h,酶用量分別為0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%,在不同酶用量情況下測定并計算蔓荊子油得率。結(jié)果見圖4。

      圖4 酶用量對荊子油得率的影響Fig.4 Effect of dosage of enzyme on the yield of viter rotundifolia oil

      從圖4.可看出,在加酶量在1.0%以內(nèi),反應(yīng)體系中蔓荊子油的得率隨著加酶量的增多而逐漸增大。但當(dāng)反應(yīng)體系中的加酶量(E/S)超過1.0%之后,蔓荊子油的得率會有所增加,但其數(shù)值不明顯。因為在反應(yīng)體系中,底物濃度已確定的情況下,反應(yīng)速率與酶濃度存在正比例關(guān)系,反應(yīng)體系中的酶解率會隨著加酶用量的增多而增加,當(dāng)反應(yīng)體系中的底物耗盡后,再增加酶的量時,蔓荊子油的得率也不再增加,因此,從生產(chǎn)成本上考慮,選擇最佳酶用量為1.0%。

      2.5 工藝的優(yōu)化

      2.5.1 響應(yīng)面分析法因素水平表及其分析和實驗結(jié)果

      在單因素試驗基礎(chǔ)上選取液料比、酶解溫度及酶用量對本試驗有關(guān)的影響因素進(jìn)行響應(yīng)面分析,具體見表2。實驗結(jié)果見表3和表4。

      表2 響應(yīng)面試驗因素水平及編碼Table2 Levers and code of response surface experiments

      表3 蔓荊子油響應(yīng)面分析方案及結(jié)果Table 3 Analysis and result of response surface experiments

      設(shè)該模型通過最小二乘法擬合的二次多項方程為:

      式中:Y—預(yù)測響應(yīng)值;X0—常數(shù)項;X1、X2、X3—線性系數(shù);X12、X13、X23—交互項系數(shù);X11、X22、X33—二次項系數(shù)

      表3為不同試驗條件下所測定的蔓荊子油的得率,利用Design-expert 7.0 軟件對表3中蔓荊子油的各條件下的得率進(jìn)行多元回歸擬合,表4為回歸方程系數(shù)及其顯著性檢驗結(jié)果,當(dāng) “Prob>F” 值小于 0.05時,即表示該項指標(biāo)具有顯著性,可以用于蔓荊子油萃取試驗的理論預(yù)測。多項回歸方程為:

      表4 回歸方程系數(shù)及其顯著性檢驗結(jié)果Table 4 Regression coefficients and their significance

      2.5.2 響應(yīng)面實驗的直觀分析

      相應(yīng)曲面圖和等高線圖5所示。

      圖5 y=f(x1,x2)的響應(yīng)面與等高線圖Fig.5 Response surface plot and contour plot

      由圖5可以看出:在固定兩個因素(水平值為0)水平值時,其他因素的3D曲面圖的總體形狀較相似,表現(xiàn)出的變化規(guī)律為這兩個因素均是隨另一個因素水平值的變化而先變大后減小,混合酶加入量因素的影響較為顯著。通過軟件 Design – Expert7.0求解方程,給出了最佳酶解工藝條件為:液料比8.4:1、酶解時間105h、酶用量1.1%,對優(yōu)化條件進(jìn)行實驗驗證,重復(fù)3次,此時蔓荊子油的得率達(dá)到極值4.35%,與理論計算值誤差在0.5%左右。

      [1]雷載權(quán).中藥學(xué)[M].上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,2000,44.

      [2]南京藥學(xué)院《中草藥學(xué)》編寫組.中草藥下冊[M].南京:江蘇科技出版社,1980:914.

      [3]隋在云,王愛潔.蔓荊子解熱作用的實驗研究[J].中藥藥理與臨床,2007,23(5) :138-139.

      [4]Ikawati Z,Wahyuono S,Maeyama K.Screening if several Indonesian medicinal plants for their inhibitory effect on histaminere lease from RBL-2H3 cells[J].Ethnopharmacol,2001,75:249-256.

      [5]Singh V,Dayal R,Bartley J P.Chemical constituents of Vitex negundo leaves [J].Med Arom Plant Sci,2003,25 (1) :94-98.

      [6]Ono M,Yamamoto M,Masuoka C,et al.Diterpenes from the fruits of Vitex rotundifolia [J].Nat Prod,1999,62 (11) :1532-1527.

      [7]陳奇,連曉媛,畢明,等.蔓荊子藥理作用研究[J].江西中醫(yī)藥,1991,2(1) :47-50.

      [8]史素偉.酶法提取米糠油和蛋白及米糠油微膠囊化研究[D].南昌大學(xué),2011.

      Optimization for the extracting Viter rotundifolia oil by the combination of water and enzymes

      Zeng Shan-rong1,Hu Ju-wu2
      (1、Ganzhou Provincial Institute For Food And Drug Control,Jiangxi Ganzhou 334100;2、Institute of Applied Chemistry,Jiangxi Academy of Sciences,Jiangxi Nanchang 330096)

      The viter rotundifolia oil was extracted by the combination of water and enzymesfrom viter rotundifolia.The major influence factors such as solid-liquid ratio,Enzymatic hydrolysis time,dosage of enzyme were studied and analysised.By employing response surface methodology,the relationship of solid-liquid ratio,enzymatic hydrolysis time,dosage of enzyme was founded.The parameters of extraction process were optimized,so the optimal experiment parameters are:solid-liquid ratio 8.4:1,enzymatic hydrolysis time 105min,dosage of enzyme 1.1%.The method is high yield and high product purity and low pollution characteristics

      viter rotundifolia;Response Surface Method

      TS22

      A

      2096-0387(2017)05-0005-05

      江西省科技支撐項目(項目編號201302417)。

      曾善榮(1981-),男,工程師,研究方向:食品工程與檢測。

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