孫良廣，黃文婧*

（廣西梧州食品藥品檢驗(yàn)所，廣西 梧州 543002）

實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)快速檢測(cè)蓮蓉制品中蕓豆成分

孫良廣1，黃文婧2,*

（廣西梧州食品藥品檢驗(yàn)所，廣西 梧州 543002）

目的：建立基于實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)檢測(cè)蓮蓉制品中蕓豆成分的方法。方法：以蕓豆pvsbe2基因高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和探針，通過(guò)對(duì)蓮子及其他富含淀粉類(lèi)植物DNA進(jìn)行擴(kuò)增，以驗(yàn)證方法的特異性；以1 ng/μL的蕓豆DNA進(jìn)行系列稀釋?zhuān)_定此法檢測(cè)靈敏度；對(duì)含有1%蕓豆與蓮子的混合樣品的DNA模板進(jìn)行10 倍梯度稀釋?zhuān)_定重量檢測(cè)靈敏度；并應(yīng)用此方法和PCR方法對(duì)市場(chǎng)樣品進(jìn)行了檢測(cè)，對(duì)建立的熒光PCR方法進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果：該檢測(cè)方法具有高度特異性，與蓮子及其他高淀粉植物無(wú)交叉反應(yīng)；DNA質(zhì)量濃度的檢測(cè)靈敏度達(dá)到1 pg/μL，重量檢測(cè)靈敏度可達(dá)0.01%。含蕓豆成分的蓮蓉月餅擴(kuò)增陽(yáng)性，檢測(cè)結(jié)果與食品標(biāo)簽相符。結(jié)論：本研究建立的實(shí)時(shí)熒光PCR方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，更適合蓮蓉制品中蕓豆成分的快速檢測(cè)。

蓮蓉制品；蕓豆成分；檢測(cè)；實(shí)時(shí)熒光PCR

近年來(lái)，由于蓮子價(jià)格的不斷攀升，不少?gòu)S家為了節(jié)約成本會(huì)用蕓豆餡料冒充蓮蓉餡料。蕓豆內(nèi)除含有維生素、無(wú)機(jī)鹽等營(yíng)養(yǎng)成分外，還含有一種對(duì)人體有害的成分——血球凝集素，該成分經(jīng)高溫烹調(diào)后可被破壞。但是如果在蕓豆加工過(guò)程中，烹調(diào)時(shí)間短或翻炒不均勻，致使蕓豆不熟，可引起食物中毒[1]。蕓豆在消化吸收過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生過(guò)多的氣體，造成脹肚。故消化功能不良、有慢性消化道疾病的人應(yīng)盡量少食。還有一些對(duì)豆類(lèi)蛋白敏感人群，如誤食豆制品，可能會(huì)引起過(guò)敏性皮炎或嚴(yán)重的會(huì)產(chǎn)生休克。這些不適宜食用蕓豆類(lèi)食品的人群若誤食沒(méi)有標(biāo)示有蕓豆成分的蓮蓉月餅，可能會(huì)造成不可預(yù)計(jì)的嚴(yán)重后果。

蕓豆的檢測(cè)依據(jù)GB/T 23814—2009《蓮蓉制品中蕓豆成分定性PCR檢測(cè)方法》蓮蓉制品中蕓豆成分定性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)方法[2]，該方法為普通PCR法，主要過(guò)程為通過(guò)特異性基因序列擴(kuò)增后用凝膠成像的方式鑒別，此法步驟繁瑣，干擾因素較多，不利于批量檢測(cè)。通過(guò)查閱大量文獻(xiàn)[3-26]后，參照GB/T 23814—2009標(biāo)準(zhǔn)中的蕓豆特異性基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物和探針，建立蓮蓉制品中蕓豆成分的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，此法具有反應(yīng)快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高、結(jié)果清晰等優(yōu)點(diǎn)，更適合實(shí)驗(yàn)室的批量和快速檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

用于蕓豆成分特異性檢測(cè)樣品皆由本實(shí)驗(yàn)室提供，包括：白蕓豆、紅蕓豆、花蕓豆、黑蕓豆、大豆、蓮子、玉米、紅薯、小麥、薏米、板栗、花生、土豆、魔芋共14 種物種。市售蓮蓉月餅（包括20 種標(biāo)示為純蓮蓉月餅，15 種未標(biāo)示出蓮蓉含量，5 種標(biāo)示有白蕓豆成分，以下統(tǒng)稱(chēng)為蓮蓉月餅）共40 份。

