牡丹胚培養(yǎng)快速成苗技術(shù)研究

徐 莉 成仿云 鐘 原

(北京林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院國家花卉工程技術(shù)中心，北京 100083)

牡丹胚培養(yǎng)快速成苗技術(shù)研究

徐 莉 成仿云*鐘 原

(北京林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院國家花卉工程技術(shù)中心，北京 100083)

以‘鳳丹’及紫斑牡丹種胚為外植體，通過研究激素、光照條件、培養(yǎng)基成分及活性炭(AC)等對(duì)離體胚培養(yǎng)的影響，建立了牡丹胚培養(yǎng)直接成苗的高效、快捷的方法。主要結(jié)果：在改良MS(鈣加倍)+0.2 g·L-1AC+0.5 mg·L-1BA+0.5 mg·L-1GA中離體胚10 d胚根萌動(dòng)，20 d長出真葉，25 d根系發(fā)達(dá)，40 d移栽，3個(gè)月后幼苗長勢(shì)良好。實(shí)驗(yàn)得出適宜‘鳳丹’的培養(yǎng)基：改良MS(鈣加倍、大量元素加倍)+0.6 g·L-1AC+1.0 mg·L-1GA，紫斑牡丹：改良MS(鈣加倍、大量元素加倍)+0.6 g·L-1AC+0.5 mg·L-1GA；其中‘鳳丹’的成苗率63.88%，成活率66.34%，紫斑成苗率93.75%，成活率在品種間有差異，最佳可達(dá)100%。

胚培養(yǎng)；‘鳳丹’；紫斑牡丹；活性炭

牡丹(Paeoniasect. Moutan)是中國傳統(tǒng)名花，作為藥用及觀賞植物歷史悠久，現(xiàn)又發(fā)掘了其作為油料作物資源的優(yōu)質(zhì)潛力[1]?！P丹’(P.ostii‘Fengdan’)和紫斑牡丹(P.rockii)是牡丹中籽含油量高的兩大類群，且具有長勢(shì)強(qiáng)、開花盛、抗性強(qiáng)等多種優(yōu)良特性，是我國優(yōu)質(zhì)的牡丹種質(zhì)資源[2]。牡丹開花授粉得到種子，自然狀態(tài)下播種繁殖大約需3個(gè)月左右才能萌發(fā)生根，且種子具有典型的上胚軸休眠現(xiàn)象，露地播種一般在第二年春季出苗，且出苗率低，幼苗質(zhì)量不穩(wěn)定[3]，實(shí)生苗一般需要養(yǎng)護(hù)3～5年才能開花，然后再經(jīng)歷初選、復(fù)選和定名等過程，推出一個(gè)新品種至少要10年以上時(shí)間[4]。因此，研究應(yīng)用胚培養(yǎng)技術(shù)對(duì)縮短牡丹育種周期、提高育種效率有重要價(jià)值。

胚培養(yǎng)技術(shù)在梅花[5]、芍藥[6]及各類果樹[7～9]等植物上已取得較好的效果。而有關(guān)牡丹胚離體培養(yǎng)的研究基本上集中在胚萌發(fā)直接成苗[10～12]以及先誘導(dǎo)不定芽再生根成苗[13～16]兩個(gè)方面。這兩方面的關(guān)鍵都是牡丹種子休眠的解除，關(guān)于前者，Julie等研究發(fā)現(xiàn)GA促進(jìn)上胚軸的生長，低濃度的BA與GA效果相同，在只含GA不含細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基上發(fā)生的根細(xì)長，ABA與各種濃度的GA配合均抑制上胚軸的生長。Zilis等研究將種胚萌發(fā)時(shí)間由8個(gè)月縮短至12～14周。王瑩等通過使用IAA與GA配合使紫斑牡丹成苗率為11%。關(guān)于后者，劉會(huì)超等通過BA與IBA打破上胚軸休眠，然后通過IAA誘導(dǎo)生根，使‘鳳丹’成苗率為91.67%，周期65 d；王瑩等通過IAA與GA打破上胚軸休眠，然后通過IBA繼代在1/2MS+0.05%AC中直接生根，生根率54%，周期85 d。但這些研究都以紫斑或‘鳳丹’單一基因型為研究對(duì)象，前者成苗率低，后者步驟復(fù)雜，周期較長，且牡丹試管苗生根較難，二者都缺少后期移栽成活及生長情況說明，都沒能建立高效的成苗方法。

AC因具有促進(jìn)生根的作用而常被用于試管苗生根誘導(dǎo)[17]，且AC有很強(qiáng)的吸附特性，能把植物組織外泌的及培養(yǎng)基成分中抑制生長的物質(zhì)吸附掉，如組織外泌的酚類[18]、蔗糖高壓滅菌產(chǎn)生的糖醛類[19]、瓊脂中的脂肪酸等有害物質(zhì)[20]。本研究為探求牡丹種胚成苗的簡(jiǎn)單、高效、快捷的成苗方法，使用AC以促進(jìn)胚根生長與真葉萌發(fā)同步進(jìn)行，但AC在吸附生長抑制物質(zhì)的同時(shí)會(huì)把有促進(jìn)作用的物質(zhì)也吸附掉，如生長調(diào)節(jié)劑NAA、BA、IAA、ABA、2,4-D等[21～24]及有機(jī)營養(yǎng)物硫胺素、生物素、Fe-EDTA、煙酸、葉酸和吡哆醇[25～26]等，本研究的重點(diǎn)是胚直接萌發(fā)、快速成苗。為此，以AC為中心影響因子，考慮到其吸附特性，研究其與激素、光照條件、培養(yǎng)基成分等相互作用對(duì)胚萌發(fā)直接成苗的影響，通過對(duì)‘鳳丹’與紫斑牡丹的對(duì)比分析，分別建立了它們的快速成苗技術(shù)，同時(shí)重點(diǎn)對(duì)AC在此過程中的重要作用進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 種子采集與離體培養(yǎng)

