田新民　石蘭英

摘要：為了評價黑龍江林蛙（Rana amurensis）胃腸道消化酶的活力，為其科學人工養(yǎng)殖提供參考，分別采用福林-酚試劑法、聚乙烯醇橄欖油乳化液水解法和3，5-二硝基水楊酸比色法對黑龍江林蛙的胃和腸道蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活力進行了分析。結(jié)果表明，pH和溫度與3種消化酶的關(guān)系曲線均呈單峰型；蛋白酶的活力胃部高于腸道，胃蛋白酶和腸蛋白酶的最適pH分別為1.5和7.2，最適溫度均為50 ℃；脂肪酶的活力腸道高于胃部，胃脂肪酶和腸脂肪酶的最適pH分別為3.2和6.2，最適溫度均為40 ℃；淀粉酶的活力腸道高于胃部，胃淀粉酶和腸淀粉酶的最適pH均為7.2，最適溫度均為40 ℃。基于上述數(shù)據(jù)，建議配制黑龍江林蛙飼料時，將蛋白質(zhì)成分分布在飼料顆粒外圍，脂類和淀粉成分在飼料顆粒中心，有助于提高飼料的消化率。環(huán)境溫度較高時，飼料中可適當提高蛋白質(zhì)成分，減少脂類和淀粉成分的配比。

關(guān)鍵詞：黑龍江林蛙（Rana amurensis）；消化道；消化酶；活力

中圖分類號：Q55 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）19-3703-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.19.025

Abstract： In order to provide a reference for Rana amurensis scientific breeding，the activity of protease，lipase and amylase in the stomach and intestinal tract of Rana amurensis were analyzed by Folin phenol reagent method，polyvinyl alcohol olive oil emulsion hydrolysis method and 3，5-two nitro salicylic acid colorimetric method. The results showed that the relationship curves of three digestive enzymes with pH value and temperature all showed single peak pattern，respectively. The activity of protease in stomach was higher than in intestine，the optimum pH value of pepsin and proteinase was 1.5 and 7.2，respectively，and the optimum temperature was 50 ℃. The lipase activity in the intestine was higher than in the stomach，and the optimum pH values was 3.2 and 6.2，respectively，and the optimum temperature was 40 ℃. The activity of amylase in the intestine was higher than that in stomach，and the optimum pH value was 7.2，the optimum temperature was 40 ℃. Based on the above data，it suggested that the protein components would be distributed around the feed particles，and the lipid and starch components in the center of the feed particles，which could improve the digestibility of the feed. When the environmental temperature is high，the protein composition could be increased appropriately， and the ratio of lipid and starch components should be reduced.

Key words： Rana amurensis； gastrointestinal tract； digestive enzymes； activity

黑龍江林蛙（Rana amurensis）隸屬于蛙科林蛙屬，國內(nèi)主要分布于東北三省和內(nèi)蒙古地區(qū)，具有較高的經(jīng)濟價值和藥用價值[1，2]。環(huán)境的破壞和人類的濫捕，使該種群數(shù)量急劇減少，黑龍江林蛙的人工養(yǎng)殖得到重視。消化道內(nèi)消化酶活力的研究可為了解林蛙對食物不同成分的消化能力、飼料的選擇以及人工飼養(yǎng)條件的確立提供重要參考資料[3]。關(guān)于低等脊椎動物消化酶的研究主要集中在魚類[4-6]和爬行類[7，8]，兩棲類[9，10]相對較少，而對黑龍江林蛙的相關(guān)研究還未見報道。因此，本研究對黑龍江林蛙胃腸道3種消化酶的活力進行了分析，可為其人工養(yǎng)殖提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料來自黑龍江省密山市，為鮮活成年個體，體重15～30 g，帶回實驗室立即進行試驗分析。雙毀髓處死，剖腹，取出消化道，剪開后用4 ℃、 0.65%的生理鹽水快速洗凈。剪出胃和腸道，用濾紙吸干表面生理鹽水，稱重備用[3]。

1.2 材料處理

根據(jù)所得組織質(zhì)量加入20倍蒸餾水，冰浴中高速分散均質(zhì)機勻漿。4 ℃、4 000 r/min離心20 min，取上清液即為粗酶提取液，保存于4 ℃冰箱內(nèi)，8 h內(nèi)分析完畢[11]。

1.3 試驗方法

蛋白酶的活力測定采用福林-酚試劑法[12]，脂肪酶的活力測定采用聚乙烯醇橄欖油乳化液水解法[13]，淀粉酶活力測定采用3，5-二硝基水楊酸比色法[12]。以KCl-HCl配制pH 0.5～1.5的緩沖液，Na2HPO4-檸檬酸配制pH 5.2～8.0的緩沖液，巴比妥鈉-HCl配制pH 8.0～9.2的緩沖液[12]。

胃蛋白酶采用pH 0.5、1.0、1.5、2.2、2.6五個梯度，腸蛋白酶采用pH 5.2、6.2、7.2、8.0、9.2五個梯度；胃脂肪酶采用pH 1.0、1.5、2.2、3.2、4.2、5.2、6.2七個梯度，腸脂肪酶采用pH 3.2、4.2、5.2、6.2、7.2、8.0、8.8七個梯度；胃淀粉酶和腸淀粉酶均采用pH 5.2、6.2、7.2、8.0、8.8五個梯度。所有酶均在30 ℃條件下確定最適pH，在所得的最適pH條件下確定最適溫度。溫度由恒溫水浴鍋控制，采用20、25、30、35、40、45、50、55、60、65 ℃梯度，其中蛋白酶采用30～65 ℃八個梯度，脂肪酶和淀粉酶采用20～65 ℃十個梯度。

