王 巖，周倩倩，萬(wàn)銹琳，王佳瑩，侯紅漫，張公亮*

（大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 大連 116034）

異硫氰酸酯類(lèi)香料對(duì)兩種革蘭氏陽(yáng)性致病菌的抑制作用

王 巖，周倩倩，萬(wàn)銹琳，王佳瑩，侯紅漫，張公亮*

（大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 大連 116034）

選取9 種異硫氰酸酯類(lèi)香料，以金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌作為供試菌，通過(guò)測(cè)量抑菌圈直徑考察此類(lèi)含硫香料的抑菌活性，并探討其構(gòu)效關(guān)系。篩選抑菌效果最好的含硫香料，利用反轉(zhuǎn)錄熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)考察其對(duì)金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶nuc基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示：4 種異硫氰酸酯類(lèi)香料——異硫氰酸芐酯（benzyl isothiocyanate，BZITC）、異硫氰酸苯乙酯（phenethyl isothiocyanate，PEITC）、異硫氰酸3-甲硫基丙酯（3-methylthiopropyl isothiocyanate，MTPITC）和異硫氰酸異戊酯（isoamyl isothiocyanate，IAITC）對(duì)2 種革蘭氏陽(yáng)性菌的抑菌效果較好，且抑菌能力為BZITC≈PEITC＞MTPITC＞IAITC。對(duì)比9 種異硫氰酸酯類(lèi)香料的抑菌活性，BZITC對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性最強(qiáng)，最低抑菌濃度為0.61 mmol/L，對(duì)單增李斯特菌的最低抑菌濃度為4.88 mmol/L。在亞抑菌濃度條件下，BZITC極顯著地降低了金黃色葡萄球菌毒力基因nuc的表達(dá)（P＜0.01）。以上結(jié)果說(shuō)明，苯基的存在可能增強(qiáng)異硫氰酸酯類(lèi)香料的抑菌活性，該結(jié)構(gòu)對(duì)BZITC抑制金黃色葡萄球菌毒力基因nuc的表達(dá)具有重要作用。

異硫氰酸酯類(lèi)香料；革蘭氏陽(yáng)性菌；抑菌活性；構(gòu)效關(guān)系；毒力基因表達(dá)

在食用香料中，含硫香料占據(jù)十分重要的地位。GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》及美國(guó)食品香料與萃取物制造者協(xié)會(huì)（Flavor Extract Manufacturers’ Association，F(xiàn)EMA）公布的食品香料名單中，包含多種含硫香料[1]。近幾年，F(xiàn)EMA新公布的一般認(rèn)為安全的物質(zhì)中，含硫香料的比例都超過(guò)31%[2-3]。目前，對(duì)含硫香料的研究報(bào)道主要集中在硫醚類(lèi)化合物上，如大蒜的活性成分方面[4-5]。異硫氰酸酯類(lèi)香料主要從十字花科植物提取，為R—N＝C＝S結(jié)構(gòu)，具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗癌和抗腫瘤等生物活性[6-8]。目前，對(duì)此種香料的抑菌構(gòu)效研究比較少，主要集中在香料合成方面[9-10]。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）是常見(jiàn)的革蘭氏陽(yáng)性致病菌。金黃色葡萄球菌是造成人類(lèi)食物中毒的常見(jiàn)致病菌之一，由金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的腸毒素可引起食物的污染，感染后可導(dǎo)致惡心、嘔吐、腹瀉等腸炎反應(yīng)[11-12]。單增李斯特菌具有高致病率的特點(diǎn)，且對(duì)外界環(huán)境具有很強(qiáng)的適應(yīng)性，在食品的貯藏、運(yùn)輸及加工過(guò)程中極易受到其污染[13-15]，是對(duì)人類(lèi)衛(wèi)生健康具有重大影響的病原微生物之一[16]。因此，選取安全有效的食品級(jí)抑制劑來(lái)控制食品中的金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌污染具有十分重要的研究意義。