材料采集與離體培養(yǎng)：2016年8月在北京延慶“國家牡丹綜合栽培標(biāo)準(zhǔn)化示范區(qū)”基地采收牡丹成熟種子，層積沙藏處理30 d后備用。將種子洗凈，流水沖洗15 min，洗滌劑漂洗15 min，再用自來水沖洗30 min后置于超凈工作臺(tái)上。用70%酒精與5%的次氯酸鈉溶液分別浸泡消毒1與15 min，然后用無菌水沖洗5次。用刀鑷將種胚取出接種于培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每處理15個(gè)外植體，3個(gè)重復(fù)。

培養(yǎng)條件：基本培養(yǎng)基為改良MS(鈣加倍)，添加蔗糖30 g·L-1、瓊脂7.5 g·L-1，pH為5.8～6.0；培養(yǎng)溫度為(20±1℃)，光照時(shí)數(shù)為每天14 h光照，光照強(qiáng)度32.4 μmol·m-2·s-1(熒光燈)。

移栽條件：移栽基質(zhì)為經(jīng)過120℃高壓滅菌20 min的珍珠巖∶蛭石∶草炭土=1∶1∶1的混合基質(zhì)[27]，移栽苗在人工氣候室中培養(yǎng)，人工氣候室條件：溫度(20±1℃)，濕度90%，光照強(qiáng)度32.4 μmol·m-2·s-1，光照時(shí)數(shù)為每天14 h光照。

1.2 試驗(yàn)內(nèi)容

1.2.1 不同因素組合對(duì)胚培養(yǎng)的影響

將‘鳳丹’以及紫斑牡丹‘紅蓮’(P.rockii‘Honglian’)的種胚接種于不同因素組合處理的培養(yǎng)基中，觀察胚培養(yǎng)情況。

表1光、激素及活性炭處理組合

Table1Combinationoflight,hormonesandactivatedcarbon

處理TreatAC(g·L-1)BA(mg·L-1)GA(mg·L-1)培養(yǎng)條件CultureconditionsCK———光照LightA1—0．50．5光照LightA20．20．50．5光照LightA30．2——光照LightA4———黑暗DarknessA5—0．50．5黑暗DarknessA60．20．50．5黑暗DarknessA70．2——黑暗Darkness

①AC+光條件+BA+GA：處理組合如表1，培養(yǎng)30 d觀察形態(tài)發(fā)展變化情況。

②AC+BA：BA濃度分別為0、0.25、0.5、1.0 mg·L-1、無AC的CK、B1-3及BA濃度分別為0、0.25、0.5、1.0、4.0、8.0、12.0 mg·L-1、分別添加0.2 g·L-1AC的B4-10。培養(yǎng)30 d觀察形態(tài)發(fā)展變化情況并統(tǒng)計(jì)平均株高(植株上部頂端到根莖的距離)、平均芽長(子葉間長出不定芽的長度)及生根率。

③AC+GA：GA濃度分別為0、0.5、1.0 mg·L-1、無AC的CK、C1-2及GA濃度分別為0、0.5、1.0 mg·L-1、分別添加0.6 g·L-1AC的C3-5。培養(yǎng)30 d觀察形態(tài)發(fā)展變化情況并統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率、真葉率(子葉間抽出真葉的種胚/接種的總種胚數(shù)×100%)、并對(duì)平均根長及平均真葉長(子葉間長出真葉的長度)進(jìn)行雙因素方差分析。

④AC+不同母液成分含量：母液成分分別為不變、大量元素雙倍、Fe鹽雙倍、有機(jī)元素雙倍、分別添加0.5 mg·L-1GA及0.6 g·L-1AC，命名為CK、D1-3。培養(yǎng)30 d觀察形態(tài)發(fā)展變化情況并統(tǒng)計(jì)生根率、真葉率、平均根長及平均真葉長。

⑤AC濃度：AC濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8 g·L-1、分別添加0.5 mg·L-1GA，分別標(biāo)記為E1-4，40 d后統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率、成苗率(既生根又有真葉抽出的種胚/接種的總種胚數(shù)×100%)及平均根長。

1.2.2 不同牡丹品種胚培養(yǎng)效果

將‘鳳丹’以及紫斑牡丹‘紅蓮’、‘京華晴雪’(P.rockii‘Jinghua Qingxue’)、‘銀紅飛荷’(P.rockii‘Yinhong Feihe’)、‘藍(lán)荷’(P.rockii‘Lanhe’)種子分別稱量千粒重，種胚接于添加0.6 g·L-1AC、0.5 mg·L-1GA的培養(yǎng)基，40 d移栽時(shí)統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率、成苗率以及平均根長，移栽培養(yǎng)3個(gè)月后統(tǒng)計(jì)移栽成活率、株高及葉片數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析，用Duncan氏法進(jìn)行差異顯著性檢測(cè)及雙因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 AC和光條件、激素對(duì)胚培養(yǎng)的影響

AC對(duì)BA、GA會(huì)產(chǎn)生特殊作用，使胚向兩個(gè)不同的方向發(fā)展。觀察發(fā)現(xiàn)‘鳳丹’與紫斑在各處理的發(fā)展趨勢(shì)基本一致，下述以‘鳳丹’為例具體描述。同時(shí)添加BA、GA的培養(yǎng)基在有AC與無AC時(shí)胚的形態(tài)發(fā)展差異顯著(圖版Ⅰ：B-C)，A1中5 d時(shí)子葉先萌動(dòng)，而A2中10 d時(shí)根先萌動(dòng)；A1中子葉及上胚軸發(fā)育，下胚軸及根部不發(fā)育，而A2中子葉及上胚軸發(fā)育不明顯，而下胚軸發(fā)育并長出根；A1中無根生長但子葉間有芽長出，而A2根先伸長，然后子葉間抽出一片真葉，與種子正常萌發(fā)狀態(tài)相似，20 d真葉抽出成苗，25 d根部發(fā)育完全，具根毛(圖版Ⅰ：I)，40 d可移栽至基質(zhì)中(圖版Ⅰ：J-K)，并在人工氣候室中培養(yǎng)，3個(gè)月后牡丹苗長勢(shì)健壯，已發(fā)新芽(圖版Ⅰ：L)，可大大縮短牡丹育苗周期。