由于每一類酶的試驗體系相同，為簡化試驗過程，故采用吸光度代表蛋白酶和淀粉酶的活力，NaOH滴定的毫升數(shù)代表脂肪酶的活力，進行數(shù)據(jù)分析。標準差的計算和數(shù)據(jù)作圖采用Excel 2003完成。

2 結(jié)果與分析

由圖1～圖6可見，pH和溫度與3種消化酶的關(guān)系曲線均呈單峰型，即每種酶在30 ℃條件下均存在最適pH，在最適pH條件下均存在最適溫度。胃蛋白酶和腸蛋白酶的最適pH分別為1.5和7.2，最適溫度均為50 ℃。胃蛋白酶活力在各自的pH范圍內(nèi)和溫度范圍內(nèi)均高于腸蛋白酶，胃蛋白酶和腸蛋白酶在最適pH和最適溫度兩側(cè)均呈下降趨勢。

胃脂肪酶和腸脂肪酶的最適pH分別為3.2和6.2，最適溫度均為40 ℃。在最適pH條件下20～65 ℃范圍內(nèi)，腸脂肪酶活力均高于胃脂肪酶。

胃淀粉酶和腸淀粉酶的最適pH均為7.2，最適溫度均為40 ℃。淀粉酶的活力腸道高于胃部，在最適溫度兩側(cè)兩種淀粉酶的活力下降趨勢劇烈，高于55 ℃后淀粉酶基本失活。

3 小結(jié)與討論

黑龍江林蛙消化道的胃部和腸道均具有蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活力。蛙類通常為肉食性動物，黑龍江林蛙消化道內(nèi)的淀粉酶活力檢測結(jié)果提示在黑龍江林蛙飼料配制時可適當添加淀粉成分。蛋白酶活力胃高于腸道，淀粉酶和脂肪酶活力腸道高于胃，說明黑龍江林蛙對蛋白質(zhì)的消化主要在胃部，淀粉和脂類物質(zhì)的消化主要在腸道。本試驗中蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的研究結(jié)果與黑斑蛙[3，11，14]、牛蛙[15]和虎紋蛙[10]相一致。根據(jù)黑龍江林蛙消化酶的活力分布特點，在配制黑龍江林蛙人工飼料時，建議將蛋白質(zhì)成分分布在飼料顆粒的外圍，脂類和淀粉成分分布在飼料顆粒的中心，將有助于提高其對飼料的消化率。

酶的活力受pH影響顯著，各種酶只有在一定的pH范圍內(nèi)才能表現(xiàn)出活力，并存在最適pH[15]。本研究中胃蛋白酶和腸蛋白酶的最適pH分別為1.5和7.2，與黑斑蛙和虎紋蛙的胃和腸蛋白酶最適pH分別為1.5和7.4基本一致[11，16]。黑龍江林蛙胃脂肪酶和腸脂肪酶的最適pH分別為3.2和6.2，其胃脂肪酶最適pH高于牛蛙胃脂肪酶最適pH（2.2）[15]，低于黑斑蛙與虎紋蛙（最適pH分別為5.0和9.0）[3，10]；但黑龍江林蛙腸脂肪酶的最適pH均低于牛蛙、黑斑蛙和虎紋蛙（分別為7.4、7.5和9.0）[3，10，15]。黑龍江林蛙胃淀粉酶和腸淀粉酶的最適pH均為7.2，與牛蛙的7.0和8.0[15]，黑斑蛙的7.4和8.0[14]，虎紋蛙的8.6和7.0[10]基本一致。說明這些蛙類的淀粉性食物主要在腸道消化，胃部不利于淀粉的消化，這與上述酶活力分布的結(jié)果相一致。

黑龍江林蛙胃蛋白酶和腸蛋白酶的最適溫度均為50 ℃，胃脂肪酶和腸脂肪酶最適溫度均為40 ℃，胃淀粉酶和腸淀粉酶的最適溫度也均為40 ℃，與牛蛙、黑斑蛙和虎紋蛙的研究結(jié)果基本一致[3，10，11，14，15]，均高于適宜的棲息環(huán)境溫度。同時表明，黑龍江林蛙消化道脂肪酶和淀粉酶的抗熱性要比蛋白酶差，基于此特點，在黑龍江林蛙人工養(yǎng)殖中，環(huán)境溫度升高時可在飼料中適當提高蛋白質(zhì)成分，減少脂類和淀粉成分的配比。黑龍江林蛙屬變溫動物，多數(shù)蛙類其適宜的生存溫度范圍為5～35 ℃[14，15]，黑龍江林蛙脂肪酶和淀粉酶的最適溫度與其棲息環(huán)境溫度的上限相當，蛋白酶遠高于棲息的環(huán)境溫度，這與其他蛙類研究結(jié)果吻合[3，10，11，14，15]。最適溫度受反應條件影響，如作用時間延長最適溫度下降，蛙消化食物時酶促反應時間較長，這可以解釋最適溫度高于生理溫度的現(xiàn)象[11，17]。

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