金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生多種與毒力強(qiáng)弱、致病力有關(guān)的毒素和細(xì)胞外酶，其中，由nuc基因編碼的耐熱核酸酶是產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌污染的一個(gè)典型特征，它不但是細(xì)菌成功侵入宿主的重要因子之一，而且是檢測(cè)金黃色葡萄球菌污染食品和引起感染的特征標(biāo)志[17-18]。目前研究含硫香料對(duì)金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶基因表達(dá)的影響情況很少，本實(shí)驗(yàn)選取了9 種異硫氰酸酯類(lèi)香料，研究其對(duì)2 種革蘭氏陽(yáng)性致病菌——金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的抑制作用，并探討其構(gòu)效關(guān)系。同時(shí)利用異硫氰酸酯類(lèi)香料，研究其對(duì)金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶nuc基因表達(dá)的調(diào)控情況，為含硫香料的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究根據(jù)GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[19]選取9 種異硫氰酸酯類(lèi)香料，均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。名稱(chēng)及結(jié)構(gòu)式見(jiàn)表1。

表1 9 種異硫氰酸酯類(lèi)香料的名稱(chēng)及結(jié)構(gòu)式Table 1 Names and structures of nine isothiocyanate flavors

金黃色葡萄球菌ATCC 6538、單增李斯特菌ATCC 19115由大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

胰蛋白胨、酵母膏、氯化鈉、瓊脂粉、大豆蛋白胨、磷酸氫二鉀、葡萄糖（分析純） 大連博諾生物化學(xué)試劑公司；無(wú)水乙醇（分析純） 沈陽(yáng)力誠(chéng)試劑廠；RNAprep pure培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌總RNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；SYBR?Premix Ex TaqTM、Random primers[pd(N)6]、5×M-MLV Buffer、dNTP Mixture、RNase Inhibitor、RTase M-MLV（RNase H）寶生物工程（大連）有限公司；RNase-free water、熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）用引物 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA（A）型電子天平 上海民橋精密科學(xué)儀器公司；01J2003-04型高壓滅菌鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；ZHWY-100B型恒溫培養(yǎng)振蕩器、ZHWY-2102C型雙層小容量全溫度恒溫?fù)u床 上海智城分析儀器制造有限公司；DRP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；UV-1750型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津儀器有限公司；MyiQTM2型熒光定量PCR儀 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 含硫香料的處理

按照下式求出所需原液和無(wú)水乙醇的體積后，將9 種異硫氰酸酯類(lèi)香料稀釋至適當(dāng)濃度，密封備用。

式中：c為稀釋的異硫氰酸酯類(lèi)香料的濃度/（mol/L）；ρ為異硫氰酸酯類(lèi)香料的密度/（g/L）；V1為異硫氰酸酯類(lèi)香料的體積/L；M為異硫氰酸酯類(lèi)香料的摩爾質(zhì)量/（g/mol）；V2為無(wú)水乙醇的體積/L。

1.3.2 培養(yǎng)基的配制

溶菌肉湯（lysogeny broth，LB）培養(yǎng)基，用于金黃色葡萄球菌培養(yǎng)：胰蛋白胨1 g、酵母膏0.5 g、氯化鈉1 g、瓊脂1.5 g、去離子水100 mL，調(diào)節(jié)pH值至7.0，于121 ℃條件下滅菌20 min。

胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基，用于單增李斯特菌培養(yǎng)：胰蛋白胨1.7 g、大豆蛋白胨0.3 g、氯化鈉0.5 g、磷酸氫二鉀0.25 g、葡萄糖0.25 g、瓊脂1.5 g、去離子水100 mL，調(diào)節(jié)pH值至（7.3±0.2），于121 ℃條件下滅菌15 min。

1.3.3 菌種的活化與培養(yǎng)

取-80 ℃凍存的菌液，吸取適量于液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)24 h進(jìn)行初次活化；將上述菌液劃平板過(guò)夜培養(yǎng)；挑取平板上的單菌落，轉(zhuǎn)接至液體培養(yǎng)基中。用生理鹽水將上述菌液配成含菌體為106～107CFU/mL的菌懸液，備用。

1.3.4 抑菌圈直徑的測(cè)定

采用濾紙片法，測(cè)定抑菌圈直徑的大小[20-21]，并略有改進(jìn)。取100 μL上述菌懸液均勻涂布于固體培養(yǎng)基上，平鋪直徑為1 cm的圓形濾紙片，添加6 μL的0.08 mol/L異硫氰酸酯類(lèi)香料，置于37 ℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)18～24 h。每種香料做3 組平行，最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值。