黑暗條件、AC及激素都能促進(jìn)胚根萌動(dòng)，且影響作用大小依次為激素>AC>黑暗條件。表2中CK與A4對(duì)比，可知胚在不添加任何物質(zhì)的培養(yǎng)基中根萌發(fā)慢，需20～25 d，且子葉不發(fā)育，但A4黑暗條件下只需15～20 d；CK與A3對(duì)比可知AC也有利于根萌發(fā)，只需15 d，而A2與A3對(duì)比可知，在激素作用下胚根萌動(dòng)只需10 d；激素控制芽或真葉的生長，有激素添加A1-2、A5-6中有芽或真葉，而無激素添加的CK及A3、A4、A7中無；A1與A5，A2與A6對(duì)比說明黑暗條件雖不影響子葉間芽或真葉的生長，但胚苗白化不轉(zhuǎn)綠，不利于生長(圖版Ⅰ：A-H)。

表2光、激素及活性炭對(duì)‘鳳丹’胚培養(yǎng)的影響

Table2Effectoflight,hormonesandactivatedcarbonontheembryoculture

處理Treat形態(tài)發(fā)展?fàn)顩rSituationCK前20d胚基本不萌發(fā)，20～25d時(shí)根萌動(dòng)伸長，但子葉仍不發(fā)育Embryobasiclynotgerminatedbetweenthefirst20d，therootbe?gantostretchin20-25d，butcotyledonsarestillnotdeveloped．A15d子葉開始變綠，15d子葉成寬厚的兩片，20d子葉間芽長出，根不伸長Cotyledonsbegantoturngreenafter5d，andthickerin15d，budsgrewoutfromcotyledonsin20d，buttherootdoesnotstretched．A210d時(shí)子葉變黃白色，胚根萌動(dòng)，15d胚根1cm，20d子葉間真葉抽出Cotyledonsturnyellowish?whitein10d，radiclestartstretchedandto1cmin15d，euphyllagrewoutfromcotyledonsin20d．A310d子葉打開膨大，15d根萌動(dòng)，之后根伸長但子葉不發(fā)育，無芽無真葉Cotyledonsopenedtoenlargein10d，rootstartstretchedin15d，thentherootstillstretchedbutcotyledonsarenotdeveloped，nobudsnoleaves．A4形態(tài)發(fā)展變化與CK同，只是15～20d時(shí)根已萌動(dòng)FromchangessamewithCK，onlytherootstartstretchedin15-20d．A5形態(tài)發(fā)展變化與A1同，只是顏色偏白，不綠FromchangessamewithA1，onlythecoloriswhite，notgreen．A6形態(tài)發(fā)展變化與A2同，只是整體白化FromchangessamewithA2，onlyoverallwhitening．A7形態(tài)發(fā)展變化與A3同F(xiàn)romchangessamewithA3．

2.2 AC與BA對(duì)胚培養(yǎng)的影響

觀察發(fā)現(xiàn)，B1-3中牡丹種胚的形態(tài)發(fā)展一致，即子葉發(fā)育成厚實(shí)的兩片，子葉間長出芽，有部分根長出，與對(duì)照差異明顯(圖版Ⅱ：A-D)，隨著BA濃度的增加，胚苗平均芽長相應(yīng)增加，而生根率相應(yīng)減少。通過CK與B1-3對(duì)比可知BA具有促進(jìn)子葉發(fā)育及芽生長的作用，且高濃度的BA會(huì)抑制根的發(fā)育?！P丹’與紫斑胚苗在不同BA濃度下平均株高、平均芽長及生根率存在差異，二者的胚根生長對(duì)于BA濃度的敏感度不一樣，‘鳳丹’比紫斑更加敏感，在BA為0.5 mg·L-1時(shí)生根率為0，而紫斑在0.5 mg·L-1時(shí)生根率為25%，在1.0 mg·L-1時(shí)生根率為0(表3)。

表3BA與活性炭對(duì)胚培養(yǎng)的影響

Table3EffectsofBAandactivatedcarbononembryoculture

品種Species處理Treat株高Plantheight(cm)芽長Budslength(cm)生根率Rootingrate(%)‘鳳丹’P．ostii‘Fengdan’B11．62±0．39a0．22±0．07b65．00±7．07aB21．19±0．22b0．50±0．15a0．00±0．00bB31．49±0．33ab0．51±0．11a0．00±0．00b紫斑P．rockiiB11．34±0．47a0．16±0．05c80．00±0．00aB21．11±0．47a0．36±0．08b25．00±21．21bB31．11±0．34a0．50±0．09a0．00±0．00c

注：表中數(shù)據(jù)為均值+標(biāo)準(zhǔn)差；大小寫字母表示P<0.05水平差異顯著 下同。

Note:The data in the table is mean+standard deviation;Letter stands for significantly different inP<0.05 The same as below.

CK與B4-8中種胚發(fā)育的形態(tài)基本一致，即只有根長，子葉不發(fā)育，為黃白色，且子葉間無芽，表明培養(yǎng)基中BA可能沒有發(fā)揮作用(圖版Ⅱ：E-F)。而隨著培養(yǎng)基中BA濃度增加，在B9中胚苗根部發(fā)育，子葉由黃轉(zhuǎn)綠，胚芽生長(圖版Ⅱ：G,I)；B10中子葉綠色，部分根生長受抑制，與B1相似(圖版Ⅱ：H,J)。可見AC對(duì)BA具有有限的吸附作用。

2.3 AC與GA對(duì)胚培養(yǎng)的影響

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在C1-2與C4-5中，離體胚發(fā)育形態(tài)變化一致，即10 d時(shí)根萌動(dòng)，子葉發(fā)育不明顯，20 d時(shí)有真葉抽出，而CK與C3中只有根生長，真葉率為0，可見GA具有促進(jìn)真葉抽出及根萌發(fā)作用。

