?；悄懰釋?duì)小鼠胸腺細(xì)胞凋亡影響的研究

郭鳳英　李培鋒　賈俊濤

摘要：為研究?；悄懰幔═CA）對(duì)體外培養(yǎng)小鼠胸腺細(xì)胞凋亡的影響，探討其免疫調(diào)節(jié)作用，采用梯度離心法分離獲取小鼠胸腺細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)12 h后與不同濃度TCA共孵12 h。以流式細(xì)胞術(shù)對(duì)原代培養(yǎng)胸腺細(xì)胞早期凋亡進(jìn)行定量檢測(cè)；應(yīng)用分光光度法檢測(cè)了凋亡特異性蛋白酶Caspase-9、Caspase-3活性的變化。結(jié)果表明，TCA3組（終濃度為0.30 μg/mL）與胸腺細(xì)胞共孵12 h后，可極顯著抑制磷脂酰絲氨酸外翻，抑制細(xì)胞凋亡，TCA2組（終濃度為0.15 μg/mL）可顯著提高Caspase-9、Caspase-3活性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。說(shuō)明TCA通過(guò)對(duì)體外培養(yǎng)小鼠胸腺細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能。

關(guān)鍵詞：牛磺膽酸；細(xì)胞凋亡；免疫調(diào)節(jié)

中圖分類(lèi)號(hào)：R965 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）19-3706-02

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.19.026

Abstract： In this paper the study was aimed at discussing the immunoregulation of taurocholic acid（TCA） by analyzing its effects on mice thymocyte apoptosis. The mice thymocyte cells were isolated by gradient centrifugation and cultured under 37 ℃ with TCA of different concentration for 12 hours. Through flow cytometry（FCM），the thymocyte apoptosis in early stage were detected quantitatively. Besides，the activity of caspase-9 and caspase-3 were detected through spectrophotometric methods. The results showed that the TCA group 3（the final concentration：0.3 μg/mL） could dramatically restrain phosphatidylserine from eversion and restrain the cells apoptosis. Meanwhile，TCA group 2（the final concentration：0.15 μg/mL） could greatly improve the activity of caspase-9 and caspase-3，and induce the cells apoptosis. It indicated that TCA adjusts organism immune function by regulating the mice thymocyte apoptosis.

Key words： taurocholic acid （TCA）； mice thymocyte apoptosis； immune regulation

膽汁在中國(guó)醫(yī)藥上的應(yīng)用歷史悠久[1]。大量的藥理實(shí)驗(yàn)表明，動(dòng)物膽汁的主要藥理作用是由膽酸鹽和膽汁酸發(fā)揮的。?；悄懰幔═aurocholic acid，TCA）是牛羊膽汁中的主要有效成分之一。研究表明TCA具有鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘、抗炎作用，對(duì)心臟和血壓也具有一定的影響[2-4]。據(jù)報(bào)道[5]，TCA對(duì)機(jī)體免疫細(xì)胞功能具有調(diào)節(jié)作用。免疫細(xì)胞的凋亡在免疫系統(tǒng)的自穩(wěn)中極為重要，已成為當(dāng)今免疫學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)。本試驗(yàn)采用流式細(xì)胞等技術(shù)，研究不同濃度TCA對(duì)原代培養(yǎng)小鼠胸腺細(xì)胞凋亡的影響，探討TCA對(duì)機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)作用，從而為T(mén)CA的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)純種昆明小白鼠，體重（20±2） g，雌雄各半，由內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供。

1.1.2 藥品與試劑 牛磺膽酸，實(shí)驗(yàn)室自制，純度達(dá)97%以上；淋巴細(xì)胞分離液，天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司，批號(hào)LTS1077； Caspase-3分光光度法檢測(cè)試劑盒，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，貨號(hào)KGA-203；Caspase-9分光光度法檢測(cè)試劑盒，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，貨號(hào)KGA-403；Annexin V-EGFP細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，貨號(hào)KGA-102。

1.1.3 主要儀器 酶標(biāo)儀（ELX800，BIO-TEKINSTUMENTS）；超凈工作臺(tái)（FLC-3，哈爾濱東聯(lián)公司）；流式細(xì)胞儀（FACSCalibur，美國(guó)BD公司）；CO2培養(yǎng)箱（SERIE SⅡ，F(xiàn)orma Scientific，Inc.）。