1.3.5 最低抑菌濃度的測(cè)定

根據(jù)1.3.4節(jié)的結(jié)果，選取抑菌效果最好的異硫氰酸酯類(lèi)香料測(cè)定最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。采用60%乙醇溶液將5 mol/L異硫氰酸酯類(lèi)香料稀釋成17 個(gè)濃度，分別為2.50、1.25、0.63 mol/L等，直至76.28 μmol/L。取0.1 mL菌液添加至0.8 mL液體培養(yǎng)基中，分別添加0.1 mL不同濃度的異硫氰酸酯類(lèi)香料，充分振蕩均勻，于37 ℃條件下培養(yǎng)24 h。分別取培養(yǎng)液100 μL，涂布平板，37 ℃培養(yǎng)24 h[22]。觀察有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，以無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的異硫氰酸酯類(lèi)香料的最低濃度記為MIC。每種香料3 組平行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值。

1.3.6 異硫氰酸酯類(lèi)香料作用下供試菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將抑菌效果最好的異硫氰酸酯類(lèi)香料濃度稀釋成1/4 MIC、1/2 MIC（根據(jù)1.3.5節(jié)結(jié)果），取菌液1 mL添加至99 mL液體培養(yǎng)基中，分別添加0.1 mL異硫氰酸酯類(lèi)香料，以添加0.1 mL無(wú)水乙醇為對(duì)照組，振蕩培養(yǎng)24 h，每隔2 h，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定菌液OD600nm，以O(shè)D600nm為縱坐標(biāo)，時(shí)間t為橫坐標(biāo)，繪制實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組生長(zhǎng)曲線。

1.3.7 RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR

在LB培養(yǎng)基中分別添加不同抑菌濃度（根據(jù)1.3.5節(jié)結(jié)果）的異硫氰酸酯類(lèi)香料，以未添加異硫氰酸酯類(lèi)香料作為對(duì)照組，培養(yǎng)12 h，取適量的菌液，按照細(xì)菌總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行RNA提取，反轉(zhuǎn)錄為cDNA[23-24]。反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR的25 μL反應(yīng)體系：SYBR?Premix Ex TaqTM12.5 μL；濃度為10 μmol/L的引物對(duì)各0.5 μL；cDNA模板2 μL；RNase-free Water 9.5 μL。nuc基因引物：上游5’-GCG ATT GAT GGT GAT ACG GTT-3’、下游5’-AGC CAA GCC TTG ACG AAC TAA AGC-3’[25]；16S rRNA內(nèi)參基因引物：上游5’-GCT GCC CTT TGT ATT GTC-3’、下游5’-AGA TGT TGG GTT AAG TCC C-3’[26]。

反應(yīng)參數(shù)：95 ℃ 1 min；95 ℃ 20 s，62 ℃ 20 s，于80 ℃停留15 s，收集熒光信號(hào)，反應(yīng)40 個(gè)循環(huán)；并在60～95 ℃范圍內(nèi)建立熔解曲線。16S rRNA作為內(nèi)參基因，利用方程2-ΔΔCt表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量[27]。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 異硫氰酸酯類(lèi)香料對(duì)2 種革蘭氏陽(yáng)性致病菌的抑菌效果

異硫氰酸酯類(lèi)香料濃度稀釋為0.08 mol/L，在此濃度條件下對(duì)2 種供試菌的抑制作用見(jiàn)表2。結(jié)果表明，4 種異硫氰酸酯類(lèi)香料對(duì)金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌有抑制作用，分別為BZITC、MTPITC、PEITC和IAITC。

表2 9 種異硫氰酸酯類(lèi)香料對(duì)供試菌的抑制作用Table 2 Inhibitory effect of nine isothiocyanate flavors on the tested bacteria

2.2 異硫氰酸酯類(lèi)香料的抑菌作用

圖1 異硫氰酸酯類(lèi)香料對(duì)金黃色葡萄球菌（A）和單增李斯特菌（B）的抑制作用Fig. 1 Diameter of inhibition zone of isothiocyanate flavors against S. aureus (A) and L. monocytogenes (B)

以金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌為供試菌，選取對(duì)其有抑菌作用的異硫氰酸酯類(lèi)香料進(jìn)行抑菌圈實(shí)驗(yàn)。如圖1所示，4 種異硫氰酸酯類(lèi)香料對(duì)金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的抑菌能力大小均為BZITC≈PEITC＞MTPITC＞IAITC，其中BZITC和PEITC的抑菌效果顯著強(qiáng)于其他2 種香料（P＜0.05）。BZITC和PEITC對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑分別為（2.67±0.35）cm和（2.33±0.23）cm，對(duì)單增李斯特菌抑菌圈直徑分別為（2.55±0.26）cm和（2.09±0.30）cm。