GA與活性炭對(duì)胚培養(yǎng)的影響在‘鳳丹’與紫斑牡丹中差異明顯(表4)，萌發(fā)率雖無明顯差異，但‘鳳丹’的根更容易抽長，平均根長均高于紫斑，而紫斑更容易長出真葉，真葉率明顯高于‘鳳丹’；在本實(shí)驗(yàn)中添加AC的C3-5中‘鳳丹’與紫斑的平均根長和平均真葉長均高于不添加AC的CK、C1-2培養(yǎng)基，對(duì)GA與AC在胚培養(yǎng)中對(duì)平均根長及平均真葉長的影響進(jìn)行方差分析，如表5～6所示，在‘鳳丹’胚培養(yǎng)中，GA對(duì)平均根長及平均真葉長的影響極顯著(P<0.01)，而AC對(duì)平均根長的影響顯著(P<0.05)，對(duì)平均真葉長的影響不顯著(P>0.05)。在紫斑胚培養(yǎng)中，GA對(duì)平均根長的影響顯著，對(duì)平均真葉長的影響極顯著，而AC對(duì)平均根長的影響極顯著(P<0.01)，對(duì)平均真葉長的影響不顯著(P>0.05)。GA促進(jìn)牡丹胚培養(yǎng)的平均根長及平均真葉長，而AC促進(jìn)平均根長，可見AC+GA對(duì)于牡丹胚培養(yǎng)具有積極的作用?！P丹’在C5處理中真葉率、平均根長、平均真葉長最高為63.88%、1.63 cm、0.61 cm；紫斑在C4處理中真葉率、平均根長、平均真葉長較高為100%、1.04 cm、1.38 cm；綜合數(shù)據(jù)分析，‘鳳丹’適宜濃度為0.6 g·L-1AC+1.0 mg·L-1GA，紫斑適宜濃度為0.6 g·L-1AC+0.5 mg·L-1GA。

表4GA與活性炭對(duì)胚培養(yǎng)的影響

Table4EffectofGAandactivatedcarbononembryoculture

品種Species處理Treat萌發(fā)率Induction(%)真葉率Extractionrateofeuphylla(%)平均根長Rootlength(cm)平均真葉長Euphyllalength(cm)‘鳳丹’P．ostii‘Fengdan’CK92．85±10．11a0．00±0．00c0．42±0．08d0．00±0．00bC185．00±7．07a30．00±0．00abc1．01±0．41bc0．27±0．05abC290．00±0．00a20．00±0．00bc1．58±0．58ab0．20±0．00abC387．50±17．68a0．00±0．00c0．91±0．49cd0．00±0．00bC495．23±8．26a55．40±26．38ab1．47±0．78abc0．41±0．40abC591．50±12．02a63．88±19．64a1．63±0．61a0．61±0．46a紫斑P．rockiiCK100．00±0．00a0．00±0．00b0．20±0．06c0．00±0．00bC195．83±7．22a91．67±14．43a0．97±0．49ab0．83±0．81abC274．55±4．45b74．55±4．45a0．47±0．37bc0．39±0．38bC392．85±10．11a0．00±0．00b0．80±0．80ab0．00±0．00bC4100．00±0．00a100．00±0．00a1．04±0．66a1．38±1．36aC5100．00±0．00a71．40±20．22a1．27±0．63a0．40±0．38b

2.4 AC與母液成分含量對(duì)胚培養(yǎng)的影響

據(jù)觀察，CK中胚苗子葉為黃白色并不轉(zhuǎn)綠，而D1-3中，子葉分別為綠色、微綠色、基部綠色上端白色三種情況(圖版Ⅱ：K)，可見這3種母液成分含量雙倍的培養(yǎng)基對(duì)于子葉轉(zhuǎn)綠有促進(jìn)作用，且作用大小為大量元素>鐵鹽>有機(jī)元素。如表7所示，‘鳳丹’和紫斑的生根率都較高，但是紫斑的真葉率遠(yuǎn)高于‘鳳丹’?！P丹’D1-3的平均真葉長均高于CK，但只有D1的平均根長高于CK；紫斑D1-3的平均根長均高于CK，但只有D1的平均真葉長高于CK，綜合上述分析，大量元素加倍為適宜的母液成分含量。

表5 GA與AC對(duì)‘鳳丹’平均根長及平均真葉長影響的方差分析

表6 GA與AC對(duì)紫斑平均根長及平均真葉長影響的方差分析

表7母液成分含量與活性炭對(duì)胚培養(yǎng)的影響

Table7Effectofcontentofmotherliquorandactivatedcarbononembryoculture

品種Species處理Treat生根率Rootingrate(%)真葉率Extractionrateofeuphylla(%)平均根長Rootlength(cm)平均真葉長Euphyllalength(cm)‘鳳丹’P．ostii‘Fengdan’CK95．00±8．26a55．40±26．38a1．47±0．78a0．41±0．40aD187．50±17．68a43．75±26．52a1．76±0．94a0．94±0．99aD2100±0．00a31．25±8．84a1．38±0．37a0．96±1．01aD395．00±7．07a22．50±3．54a1．34±0．37a1．70±1．84a紫斑P．rockiiCK71．40±20．22a71．40±20．22a1．04±0．66a1．38±1．36aD179．45±11．38a93．75±8．84a1．57±0．78a2．07±1．33aD2100±0．00a100±0．00a1．30±0．58a1．15±1．39aD3100±0．00a100±0．00a1．69±1．10a1．04±1．10a

表8活性炭濃度對(duì)胚培養(yǎng)的影響

Table8Effectofactivatedcarbonconcentrationonembryoculture

品種Species處理Treat生根率Rootingrate(%)真葉率Extractionrateofeuphylla(%)平均根長Rootlength(cm)平均真葉長Euphyllalength(cm)‘鳳丹’P．ostii‘Fengdan’E1100±0．00a41．67±11．79a2．35±1．55b2．78±1．35bE295．24±8．25a80．95±21．82a3．00±1．10ab4．70±1．38aE383．33±23．57a61．91±6．74a3．79±1．07a4．71±1．68aE4100±0．00a75．40±29．38a3．58±1．38ab3．75±1．65ab紫斑P．rockiiE166．33±0．47a83．32±0．02a2．00±2．18b1．03±0．67bE285．72±20．20a100±0．00a2．83±2．28ab2．13±1．81bE385．36±0．50a100±0．00a5．85±1．89a4．25±2．16aE471．63±0．28a86．21±0．71a4．72±2．96ab4．13±1．23a