1.1.4 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)結(jié)果采用x±s表示，用SAS 9.0軟件處理數(shù)據(jù)，兩樣本比較采用t檢驗(yàn)，樣本組間差異比較采用F檢驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 胸腺細(xì)胞的獲取 眼球放血處死后，75%乙醇浸泡2 min，無(wú)菌分離胸腺，去除小血管及結(jié)締組織，置于4 ℃培養(yǎng)液（含RPMI-1640培養(yǎng)基，5%滅活小牛血清，谷氨酞胺2 mmol/L，青霉素100 U/mL，鏈霉素0.2 mg/mL）中，在250目篩網(wǎng)輕輕研磨，離心（1 500 r/min，4 min），洗滌2次，重懸細(xì)胞于含10%小牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液中，計(jì)數(shù)并且調(diào)整細(xì)胞數(shù)至2×106個(gè)/mL，置于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板并使每孔終體積為1 mL，于5% CO2孵育箱中37 ℃培養(yǎng)12 h。

1.2.2 試驗(yàn)分組及處理 試驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為4組，每組5只，即空白對(duì)照組（胸腺細(xì)胞僅在完全培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)）；TCA 1組（TCA終濃度為0.03 μg/mL，與胸腺細(xì)胞共同孵育12 h）；TCA2組（TCA終濃度為0.15 μg/mL，與胸腺細(xì)胞共同孵育12 h）；TCA3組（TCA終濃度為0.30 μg/mL，與胸腺細(xì)胞共同孵育12 h）。

1.2.3 胸腺細(xì)胞早期凋亡的檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-PI雙染色法[6]，檢測(cè)TCA與胸腺細(xì)胞共孵育后凋亡早期磷脂酰絲氨酸外翻情況，進(jìn)而反映細(xì)胞早期凋亡百分率。

1.2.4 Caspase-9的活化程度的檢測(cè) 按常規(guī)方法制備胸腺細(xì)胞。將培養(yǎng)得到的胸腺細(xì)胞用PBS洗滌二遍（2 000 r/min，離心5 min）。按照試劑盒要求進(jìn)行操作。最后用酶標(biāo)儀在405 nm處測(cè)定其吸光度[7]。

1.2.5 Caspase-3的活化程度的檢測(cè) 方法同1.2.4。

2 結(jié)果與分析

2.1 TCA對(duì)胸腺細(xì)胞早期凋亡的影響

由表1可見(jiàn)，不同濃度TCA與胸腺細(xì)胞共同孵育后，均能顯著抑制胸腺細(xì)胞凋亡（P<0.05），以TCA3組的抑制效果最好。

2.2 TCA對(duì)Caspase-9活化程度的影響

由表2可見(jiàn)，不同濃度TCA與胸腺細(xì)胞共同孵育后，TCA2組、TCA3組均可顯著誘導(dǎo)胸腺細(xì)胞凋亡（P<0.05），TCA1組則無(wú)明顯影響（P>0.05）。

2.3 TCA對(duì)Caspase-3活化程度的影響

由表3可見(jiàn)，不同濃度TCA與胸腺細(xì)胞共同孵育后，TCA2組可顯著誘導(dǎo)胸腺細(xì)胞凋亡（P<0.05），而TCA1、TCA3組則無(wú)明顯影響（P>0.05）。

3 小結(jié)與討論

研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞凋亡啟動(dòng)之初，分布于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸（PS）暴露于細(xì)胞膜外，利用該特性可定量檢測(cè)早期凋亡細(xì)胞[8]。試驗(yàn)結(jié)果顯示，高劑量TCA可顯著抑制胸腺細(xì)胞磷脂酰絲氨酸的外翻，顯著降低細(xì)胞凋亡百分率。由此表明，TCA抑制胸腺細(xì)胞磷脂酰絲氨酸外翻，阻止胸腺細(xì)胞的早期凋亡是通過(guò)其直接作用實(shí)現(xiàn)的。由于胸腺是T細(xì)胞分化、成熟的場(chǎng)所，在T細(xì)胞的分化和調(diào)節(jié)中起重要的作用[9，10]。因而提示，TCA可通過(guò)抑制胸腺細(xì)胞凋亡啟動(dòng)階段，促進(jìn)機(jī)體T細(xì)胞的應(yīng)答反應(yīng)，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫。