BZITC和PEITC側(cè)鏈取代基中分別含有苯甲基和苯乙基，而其他2 種香料不含有，BZITC和PEITC的抑制作用較強(qiáng)，說(shuō)明在本研究抑菌體系下，側(cè)鏈取代基含有苯基的異硫氰酸酯類(lèi)香料對(duì)金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的抑制作用更強(qiáng)，對(duì)于含有苯環(huán)的這2 種異硫氰酸酯類(lèi)香料，亞甲基的個(gè)數(shù)對(duì)金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的抑菌效果無(wú)顯著的影響（P＞0.05）。

MTPITC和BUITC的分子式分別為C5H9NS2和C5H9NS，兩者結(jié)構(gòu)相似，前者連接的基團(tuán)為甲硫基，后者為甲基。MTPITC對(duì)金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的抑制能力較強(qiáng)，而B(niǎo)UITC無(wú)抑制作用，說(shuō)明結(jié)構(gòu)中甲硫基的存在或硫原子數(shù)目的增多同樣可能增強(qiáng)對(duì)金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的抑菌活性，這與前期的研究結(jié)果，即具有相同取代基團(tuán)的硫醚類(lèi)香料，硫原子的數(shù)量可能對(duì)其抑菌效果有重要影響[28-29]相似。

IPITC、IBITC和IAITC在結(jié)構(gòu)上相似，IPITC側(cè)鏈上無(wú)亞甲基、IBITC含有1 個(gè)亞甲基、IAITC含有2 個(gè)亞甲基。IAITC對(duì)金黃色葡萄球菌有微弱的抑制作用，而IPITC和IBITC無(wú)抑制作用，說(shuō)明對(duì)于這3 種異硫氰酸酯類(lèi)香料，結(jié)構(gòu)相似，亞甲基的個(gè)數(shù)的增多可能對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果有一定的影響。

可見(jiàn)，不同的異硫氰酸酯類(lèi)香料由于結(jié)構(gòu)上的差異對(duì)同一種革蘭氏陽(yáng)性致病菌的抑菌活性是不同的；同一種異硫氰酸酯類(lèi)香料對(duì)不同的2 種革蘭氏陽(yáng)性致病菌可能存在著菌間差異，但大體上趨勢(shì)一致。這與前期研究的含氧硫醚類(lèi)香料的抑菌作用的結(jié)論相似[30]。BZITC和PEITC比其他7 種不含有苯基的異硫氰酸酯類(lèi)香料抑菌效果更明顯，所以可能是側(cè)鏈苯基的存在極大地加強(qiáng)了異硫氰酸酯類(lèi)香料的抑菌活性。

2.3 BZITC對(duì)2 種革蘭氏陽(yáng)性致病菌的MIC

選取對(duì)這2 種供試菌均有最強(qiáng)抑制作用的BZITC，測(cè)定其MIC，結(jié)果見(jiàn)表3。當(dāng)BZITC的濃度大于4.88 mmol/L時(shí)，對(duì)這2 種革蘭氏陽(yáng)性致病菌均表現(xiàn)出良好的抑菌效果。BZITC對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用強(qiáng)于單增李斯特菌，其對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為0.61 mmol/L，對(duì)單增李斯特菌的MIC為4.88 mmol/L。

表3 BZITC對(duì)2 種革蘭氏陽(yáng)性致病菌的MICTable 3 MIC of BZITC for two Gram-positive pathogenic bacteria

2.4 BZITC對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線的影響

如圖2所示，在0～14 h，金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)較快，14 h以后金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期。BZITC對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用在1/4 MIC～MIC之間具有一定的濃度依賴性。經(jīng)MIC和1/2 MIC的BZITC處理的金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)受到明顯的抑制，特別是處于MIC的BZITC，金黃色葡萄球菌立即停止生長(zhǎng)，1/2 MIC的BZITC大約抑制了金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的1/8左右，濃度在1/4 MIC時(shí)，BZITC對(duì)金黃色葡萄球菌不再有抑制效果，與對(duì)照組相比的生長(zhǎng)曲線幾乎重合。

