基于特征圖譜及多指標成分含量的冬蟲夏草野生與人工繁育品比較研究

昝珂　黃莉莉　過立農　劉杰　鄭健　馬雙成　錢正明　李文佳

[摘要]采用高效液相色譜法建立冬蟲夏草野生及人工繁育品的特征圖譜，并同時測定4種主要核苷的含量。以尿苷、肌苷、鳥苷和腺苷等4種成分為對照品，采用Waters XSelect HSS T3 C18 （46 mm×250 mm， 5 μm）； 水（A） 乙腈 （B）為流動相，梯度洗脫（0～5 min，0% B；5～15 min，0～10% B，15～30 min，10%～20% B ；30～33 min，20%～50% B； 33～35 min，50%～0% B；35～40 min，0% B），流速06 mL·min-1，檢測波長為260 nm，柱溫30 ℃，進樣量5 μL，建立冬蟲夏草野生品和人工繁育品的特征圖譜，并同時測定4種主要核苷的含量。冬蟲夏草人工繁育品和野生品之間特征圖譜和4種主要核苷含量均無顯著性差異，該研究能夠為冬蟲夏草人工繁育品的進一步開發(fā)利用提供科學依據。

[關鍵詞]冬蟲夏草； 野生品； 人工繁育品； 特征圖譜； 核苷； 高效液相色譜

[Abstract]This study is to establish the HPLC specific chromatogram and determine four main nucleosides of wild and cultivated Cordyceps sinensis Uridine， inosine， guanosine and adenosine were selected as reference substance HPLC analysis was performed on a Waters XSelect HSS T3 C18 （46 mm×250 mm， 5 μm）， with a mobile phase consisting of water（A）acetonitrile （B） at a flow rate of 06 mL·min-1 （05 min，0% B；515 min，0%10% B， 1530 min，10%20% B， 3033 min， 20%50% B， 3335 min， 50%0% B， 3540 min， 0% B） The detection wavelength was 260 nm and the column temperature was controlled at 30 ℃， and the injection volume was 5 μL HPLC specific chromatogram of wild and cultivated C sinensis was established and four main nucleosides were simultaneously determined by the above method Specific chromatograms and contents of four main nucleosides showed no significant differences between cultivated and wild C sinensis These results can provide scientific evidences for further development and utilization of cultivated C sinensis.

[Key words]Cordyceps sinensis； wild； cultivated； specific chromatograms； nucleosides； HPLC

冬蟲夏草為麥角菌科真菌冬蟲夏草菌Cordyceps sinensis （BerK） Sacc寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座和幼蟲尸體的干燥復合體，主要分布在我國青海、西藏、甘肅、云南和四川等高海拔地區(qū)，是傳統(tǒng)的名貴中藥材，在中國有悠久的藥用歷史，具有補腎益肺、止血化痰的功效[13]。近年來，冬蟲夏草的人工繁育技術獲得突破，為冬蟲夏草野生資源稀缺可持續(xù)發(fā)展提供了一條途徑[4]。核苷類成分是冬蟲夏草的主要活性成分，具有明顯的藥理活性，《中國藥典》以腺苷為含量測定指標[513]。冬蟲夏草的核苷類成分研究較多，但野生品和人工繁育品之間的特征圖譜和主要成分含量比較的研究較少。本文建立冬蟲夏草野生品和人工繁育品的HPLC特征圖譜，并進行相似度比較；同時測定尿苷、肌苷、鳥苷和腺苷等4種主要核苷的含量，為冬蟲夏草人工繁育品的進一步開發(fā)使用提供科學依據。

1材料

11儀器

1260型高效液相色譜儀（安捷倫公司），二極管陣列檢測器（安捷倫公司），QUINTIX3131CN型1/1萬電子天平（Sartorius公司），MSE125S型1/10萬電子天平（Sartorius公司），KQ300DV型超聲波清洗器（江蘇昆山市超聲儀器有限公司），MilliQ純水儀（密理博公司）。

12試藥

對照品尿苷（批號110887200202）、肌苷（批號140669201305）、鳥苷（批號111977201501）和腺苷（批號110879200202）由中國食品藥品檢定研究院提供；HPLCDAD（面積歸一化法）檢測純度均大于980%。甲醇和乙腈為色譜純（Fisher公司），試驗用水為超純水。

13藥材

野生冬蟲夏草1～26采自于西藏自治區(qū)、青海省、四川省、甘肅省、云南?。欢x夏草人工繁育品1～20）由廣東東陽光藥業(yè)有限公司提供；蛹蟲草1～2采自廣東省和天津市；發(fā)酵蟲草菌粉（Cs4）1～2采自江西省；發(fā)酵冬蟲夏草菌粉（CsCQ80）1～2采自浙江省。