Caspase是一類(lèi)凋亡特異性蛋白酶，分為啟動(dòng)Caspase（如Caspase-9）和效應(yīng)Caspase（如Caspase-3）兩類(lèi)，參與凋亡的啟動(dòng)和執(zhí)行過(guò)程，它們的活化是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵[11]?；罨腃aspase-9引發(fā)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活Caspase-3，其作為效應(yīng)子，作用于不同的靶分子，經(jīng)蛋白水解作用使細(xì)胞凋亡。試驗(yàn)證實(shí)，TCA可顯著提高凋亡特異性蛋白酶Caspase-9、Caspase-3的活性，促進(jìn)胸腺細(xì)胞凋亡。這一結(jié)果表明TCA誘導(dǎo)胸腺細(xì)胞凋亡，該作用可能與上調(diào)胸腺細(xì)胞中Caspase-9、Caspase-3的表達(dá)有關(guān)。

細(xì)胞凋亡（apotosis）在胚胎發(fā)育、組織發(fā)生、胸腺細(xì)胞的選擇等方面起著重要的作用。通過(guò)細(xì)胞凋亡機(jī)制的胸腺細(xì)胞陰性選擇，使大量未成熟的細(xì)胞包括自身反應(yīng)性T細(xì)胞得到清除，從而保持正常免疫功能狀態(tài)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，在胸腺細(xì)胞發(fā)生凋亡早期時(shí)，TCA可抑制其發(fā)生凋亡，使胸腺細(xì)胞分化增殖，參與免疫反應(yīng)。但隨著免疫反應(yīng)進(jìn)行到一定階段，也即胸腺細(xì)胞分化增殖到一定數(shù)量時(shí)，TCA 就開(kāi)始誘導(dǎo)其凋亡，使免疫細(xì)胞維持在一定的數(shù)量水平而保證免疫反應(yīng)有序地進(jìn)行，從而使機(jī)體免疫系統(tǒng)保持穩(wěn)態(tài)。由此可知，免疫細(xì)胞對(duì)早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的反應(yīng)是截然不同的。綜上所述，TCA通過(guò)對(duì)不同階段胸腺細(xì)胞凋亡產(chǎn)生誘導(dǎo)或抑制作用，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 王凱平，石朝周.動(dòng)物膽汁藥用研究的概況與展望[J].中國(guó)中醫(yī)藥科技，2000，7（5）：347-350.

[2] 朱 強(qiáng)，石朝周，孫漢清.?；悄懰徕c的合成及其藥理作用[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，1997，32（4）：236-238.

[3] 梅和珊，石朝周，向 一，等.人工蛇膽鎮(zhèn)咳祛痰抗炎的藥效學(xué)初步研究[J].中國(guó)生化藥物雜志，1999，20（5）：248-250.

[4] 胡霞敏，彭 紅，徐詩(shī)強(qiáng).人工蛇膽的主要成份對(duì)動(dòng)物心臟及血壓的影響[J].華西藥學(xué)雜志，2001，16（4）：267-268.

[5] 王彩云.?；悄懰釋?duì)小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用[D].呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

[6] 李 莉，孔憲濤.細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法評(píng)價(jià)[J].上海醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，2000，15（1）：57-59.

[7] HAKEM R. Differential requirement for caspase 9 in apoptotic pathways In vivo[J].Cell，1998，94（3）：339-352.

[8] FADOK V A，VOELKER D R，CAMPBELL P A，et al. Expo-sure of phosphatidylserineon the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages[J].Immunol，1992，148：2207-2216.

[9] [美]L.松佩拉克，免疫學(xué)概覽[M].第二版.李琦涵，施海晶，譯.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，現(xiàn)代生物技術(shù)與醫(yī)藥科技出版中心，2005.

[10] 陳慰峰.醫(yī)學(xué)免疫學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2005.

[11] TAFANI M，SCHNEIDER T G，PASTORINO J G，et al. Cytochrome C-dependent activation of caspase-3 by tumor necrosis factor requires induction of the mitochondrial permeability transition[J].Am Soc Investing Pathol，2000，156：2111-2121.