圖2 BZITC對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線的影響Fig. 2 Effect of BZITC on the growth curve of S. aureus

2.5 BZITC對(duì)單增李斯特菌生長(zhǎng)曲線的影響

圖3 BZITC對(duì)單增李斯特菌生長(zhǎng)曲線的影響Fig. 3 Effect of BZITC on the growth curve of L. monocytogenes

由圖3可知，添加MIC、1/2 MIC和1/4 MIC的BZITC，單增李斯特菌的生長(zhǎng)受到了抑制，MIC的BZITC完全抑制了單增李斯特菌的生長(zhǎng)，1/2 MIC的BZITC抑制單增李斯特菌生長(zhǎng)量的1/3左右，1/4MIC的BZITC仍可以輕微抑制單增李斯特菌的生長(zhǎng)，表明抑制作用具有一定的濃度依賴性。

2.6 BZITC對(duì)金黃色葡萄球菌毒力基因nuc表達(dá)的影響

圖4 BZITC對(duì)金黃色葡萄球菌nuc基因表達(dá)的影響Fig. 4 Effect of BZITC on the expression of nuc gene in S. aureus

如圖4所示，與對(duì)照組相比，添加不同亞抑菌濃度的BZITC，金黃色葡萄球菌毒力基因nuc的表達(dá)量均極顯著降低（P＜0.01）。1/64 MIC的BZITC與對(duì)照組相比，nuc的表達(dá)量降低了30%左右，1/16 MIC的BZITC下降了55%左右，當(dāng)BZITC的濃度為1/4 MIC，與對(duì)照組相比，nuc基因的表達(dá)量降低了約85%，只有對(duì)照組的15%左右，結(jié)果顯示出一種濃度依賴性。這與大蒜素以一種劑量依賴性方式降低金黃色葡萄球菌hla基因表達(dá)的結(jié)論類(lèi)似，大蒜素的主要成分為甲基烯丙基硫醚、二烯丙基硫醚等含硫香料[26]。

3 結(jié) 論

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，9 種異硫氰酸酯類(lèi)香料中，BZITC和PEITC對(duì)2 種革蘭氏陽(yáng)性致病菌均有較強(qiáng)的抑制作用，側(cè)鏈苯基的存在很可能極大地加強(qiáng)了異硫氰酸酯類(lèi)含硫香料的抑菌活性。BZITC對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果最強(qiáng)，MIC為0.61 mmol/L。BZITC對(duì)2 種革蘭氏陽(yáng)性致病菌生長(zhǎng)曲線的抑制作用呈現(xiàn)濃度依賴性。在MIC條件下，能夠完全抑制供試菌的生長(zhǎng)，這與抑菌實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相符。亞抑菌濃度條件下的BZITC以一種濃度依賴性的方式，極顯著地降低了金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶nuc基因的表達(dá)（P＜0.01）。

[1] 劉玉平, 孫寶國(guó). 含硫食用香料的合成及應(yīng)用[J]. 中國(guó)食品添加劑,2003(6): 69; 82-84. DOI:10.3969/j.issn.1006-2513.2003.06.019.

[2] SMITH R L, DOULL J, FERON V J, et al. GRAS flavoring substances 20[J]. Food Technology, 2001, 55(12): 34-55.

[3] SMITH R L, COHEN S M, DOULL J, et al. GRAS flavoring substances 21[J]. Food Technology, 2003, 57(5): 46-59.

[4] 彭光華. 三種大蒜有機(jī)硫化物抑菌性能的比較[J]. 西藏科技,2009(4): 10-12. DOI:10.3969/j.issn.1004-3403.2009.04.003.

[5] 楊轉(zhuǎn)琴, 魏紅, 曹雯, 等. 大蒜提取液及食醋抑菌作用的研究[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(1): 69-73. DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2008.01.009.

[6] TECHAPIESANCHAROENKIJ N, FIALA J L A, NAVASUMRIT P,et al. Sulforaphane, a cancer chemopreventive agent, induces pathways associated with membrane biosynthesis in response to tissue damage by aflatoxin B1[J]. Toxicology and Applied Pharmacology, 2015,282(1): 52-60. DOI:10.1016/j.taap.2014.11.004.