Hi-DNAsecure Plant Kit高效植物基因組DNA提取試劑盒（貨號(hào)：DP350-02） 天根生化科技（北京）有限公司；LabServ Plant DNA Kit磁珠法植物DNA提取試劑盒（貨號(hào)：KFR-804096） 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；植物基因組DNA提取試劑盒（貨號(hào)：T003L）廣州迪澳生物科技有限公司；Taq DNA聚合酶、dNTP、10×PCR Buffer TaKaRa生物工程公司；2×ES PCR M aster M ix （貨號(hào)：CW 0690M）、DNA標(biāo)準(zhǔn)M arker（100 bp ladder）（貨號(hào)：CW 0636S） 北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

M inispin臺(tái)式高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；M IN IB-1 0 0F恒溫金屬浴 杭州米歐儀器有限公司）、XA 205DU電子天平 德國(guó)梅特勒-托利多公司；LightCycler96熒光定量PCR儀 瑞士羅氏公司；Thermo Fisher Duo磁珠提取儀、OSE-260微量分光光度計(jì)天根生化科技有限公司；C1000 Touch PCR儀、PowerPac Basic電泳儀、Gel Doc XR+凝膠成像分析儀 美國(guó)伯樂(lè)公司。

1.3 方法

1.3.1 引物與探針設(shè)計(jì)合成

熒光PCR檢測(cè)上游引物：ATGAATTGTACGG TGAAGGATGG；下游引物：GGACTGTAAACAAACA CAGGTAGC；探針：FAM-5’-TCGCAGTCTCGTTG T CACCTCCA-3’-BHQ1；普通PCR引物參照GB/T 23814—2009標(biāo)準(zhǔn)，引物和探針由深圳華大基因科技有限公司合成。

1.3.2 樣品制備

將蕓豆樣品去皮烤干后用粉碎機(jī)打成粉末，其他物種樣品均用粉碎機(jī)打碎后取樣用于DNA的提取。蓮蓉月餅樣本取月餅餡料用于DNA提取。

取含1%蕓豆與蓮子的混合樣品的DNA模板進(jìn)行10 倍逐級(jí)稀釋?zhuān)故|豆在混合樣品中的含量為1%、0.1%、0.01%。用于含量檢測(cè)靈敏度的測(cè)定。

1.3.3 DNA提取

將含有1%蕓豆的樣品、純蕓豆樣品、隨機(jī)抽取5批蓮蓉月餅，取樣量均為（40±2）mg。采用Tiangen（天根）的Hi-DNAsecure Plant Kit高效植物基因組DNA提取試劑盒、迪澳的植物基因組DNA提取試劑盒和LabServ Plant DNA Kit磁珠法植物DNA提取試劑盒在Thermo Fisher Duo磁珠提取儀上提取，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用OSE-260型微量分光光度計(jì)測(cè)定DNA質(zhì)量濃度和對(duì)比不同試劑盒的DNA提取效果。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)

實(shí)時(shí)熒光PCR采用25 μL反應(yīng)體系：10×PCR Bu ffer 2.5 μL，dNTP（2.5mm o l/L）1 μL，M gC l2（25 mm o l/L）3 μL，上、下游引物（50 mm o l/L）各0.07 μL，探針（50 mmol/L）0.05 μL，Taq酶（5 U/μL）0.3 μL，50%甘油0.2 μL，模板DNA 5 μL，補(bǔ)水至25 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 m in，95 ℃變性5 s，55 ℃退火60 s，同時(shí)收集熒光，進(jìn)行45 個(gè)循環(huán)。

1.3.5 實(shí)時(shí)熒光PCR的特異性實(shí)驗(yàn)

選取白蕓豆、紅蕓豆、花蕓豆、黑蕓豆、大豆、蓮子、玉米、紅薯、小麥、薏米、板栗、花生、土豆、魔芋的DNA作為PCR的模板，以去離子水為陰性對(duì)照模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，檢測(cè)熒光引物的特異性。

1.3.6 實(shí)時(shí)熒光PCR的靈敏度實(shí)驗(yàn)