2.5 AC濃度對(duì)胚培養(yǎng)的影響

根據(jù)表8，‘鳳丹’與紫斑胚的生根率及真葉率存在很大區(qū)別，‘鳳丹’的生根率較高，但真葉率較低，而紫斑的真葉率高、生根率相對(duì)低些。綜合數(shù)據(jù)分析，‘鳳丹’與紫斑各自在E3處理時(shí)平均根長及平均芽長均最高，因此E3處理為最佳處理，在進(jìn)行紫斑與‘鳳丹’牡丹胚培養(yǎng)時(shí)適宜添加的活性炭濃度為0.6 g·L-1。

2.6 牡丹品種對(duì)胚培養(yǎng)的影響

‘鳳丹’與紫斑形態(tài)發(fā)展步驟基本一致，但在萌發(fā)率、成苗率及移栽成活率上存在差異。如表9所示，萌發(fā)率與種子千粒重成正比，千粒重大，種胚體積大且營養(yǎng)含量高，方便接種操作且種胚生長發(fā)育好，種胚體積小，接種不便，易造成機(jī)械損傷，導(dǎo)致細(xì)菌污染及胚死亡?！P丹’千粒重最大為402 g，萌發(fā)率最高為98.33%，紫斑品種間差異大，‘藍(lán)荷’最小為212 g，萌發(fā)率最低為63.33%，其它較為相似；基因型對(duì)成苗率影響較大，因較易抽出真葉，4個(gè)紫斑品種成苗率皆比‘鳳丹’高，‘鳳丹’的成苗率最低為53.33%；移栽3月后統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)如表10所示，移栽成功的胚苗在株高及葉片數(shù)上相差不大，長勢(shì)良好(圖版Ⅱ：L)，4個(gè)紫斑品種的移栽成活率皆高于鳳丹，‘紅蓮’及‘銀紅飛荷’的移栽成活率為100%，‘藍(lán)荷’為75.25%，‘京華晴雪’為66.34%，‘鳳丹’的移栽成活率最低為42.5%。移栽成活率與平均根長及成苗率相關(guān)，‘鳳丹’的移栽成活率低可能因?yàn)槠涑擅缏实?，真葉抽出少，導(dǎo)致移栽后不容易進(jìn)行光合作用成活，‘京華晴雪’的平均根長較低，故而移栽成活率低，而‘藍(lán)荷’的平均根長及成苗率皆低，綜上，在此種胚培養(yǎng)方式下，紫斑品種的成苗率及成活率均高于‘鳳丹’。

表9牡丹品種對(duì)胚培養(yǎng)的影響

Table9Effectoftreepeonyvarietiesonembryoculture

品種Species千粒重/100g1000grainweight萌發(fā)率Induction(%)成苗率Seedlingrate(%)平均根長Rootlength(cm)‘鳳丹’P．ostii‘Fengdan’4．0298．33±2．88a53．33±2．89e5．07±2．03ab‘京華晴雪’P．rockii‘JinghuaQingxue’3．6595．00±1．00a91．67±2．89a4．23±2．39bc‘銀紅飛荷’P．rockii‘YinhongFeihe’3．6776．67±0．58c75．67±1．15c5．16±1．76ab‘紅蓮’P．rockii‘Honglian’2．8984．33±4．04b81．67±2．89b6．34±191a‘藍(lán)荷’P．rockii‘Lanhe’2．1263．33±2．89d61．67±2．89d3．39±1．67c

表10移栽3個(gè)月后不同牡丹品種的生長情況

Table10Growthoftreepeonyvarietiesafterthreemonthsoftransplantation

品種Species移栽成活率Transplantsurvivalrate(%)株高Plantheight(cm)葉片數(shù)Leafnumber(n)‘鳳丹’P．ostii‘Fengdan’66．34±0．47c5．75±1．46a1．88±0．64a‘京華晴雪’P．rockii‘JinghuaQingxue’42．50±3．54d5．05±2．50a1．82±1．47a‘銀紅飛荷’P．rockii‘YinhongFeihe’100±0．00a5．04±1．63a1．70±0．59a‘紅蓮’P．rockii‘Honglian’100±0．00a4．46±1．88a2．38±0．96a‘藍(lán)荷’P．rockii‘Lanhe’75．25±0．35b4．25±0．85a1．87±0．92a