[7] 林海鳴, 鄭曉鶴, 周軍, 等. 硫代葡萄糖苷及異硫氰酸酯的抗癌和抗氧化作用進(jìn)展[J]. 中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué), 2015, 32(4): 513-520.DOI:10.13748/j.cnki.issn1007-7693.2015.04.032.

[8] 劉艷全, 劉鵬, 蔣珍菊, 等. 山葵生物活性成分及其保健作用的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng), 2017, 23(4): 59-62.

[9] JAYASHREEE N, LATONGLILA J, BHISMA K P. Improved procedure for the preparation of isothiocyanates via iodine-mediated desulfurization of dithiocarbamic acid salts[J]. Green Chemistry Letters and Reviews,2011, 4(1): 1-34. DOI:10.1080/17518253.2010.486773.

[10] RAMESH Y, HARISADHAN G, SIVA M, et al. Efficient preparation of isothiocyanates from dithiocarbamates using bromineless brominating reagent[J]. Synthetic Communications, 2010, 40(14):2083-2096. DOI:10.1080/00397910903219476.

[11] 何洋, 周黎黎, 劉紅露, 等. 應(yīng)用基因芯片技術(shù)檢測(cè)食品中金黃色葡萄球菌[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2007, 33(6): 108-110. DOI:10.3321/j.issn:0253-990X.2007.06.027.

[12] 張彥春, 楊杰, 荊紅波. 北京市順義區(qū)生牛奶中金黃色葡萄球菌污染情況及耐藥性[J]. 首都公共衛(wèi)生, 2009, 3(2): 84-85. DOI:10.3969/j.issn.1673-7830.2009.02.015.

[13] VáZQUEZ-BOLAND J A, KUHN M, BERCHE P, et al. Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants[J]. Clinical Microbiology Reviews, 2001, 14(3): 584-640. DOI:10.1128/CMR.14.3.584-640.2001.

[14] BELTON B, LITTLE D. The development of aquaculture in central Thailand: domestic demand versus export-led production[J]. Journal of Agrarian Change, 2008, 8(1): 123-143. DOI:10.1111/j.1471-0366.2007.00165.x.

[15] SHI H, TRINH Q, XU W T, et al. The transcriptional response of virulence genes in Listeria monocytogenes during inactivation by nisin[J]. Food Control, 2013, 31(2): 519-524. DOI:10.1016/j.foodcont.2012.11.008.

[16] MAKARITI I P, PRINTEZI A, KAPETANAKOU A E, et al.Investigating boundaries of survival, growth and expression of genes associated with stress and virulence of Listeria monocytogenes in response to acid and osmotic stress[J]. Food Microbiology, 2015, 45:231-244. DOI:10.1016/j.fm.2014.06.023.

[17] VANCRAEYNEST D, HAESEBROUCK F, HERMANS K. Multiplex PCR assay for the detection of high virulence rabbit Staphylococcus aureus strains[J]. Veterinary Microbiology, 2007, 121(3/4): 368-372.DOI:10.1016/j.vetmic.2006.12.011.

[18] 唐俊妮, 史賢明, 張榮, 等. 不同條件對(duì)金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶活性影響的研究[J]. 西南民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2010, 36(4):589-592. DOI:10.3969/j.issn.1003-2843.2010.04.021.

[19] 國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì). 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn): GB 2760—2014[S]. 北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2014: 135-183 .

[20] 江潔芳. 花椒中抑菌活性成分提取工藝的研究[J]. 中國(guó)調(diào)味品,2011, 36(3): 30-32. DOI:10.3969/j.issn.1000-9973.2011.03.007.

[21] 賀菊萍, 趙勇, 孫曉紅, 等. 牛蒡提取液對(duì)副溶血性弧菌的抑制作用[J]. 天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā), 2012, 24(3): 381-384. DOI:10.3969/j.issn.1001-6880.2012.03.024.

[22] LAMBERT R J W, SKANDAMIS P N, COOTE P J, et al. A study of the minimum inhibitory concentration and mode of action of oregano essential oil, thymol and carvacrol[J]. Journal of Applied Microbiology, 2001, 91(3): 453-462. DOI:10.1046/j.1365-2672.2001.01428.x.

[23] UPADHYAY A, JOHNY A K, AMALARADJOU M A, et al. Plantderived antimicrobials reduce Listeria monocytogenes virulence factors in vitro, and down-regulate expression of virulence genes[J].International Journal of Food Microbiology, 2012, 157(1): 88-94.DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2012.04.018.