實驗樣品均經中國食品藥品檢定研究院中藥民族藥檢定所鄭健研究員鑒定；冬蟲夏草人工繁育品和野生品鑒定為麥角菌科真菌冬蟲夏草菌C sinensis寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座和幼蟲尸體的干燥復合體；蛹蟲草鑒定為麥角菌科真菌蛹蟲草C militaris L Link的子實體；發(fā)酵蟲草菌粉（Cs4）為麥角菌科真菌蝙蝠蛾擬青霉Paeailonyces hepialid Chen Cs4菌株，經生物工程液體深層發(fā)酵所得菌絲體的干燥粉末；發(fā)酵冬蟲夏草菌粉為CsCQ80中華被毛孢Hirsutella sinensis Liu，Guo，Yuet Zeng （1989） 經液體深層發(fā)酵所得菌絲體的干燥粉末。endprint

2方法與結果

21溶液的制備

211混合對照品溶液的制備

取尿苷、肌苷、鳥苷和腺苷對照品適量，精密稱定，加水制成每1 mL含尿苷、鳥苷、肌苷和腺苷分別為5025，4840，4675，2030 μg的對照品儲備液。分別取對照品儲備液適量，加水制成每1 mL含尿苷、鳥苷、肌苷和腺苷分別為5025，4840，4675，2030 μg的混合對照品溶液，即得。

212供試品溶液的制備

取本品粉末（過3號篩）約02 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水10 mL，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz，20 ℃以下）30 min，再稱定重量，用水補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

23色譜條件與系統(tǒng)適用性

色譜柱Waters Xselect HSS T3 C18（46 mm×250 mm，5 μm）；流動相水（A）乙腈（B）梯度洗脫（0～5 min，0% B；5～15 min，0%～10% B；15～30 min，10%～20% B；30～33 min，20%～50% B； 33～35 min，50%～0% B；35～40 min，0% B）；流速 06 mL·min-1；檢測波長 260 nm；柱溫 30 ℃。

24特征圖譜

241冬蟲夏草特征圖譜的建立

取冬蟲夏草野生品1～26和人工繁育品1～20粉末，精密稱定，按22項方法制備供試品溶液，精密吸取5 μL，分別進樣測定，記錄40 min的HPLC色譜圖，轉換成AIA格式，采用導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012130723版本，下稱“指紋圖譜軟件”）見圖1，2。26批野生冬蟲夏草的色譜圖生成對照特征圖譜見圖3；以此野生冬蟲夏草對照特征圖譜為參照圖譜計算野生品、人工繁育品、發(fā)酵蟲草菌粉（Cs4）、發(fā)酵冬蟲夏草菌粉（CsCQ80）及蛹蟲草的相似度，結果見表1，2。

從下到上分別為對照特征圖譜、野生冬蟲夏草1～26。

從下到上分別為對照特征圖譜，冬蟲夏草人工繁育品1～20，發(fā)酵蟲草菌粉，發(fā)酵冬蟲夏草菌粉蛹蟲草。

242特征峰的標定

根據26批冬蟲夏草野生品的特征圖譜檢測結果，共標定12個特征峰。經過與對照品比對，可知5號峰為尿苷，7號峰為肌苷，8號峰為鳥苷，10號峰為腺苷；經文獻分析，1號峰為尿嘧啶，2號峰為酪氨酸，3號峰為次黃嘌呤，4號峰為黃嘌呤，6號峰為2′去氧尿苷，9號峰為胸苷，11號峰為2′脫氧腺苷，12號峰為色氨酸。

243方法學考察

2431精密度試驗精密吸取野生冬蟲夏草1供試品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄色譜圖。以腺苷為參照峰，計算特征峰的相對保留時間及相對峰面積，結果各特征峰的相對保留時間的RSD<10%，單峰面積占總峰面積大于2%的特征峰的相對峰面積RSD<20%，采用指紋圖譜軟件進行評價，相似度為099，結果表明儀器精密度良好。

2432穩(wěn)定性試驗精密吸取野生冬蟲夏草1供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，12 h，按3項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以腺苷為參照峰，計算特征峰的相對保留時間及相對峰面積，結果各特征峰的相對保留時間的RSD<10%，單峰面積占總峰面積大于2%的特征峰的相對峰面積RSD<20%，采用指紋圖譜軟件進行評價，相似度為099，表明供試品溶液在12 h內穩(wěn)定性良好。

2433重復性試驗精密吸取野生冬蟲夏草1供試品溶液6份，精密稱定，按22項方法分別制備供試品溶液，按3項色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以腺苷為參照峰，計算特征峰的相對保留時間及相對峰面積，結果各特征峰的相對保留時間的RSD<1%，單峰面積占總峰面積大于2%的特征峰的相對峰面積RSD<2%，采用指紋圖譜軟件進行評價，相似度為099，結果表明，該方法重復性好。