3 討論

3.1 AC對(duì)牡丹胚培養(yǎng)直接成苗的作用

在植物組織培養(yǎng)中，AC常被用于防止組織褐化、促進(jìn)生長與分化、促進(jìn)根的形成、阻止不需要的愈傷的生長、及試管苗根誘導(dǎo)形成等[28～29]，同時(shí)它會(huì)吸附激素和培養(yǎng)基成分，高濃度的AC與生長調(diào)節(jié)劑合用時(shí)常抵消生長調(diào)節(jié)劑的作用，為了探究AC對(duì)胚培養(yǎng)直接成苗的影響及作用機(jī)理，將其單獨(dú)及與激素、光照條件、培養(yǎng)基成分等組合使用，研究結(jié)果表明AC對(duì)胚培養(yǎng)的影響主要在兩個(gè)方面：一是對(duì)胚的直接影響，二是通過對(duì)激素及培養(yǎng)基成分的吸附而產(chǎn)生的間接作用。研究發(fā)現(xiàn)AC確有促進(jìn)生根的作用，這與James等的研究結(jié)果一致；而關(guān)于其作用機(jī)理，有人認(rèn)為是因?yàn)槠涮峁┝撕诎淡h(huán)境[30]，也有人認(rèn)為是吸附了抑制生長的有害物質(zhì)[19]，由本研究結(jié)果：對(duì)胚根萌動(dòng)的影響作用大小AC>黑暗條件，本研究認(rèn)為活性炭有利于生根主要是因?yàn)榛钚蕴课搅艘种粕L的有害物質(zhì)，同時(shí)提供了遮光條件，所以添加AC處理的‘鳳丹’與紫斑的平均根長和平均真葉長均高于不添加AC的培養(yǎng)基。關(guān)于其吸附能力的問題比較復(fù)雜，卜學(xué)賢曾研究得出在液相中每100 mg AC大約吸附100 μg左右的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)[31]。但固體培養(yǎng)基中情況不同，因固體培養(yǎng)基操作不便，難以準(zhǔn)確計(jì)算出AC對(duì)激素的具體吸附量，只能通過胚苗的生長情況來推測(cè)激素的吸附值[32]。本研究得出BA在濃度升高時(shí)促進(jìn)芽的生長但抑制胚根，然而在添加AC的培養(yǎng)基中需高濃度的BA才能表現(xiàn)BA的作用效果，這與Takayawa和Misawa的研究一致[33]，本研究中4.0 mg·L-1的BA被0.2 g·L-1AC全部吸附，而8.0 mg·L-1的BA在0.2 g·L-1AC中仍能發(fā)揮一定作用，12 mg·L-1的BA在0.2 g·L-1AC中對(duì)胚培養(yǎng)的效果與不加AC但BA為0.25 mg·L-1相似，為BA與AC使用提供參考，避免AC使用的盲目性。在不加AC的CK與C1-2中，隨著GA濃度的增加，紫斑的真葉率、平均真葉長和平均根長均是先上升后下降，而‘鳳丹’品種除了平均根長是相應(yīng)增加外，其它兩項(xiàng)均是先上升后下降，可見GA對(duì)胚培養(yǎng)的影響有限度，在0.5 mg·L-1時(shí)較佳，而‘鳳丹’的平均根長相應(yīng)增加，可能與‘鳳丹’品種的根容易抽長有關(guān)。而在添加AC的C3-5中，隨著GA濃度的增加，‘鳳丹’的真葉率、平均真葉長和平均根長均是相應(yīng)增加，而紫斑除了平均真葉長是先上升后下降外，其它兩項(xiàng)均是相應(yīng)增加。推測(cè)AC對(duì)GA也有一定的吸附作用使GA濃度下降到適宜生長的范圍內(nèi)，但在GA+AC中各項(xiàng)數(shù)據(jù)都高于不添加AC的處理，添加0.6 g·L-1AC、0.5 mg·L-1GA與0.5 mg·L-1GA不加AC的處理中GA對(duì)胚苗的作用效果相似，可見AC對(duì)不同激素的吸附能力不一，這與王港的研究結(jié)果一致[34]，且對(duì)BA的吸附能力遠(yuǎn)大于對(duì)GA的吸附能力。植物在光合作用中需要鐵、鎂等多種成分，而AC吸附培養(yǎng)基成分，所以大量元素加倍、鐵鹽加倍、有機(jī)成分加倍的處理與對(duì)照相比都有一定的轉(zhuǎn)綠效果，且在平均根長與真葉長上有促進(jìn)作用。

3.2 激素對(duì)牡丹胚培養(yǎng)直接成苗的作用

如何協(xié)調(diào)上、下胚軸生長，是牡丹胚離體萌發(fā)、直接成苗的關(guān)鍵，其中激素發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。本研究表明，加入BA可以促進(jìn)上胚軸的生長，但隨著濃度增加下胚軸長勢(shì)不好。GA可以打破上胚軸休眠特性，使上胚軸明顯伸長，抽出真葉，且促進(jìn)胚根萌動(dòng)，但同時(shí)也表現(xiàn)為弱苗狀，這與Julie的研究一致。NAA及2,4-D在胚培養(yǎng)時(shí)易誘導(dǎo)愈傷[13]，IAA使種胚膨大，僅上胚軸生長[35]，不利于胚直接成苗，IBA對(duì)于后期試管苗根誘導(dǎo)有促進(jìn)作用[36]。為了提高胚培養(yǎng)直接成苗效率，在激素選擇上Julie通過GA直接打破上下胚軸休眠成苗，但根苗細(xì)弱，難以移栽。曹小勇[37]通過低濃度0.1 mg·L-1的BA，通過一代培養(yǎng)促使牡丹胚的上胚軸、下胚軸及胚根均正常生長，頂芽萌動(dòng)，形成完整幼苗，但難以把握BA濃度對(duì)下胚軸的抑制作用，且本研究中發(fā)現(xiàn)低濃度BA中培養(yǎng)的胚根生長狀況不佳，后期移栽存在問題。劉會(huì)超通過6-BA先誘導(dǎo)上胚軸生長、再通過IBA誘導(dǎo)胚根生長來形成完整幼苗。步驟復(fù)雜，且根誘導(dǎo)率不高。綜合認(rèn)為，本研究中單獨(dú)利用GA打破上、下胚軸休眠，同時(shí)輔以AC吸附抑制生長的有害物質(zhì)，改良培養(yǎng)基成分提高胚苗質(zhì)量是簡(jiǎn)易、高效的方式。

4 結(jié)論

牡丹種胚直接成苗技術(shù)可以使牡丹種胚快速成苗，縮短育種周期，提高種子萌發(fā)率，加速雜交育種進(jìn)程；通過研究發(fā)現(xiàn)了‘鳳丹’和紫斑牡丹種胚直接成苗的簡(jiǎn)單、高效、快捷的成苗方法：采牡丹成熟種子，層積沙藏處理一個(gè)月，采用胚培養(yǎng)方法可達(dá)到10 d生根，20 d萌發(fā)真葉成苗，25 d根系發(fā)達(dá)，40 d移栽且移栽培養(yǎng)3個(gè)月后幼苗健壯的效果，大大縮短了育種周期。紫斑胚培養(yǎng)培養(yǎng)基為：改良MS(鈣加倍、大量元素加倍)+0.6 g·L-1AC+0.5 mg·L-1GA；‘鳳丹’為：改良MS(同上)+0.6 g·L-1AC+1.0 mg·L-1GA。

1.Li S S,Yuan R Y,Chen L G,et al.Systematic qualitative and quantitative assessment of fatty acids in the seeds of 60 tree peony(PaeoniasectionMoutan DC.) cultivars by GC-MS[J].Food Chemistry,2015,173:133-140.

2.李嘉玨.中國牡丹[M].北京:中國大百科全書出版社,2011.

Li J J.Tree Peony of China[M].Beijing:China Encyclopedia Publishing House,2011.