[24] QIU J, LI H, MENG H, et al. Impact of luteolin on the production of alpha-toxin by Staphylococcus aureus[J]. Letters in Applied Microbiology, 2011, 53(2): 238-243. DOI:10.1111/j.1472-765X.2011.03098.x.

[25] 謝秀蘭, 劉溪源, 王建東, 等. 奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌8 種毒力基因的PCR檢測(cè)[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī), 2014, 41(10): 47-50.

[26] LENG B F, QIU J Z, DAI X H, et al. Allicin reduces the production of α-toxin by staphylococcus aureus[J]. Molecules, 2011, 16(9): 7958-7968. DOI:10.3390/molecules16097958.

[27] VIKRAM A, ANTE V M, BINA X R, et al. Cyclo (valine-valine)inhibits Vibrio cholerae virulence gene expression[J]. Microbiology,2014, 160(6): 1054-1062. DOI:10.1099/mic.0.077297-0.

[28] 張公亮, 丁佳琦, 董偉峰, 等. 幾種硫醚類(lèi)香料抑菌活性的研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2012, 33(9): 127-130. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2012.09.086.

[29] AVATO P, TURSI F, VITALI C, et al. Allylsulfide constituents of garlic volatile oil as antimicrobial agents[J]. Phytomedicine, 2000,7(3): 239-243. DOI:10.1016/S0944-7113(00)80010-0.

[30] 梁穎, 朱俊雅, 張公亮, 等. 含氧硫醚類(lèi)香料對(duì)常見(jiàn)致病菌的體外抑菌活性研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2015, 36(18): 108-112.DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.013.

Inhibitory Effect of Isothiocyanate Flavors on Two Gram-Positive Pathogenic Bacteria

WANG Yan, ZHOU Qianqian, WAN Xiulin, WANG Jiaying, HOU Hongman, ZHANG Gongliang*
(School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China)

Nine isothiocyanate flavors were selected to evaluate their antibacterial activities against Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes by measuring the diameter of inhibition zone. Besides, the structure-activity relationship for these compounds was further investigated. The highest inhibitory effect of sulfur-containing flavors was screened to investigate its impact on the expression of the thermostable nuclease (nuc) gene of S. aureus as determined by real-time reverse transcription quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR). The results showed that benzyl isothiocyanate(BZITC), phenethyl isothiocyanate (PEITC), 3-methylthiopropyl isothiocyanate (MTPITC) and isoamyl isothiocyanate(IAITC) had better inhibitory effect against the two Gram-positive bacteria, and the inhibitory effect followed the descending order of BZITC ≈ PEITC 〉 MTPITC 〉 IAITC. Among the nine isothiocyanate flavors, BZITC showed the highest inhibitory effect against S. aureus with a minimal inhibitory concentration (MIC) of 0.61 mmol/L compared to 4.88 mmol/L for L. monocytogenes. At sub-inhibitory concentrations, BZITC markedly decreased the expression of the virulence factor nuc in S. aureus (P 〈 0.01). These results suggested that the presence of benzene ring may enhance the antibacterial activity of isothiocyanate flavors, and play an important role in the inhibitory effect of virulence factor gene nuc expression of BZITC in S. aureus.

isothiocyanate flavors; Gram-positive bacteria; antibacterial activity; structure-activity relationship; virulence factor expression

10.7506/spkx1002-6630-201721003

TS202.3

A

1002-6630（2017）21-0015-06

2016-09-13

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31571888）；遼寧省高等學(xué)校優(yōu)秀人才支持計(jì)劃項(xiàng)目（LJQ2015010）

王巖（1991—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)與工程。E-mail：18804208629@163.com

*通信作者：張公亮（1978—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞阄痘瘜W(xué)。E-mail：zhanggl1978@hotmail.com

王巖, 周倩倩, 萬(wàn)銹琳, 等. 異硫氰酸酯類(lèi)香料對(duì)兩種革蘭氏陽(yáng)性致病菌的抑制作用[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(21): 15-20.

10.7506/spkx1002-6630-201721003. http://www.spkx.net.cn

WANG Yan, ZHOU Qianqian, WAN Xiulin, et al. Inhibitory effect of isothiocyanate flavors on two Gram-positive pathogenic bacteria[J]. Food Science, 2017, 38(21): 15-20. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201721003. http://www.spkx.net.cn