244野生品和人工繁育品特征圖譜比較

建立的HPLC特征圖譜能夠區(qū)別冬蟲夏草及發(fā)酵蟲草菌粉（Cs4）、發(fā)酵冬蟲夏草菌粉（CsCQ80）和蛹蟲草。與對照特征圖譜相比，發(fā)酵蟲草菌粉（Cs4）的相似度為084～086，發(fā)酵冬蟲夏草菌粉（CsCQ80）為075～076，蛹蟲草為079～080，三者相似度均小于09。而46批冬蟲夏草的相似度均在09以上，26批野生冬蟲夏草的相似度在091以上，20批冬蟲夏草人工繁育品的相似度均在094以上。冬蟲夏草人工繁育品與野生冬蟲夏草的特征圖譜基本一致。

25含量測定

251系統(tǒng)適用性試驗

按3項色譜條件進行檢測，尿苷、肌苷、鳥苷和腺苷4種成分分離度大于15，理論塔板數大于1萬，色譜圖見圖4。

252方法學考察

2521線性關系考察精密吸取各對照品儲備液01，02，05，10，20 mL分別置于5個10 mL量瓶中，加水定容至刻度，搖勻各系列濃度的混合對照品溶液。分別精密吸取上述混合對照品溶液各5 μL，注入液相色譜儀，測定，以各對照品質量濃度（mg·L-1）為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，結果見表3，表明各化合物在相應線性范圍內線性關系良好。

2522精密度試驗精密吸取21項混合對照品溶液5 μL，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結果尿苷、肌苷、鳥苷和腺苷的峰面積的RSD分別為036%，029%，045%，048%（n=6），表明儀器精密度良好。

A 混合對照品溶液；B 野生品 ；C 人工繁育品；5尿苷； 7肌苷；8鳥苷；10腺苷。

2523重復性試驗取樣品粉末（野生品1）6份，分別按照22項方法制備供試品溶液，按3項色譜方法測定，記錄峰面積，計算含量。結果各份供試品溶液的尿苷、肌苷、鳥苷和腺苷的測定結果RSD（n=6）分別為089%，096%，078%，12%，結果表明重復性良好。endprint

2524溶液穩(wěn)定性試驗取同一份供試品溶液（野生品1），分別于0，2，4，8，12 h進樣測定。結果尿苷、肌苷、鳥苷和腺苷的峰面積的RSD（n=6）分別為038%，035%，079%，091%，結果表明供試品溶液在12 h內穩(wěn)定。

2525加樣回收試驗取已知含量的1號冬蟲夏草野生品粉末6份，每份約01 g，置具塞錐形瓶中，精密加入各對照品溶液（尿苷2010 mg·L-1、肌苷1936 mg·L-1、鳥苷935 mg·L-1和腺苷7105 mg·L-1）各1 mL，分別按照22項方法制備供試品溶液，按3項色譜方法測定，記錄峰面積，計算回收率結果尿苷、肌苷、鳥苷和腺苷平均加樣回收率（n=6）分別為1016%，1025%，1023%，9860%，RSD分別為17%，15%，13%，17%。

2526樣品含量測定分別取野生冬蟲夏草和人工繁育品，按22項方法制備供試品溶液，再按3項色譜條件進行測定，用外標法計算樣品含量，結果見表4。

3討論

31色譜條件的選擇

本文采用梯度洗脫法分離冬蟲夏草藥材中的4種主要核苷類成分，40 min內完成分離，尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷分離效果良好，符合含量測定要求。本文通過二極管陣列檢測器考察所測物質紫外吸收，4種成分均為260 nm，故選擇260 nm作為檢測波長。流動相選擇乙腈水系統(tǒng)，以純水為起始溶劑梯度洗脫各色譜峰均實現基線分離，能夠達到定量要求。

32提取條件的選擇

冬蟲夏草服用時多以水提取，加上核苷類成分極性大、水溶性好，流動性以純水為起始梯度，提取溶劑中存在有機相容易導致色譜圖鼓包，本試驗選擇以純水為溶劑制備供試品溶液。由于部分核苷類成分熱穩(wěn)定性差，超聲提取時加冰塊以避免核苷分解。

33含量測定結果分析

采用SPSS 190軟件處理20批冬蟲夏草人工繁育品和26批野生冬蟲夏草的4種主要核苷（尿苷、肌苷、鳥苷和腺苷）的含量測定結果。冬蟲夏草人工繁育品和野生品2個樣本組，經獨立樣本t檢驗顯示無顯著性差異；通過主成分分析，結果見圖5，2組樣本之間分布均勻，結果顯示野生品和人工繁育品2組之間4種主要核苷含量均無顯著性差異。

本研究建立冬蟲夏草野生品和人工繁育品的特

征圖譜，并同時測定4種主要核苷類成分，并進行了比較分析，為冬蟲夏草藥材質量綜合評價提供了科學依據。冬蟲夏草人工繁育品和野生品核苷類成分

基本一致，其他類型化學成分以及藥理活性尚需進一步研究。

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[責任編輯丁廣治]endprint