3.成仿云,杜秀娟.低溫與赤霉素處理對(duì)‘鳳丹’牡丹種子萌發(fā)和幼苗生長的影響[J].園藝學(xué)報(bào),2008,35(4):553-558.

Cheng F Y,Du X J.Effects of Chilling and Gibberellic Acid on the Seed Germination and Seed-ling Growth inPaeoniaostii‘FengDan’[J].Acta Horticulturae Sinica,2008,35(4):553-558.

4.成仿云,李嘉玨,陳德忠,等.中國紫斑牡丹[M].北京:中國林業(yè)出版社,2005:77-84.

Cheng F Y,Li J J,Chen D Z,et al.Chinese Flare Mudan[M].Beijing:China Forestry Publishing House,2005:77-84.

5.潘曉,陳瑞丹.‘淡豐后’梅胚培養(yǎng)影響因素的研究[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2010,2(32):88-92.

Pan X,Chen R D.Factors affecting embryo culture ofPrunusmume‘Dan Fenghou’[J].Journal of Beijing Forest University,2010,2(32):88-92.

6.Shen M M,Tang Z J,Da Silva Jat,et al.Induction and proliferation of axillary shoots from in vitro culture ofPaeonialactifloraPall. mature zygotic embryos[J].New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science,2015,43(1):42-52.

7.杜學(xué)梅,李登科,王永康,等.棗胚培技術(shù)體系的建立[J].園藝學(xué)報(bào),2005,32(3):496-499.

Du X M,Li D K,Wang Y K,et al.Estabilishment of Embryo Culture Technical System of Chinese Jujube(ZizyphusjujubeMill.) [J].ActaHorticulturae sinica,2005,32(3):496-499.

8.王際軒,李淑珍,李博文,等.山楂砧木苗的種胚培養(yǎng)[J].園藝學(xué)報(bào),1982,9(4):7-10.

Wang J X,Li S Z,Li B W,et al.embryo culture of Hawthorn(Crataeguspinnatifida) rootstocks[J].Acta Horticulturae Sinica,1982,9(4):7-10.

9.王元裕,周碧英,趙安祥,等.柑桔胚培養(yǎng)技術(shù)的研究Ⅰ,-成熟種子胚的分離培養(yǎng)[J].園藝學(xué)報(bào),1979,6(1):3-8,35.

Wang Y Y,Zhou B Y,Zhao A X,et al.Studies on the technique of citrus embryo culture Ⅰ,The segregate culture of citrus embryos of mature seed[J].ActaHorticulturae sinica,1979,6(1):3-8,35.

10.Zilis M R,Meyer M M.Rapid in vitro germination of immature,dormant embryos[J].Comb ProcAnnu Meet Int Plant Propag Soc,1976.

11.Buchheim J A T,Burkhart L F,Meyer M M Jr.Effect of exogenous gibberellic acid,abscisic acid,and benzylaminopurine on epicotyl dormancy of cultured herbaceous peony embryos[J].Plant cell,Tissue and Organ Culture,1994,36(1):35-43.

12.Wang H,Van Stadenj.Establishment ofinvitrocultures of tree Peonies[J].South African Journal of Botany,2001,67(2):358-361.

13.Brukhin V B,Batygina T B.Embryo culture and somatic embryogenesis in culture ofPaeoniaanomala[J].Phytomorphology,1994,44(34):151-157.

14.劉會(huì)超,賈文慶,王坤.牡丹胚培養(yǎng)及叢生苗繼代培養(yǎng)研究[J].北方園藝,2010,(6):172-174.

Liu H C,Jia W Q,Wang K.The Culture of Peony Embryo and Subculture of Multiple Bud[J].Northern Horticulture,2010,(6):172-174.

15.王瑩,何桂梅,韓麗曉.紫斑牡丹胚培養(yǎng)及幼苗生長的研究[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué),2012(9):103-106.

Wang Y,He G M,Han L X.Study on Embryo-culture and Seedling Growth forPaeoniarockii[J].Hunan Agricultural Sciences,2012(9):103-106.

16.Jana S,Sivanesan I,Lim M Y,et al.In vitro zygotic embryo germination and somatic embryogenesis through cotyledonary explants ofPaeonialactifloraPall[J].Flower Research Journal,2013,21(1):17-22.

17.James A C,Harris R A,Mantell S H.PaeoniaSpecies(Tree Peonies)[M].//Bajaj Y P S.Trees IV.Berlin Heidelberg:Springer,1996:244-268.

18.Fridborg G,Pedersen M,Landstrom L E,et al.The Effect of Activated Charcoal on Tissue Cultures:Adsorption of Metabolites Inhibiting Morphogenesis[J].Physiologia Plantarum,1978,43(2):104-106.

19.Weatherhead M A,Burdon J,Hensgaw G G.Effects of Activated Charcoal as an Additive Plant Tissue Culture Media:Part 2[J].ZeitschriftFür Pflanzenphysiologie,1979,94(5):399-405.

20.Kohlenbach H W,Wernicke W.Investigations on the Inhibitory Effect of Agar and the Function of Active Carbon in Anther Culture[J].ZeitschriftFür Pflanzenphysiologie,1978,86(5):463-472.

21.Maene L,Debergh P.Liquid medium additions to established tissue cultures to improve elongation and rootinginvivo[J].Plant Cell,Tissue and Organ Culture(PCTOC),1985,5(1):23-33.

22.Constantin M J,Henke R R,Mansur M A.Effect of activated charcoal on callus growth and shoot organogenesis in tobacco[J].In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant,1977,13(5):293-296.

23.Scholl R L,Keathley D E,Baribault T J.Enhancement of Root Formation and Fertility in Shoots Regenerated From Anther and Seedling-Derived Callus Cultures ofArabidopsisthaliana[J].ZeitschriftFür Pflanzenphysiologie,1981,104(3):225-231.

24.Johansson L,Andersson B,Eriksson T.Improvement of anther culture technique:Activated charcoal bound in agar medium in combination with liquid medium and elevated CO2concentration[J].Physiologia Plantarum,2010,54(1):24-30.

25.Bourgin J P,Nitsch J P.Production of haploids nicotiana from excised stamens[J].Annales De Physiologie Vegetale,1967,9(4):377-382.

26.Johansson L B,Calleberg E,Gedin A.Correlations between activated charcoal,Fe-EDTA and other organic media ingredients in cultured anthers ofAnemonecanadensis[J].Physiologia Plantarum,1990,80(2):243-249.

27.Rogers A.Peonies:5th ed[M].Oregon:Timber Press,1995:91-105.

28.李萍,成仿云,張穎星.防褐劑對(duì)牡丹組培褐化發(fā)生、組培苗生長和增殖的作用[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2008,30(2):71-76.

Li P,Cheng F Y,Zhang Y X.Effects of browning antagonists on antibrowning,growth and multiplication of tissue culture of tree peony[J].Journal of Beijing Forestry University,2008,30(2):71-76.

29.Pan M J,Van Staden J.The use of charcoal in in vitro culture-A review[J].Plant growth regulation,1998,26(3):155-163.

30.Kuhne U,Gennerich S.Possibilities of improving in vitro rooting in pome and stone fruits[J].Gartenbauwissenschaft,1988,35(6):180-182.

31.卜學(xué)賢,陳維倫.活性碳對(duì)培養(yǎng)基中植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的吸附作用[J].植物生理學(xué)報(bào),1998,14(4):401-405.

Bu X X,Chen W L.The effect of activated charcoal on the adsorption of plant regulators in culture medium[J].ActaPhytophysiologicaSinica,1988,14:401-405.

32.劉用生,曾兆云,王秀芹等,活性炭吸附作用的生物鑒定[J].植物生理學(xué)通訊,1995,31(2):123-126.

Liu Y S,Zeng Z Y,Wang X Q.The Biological Assay for the Adsorption of Activated Charcoal[J].Plant Physiology Communications,1995:123-125.

33.Takayama S,Misawa M.Differentiation inLiliumbulbscalesgrown in vitro.Effects of activated charcoal,physiological age of bulbs and sucrose concentration on differentiation and scale leaf formation in vitro[J].Physiologia Plantarum,1980,48(1):121-125.

34.王港,楊秀平,李周岐.活性炭對(duì)組織培養(yǎng)中幾種植物激素的吸附作用[J].林業(yè)科技開發(fā),2006,20(6):26-27.

Wang,Yang X P,Li Z Q.Absorption Effect of Activated Charcoal to Hormones during Plant Tissue Culture[J].China Forestry Science and Technology,2006,20(6):26-27.

35.何桂梅.牡丹遠(yuǎn)緣雜交育種及其胚培養(yǎng)與體細(xì)胞胚發(fā)生的研究[D].北京:北京林業(yè)大學(xué),2006.

He G M.Studies on Distant Cross-breeding and Embryo in vitro Culture and Somatic Embryogenesis in Tree Peonies[D].Beijing:Beijing Forestry University,2006.

36.Bouza L,Jacques M,Miginiac E.Requirements for in vitro rooting ofPaeoniasuffruticosaAndr.cv.‘Mme de Vatry’[J].Scientiahorticulturae,1994,58(3):223-233.

37.曹小勇.瀕危植物紫斑牡丹胚離體培養(yǎng)[J].氨基酸和生物資源,2003,25(2):35-36.

Cao X Y.In Vitro Culture of Embryo of Endangered PlantPaeoniarockii[J].Amino Acids and Biotic Resources,2003,25(2):35-36.

圖版Ⅰ A～H.培養(yǎng)30 dCK、A1-7中胚苗；I.培養(yǎng)25 dA2胚苗根部具完整根毛；J.培養(yǎng)40 dA2培養(yǎng)基中胚苗；K.培養(yǎng)40 dA2試管外胚苗；L.移栽培養(yǎng)3個(gè)月后胚苗(新芽已出)Plate Ⅰ A-H. Embryo plantlets of treat CK,A1-7 after 30 d culture; I. Root of embryo plantlets of treat A2 have complete root hair after 25 d culture; J. Embryo plantlets of treat A2 after 40 d culture; K. Embryo plantlets outside the tube of treat A2 after 40 d culture; L. Embryo plantlets after transplanting for 3 months(There are new buds)

Beijing supports the common construction project in central University(2016GJ-02)

introduction：XU Li(1994—),female,master,Ornamental Plants and Horticulture.

date:2017-03-27

StudyonRapidSeedling-raisingTechnologyofTreePeonyEmbryoCulture

XU Li CHENG Fang-Yun*ZHONG Yuan

(College of Landscape Architecture,Beijing Forestry,National Flower Engineering Technology Research Center,Beijing 100083)

This study usedPaeoniaostii‘Fengdan’ andPaeoniarockiias explants, established efficient method of Seedling-raising of tree peony embryo culture through the study of hormones, light conditions, medium ingredients and activated carbon(AC) on the in vitro embryo culture. The main result: In vitro embryos radicle germination in 10 d, grow true leaves in 20 d, root system developed in 25 d, transplanting in 40 d, after 3 months the seedlings grow well in the medium of improved MS(calcium doubled)+0.2 g·L-1AC+0.5 mg·L-1GA+0.5 mg·L-1BA. Suitable medium for ‘Fengdan’: improved MS(calcium doubled，macroelement doubled)+0.6 g·L-1AC+1.0 mg·L-1GA; medium forP.rockii: improved MS(calcium doubled，macroelement doubled)+0.6 g·L-1AC+0.5 mg·L-1GA; The seedling rate of ‘Fengdan’ was 63.88%, the survival rate was 66.34%, and the rate of seedling ofP.rockiiwas 93.75%, and survival rates vary among breeds, with a maximum of 100%.

embryo culture;Paeoniaostii‘Fengdan’;Paeoniarockii;activated carbon

北京市支持中央在京高校共建項(xiàng)目(2016GJ-02)

徐莉(1994—)，女，碩士研究生，主要從事園林植物與觀賞園藝方面的研究。

* 通信作者：E-mail:chengfy@263.net

2017-03-27

* Corresponding author：E-mail:chengfy@263.net

S567.1+5

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.05.008