取白蕓豆提取出的DNA模版進(jìn)行稀釋至1 ng/μL，然后再進(jìn)行一系列梯度稀釋?zhuān)瑢⑾盗邢♂尩腄NA模版進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，測(cè)試熒光PCR法的檢測(cè)靈敏度。取質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%蕓豆與蓮子的混合樣品的DNA模板進(jìn)行10 倍系列稀釋?zhuān)故|豆在混合樣品中的含質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、0.1%、0.01%，作為PCR反應(yīng)得模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，測(cè)試方法的含量檢測(cè)靈敏度。

1.3.7 蕓豆PCR擴(kuò)增

普通PCR反應(yīng)體系：2×Es PCR M aster M ix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL（20 pmol/μL），RNase-Free Water 7.5 μL，模板DNA 3 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 m in；94 ℃變性30 s；56 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，35 個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸5 m in。

普通PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取方法比較實(shí)驗(yàn)

3 種DNA提取方法的提取下列樣本，對(duì)樣本DNA含量和純度（以A260nm/A280nm表示）進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

由于蓮蓉月餅餡料中含有大量的糖分和油脂，會(huì)影響DNA的提取效果，依據(jù)GB/T 23814—2009標(biāo)準(zhǔn)要求，當(dāng)A260nm/A280nm在1.4以上時(shí)，可用于PCR擴(kuò)增，1.7～2.0之間時(shí)，PCR擴(kuò)增效果好[2]，通過(guò)3 種試劑盒提取的DNA質(zhì)量濃度和純度數(shù)據(jù)對(duì)比，最終確定用迪澳的植物基因組DNA提取試劑盒提取蓮蓉月餅樣本（A260nm/A280nm均能達(dá)到1.4以上），用天根的高效植物基因組DNA提取試劑盒提取植物類(lèi)樣本（A260nm/A280nm均能達(dá)到1.8以上）。確保后續(xù)PCR擴(kuò)增不會(huì)受DNA純度的影響干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判定。

2.2 實(shí)時(shí)熒光PCR法特異性檢測(cè)結(jié)果

圖1 蕓豆成分實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測(cè)圖譜Fig. 1 Specificity of real-time fluorescent PCR for detection of kidney bean com ponent

采用本試劑盒對(duì)富含淀粉植物DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，只有4 種蕓豆樣品的DNA有明顯的S型擴(kuò)增曲線（Ct值在19.66～22.56之間），其余10 種植物DNA均未出現(xiàn)明顯的S型擴(kuò)增曲線（圖1）。結(jié)果表明，本研究建立的方法所設(shè)計(jì)的引物和探針具有高度的種屬特異性。

2.3 實(shí)時(shí)熒光PCR法靈敏度測(cè)試結(jié)果

以質(zhì)量濃度為1、0.1、0.01、0.005、0.001、0.000 5 ng/μL的蕓豆DNA為模板，進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，從擴(kuò)增圖譜（圖2）可以看出，在0.001 ng/μL以上的蕓豆DNA中均出現(xiàn)了明顯的S型擴(kuò)增曲線。其Ct值依次為25.91、29.65、33.21、34.59、35.84。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法檢測(cè)靈敏度為0.001 ng/μL（即1 pg/μL）。與國(guó)標(biāo)采用的普通PCR方法相比較檢測(cè)靈敏度為0.5 ng，檢測(cè)的靈敏度更高，是普通PCR的500 倍。

圖2 蕓豆成分DNA質(zhì)量濃度靈敏度實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)擴(kuò)增圖譜Fig. 2 Amp lification curves show ing the sensitivity of real-time fluorescent PCR for detection of different concentrations of kidney bean DNA

將1.3.2節(jié)1%、0.1%、0.01%三個(gè)稀釋梯度的蕓豆混合樣品DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，此3 個(gè)濃度的蕓豆混合樣品均有明顯S型擴(kuò)增曲線（圖3），Ct值依次為27.90、31.45、34.57。結(jié)果表明，該方法能檢測(cè)出原料產(chǎn)品中0.01%的蕓豆成分。

圖3 蕓豆成分實(shí)時(shí)熒光PCR重量靈敏度檢測(cè)圖譜Fig. 3 Amp lification curves show ing the sensitivity of real-time fluorescent PCR for detection of different proportions of kidney bean component

表1 實(shí)驗(yàn)樣品DNA提取結(jié)果Tab le 1 Resu lts of DNA extraction from experimental sam p les

2.4 使用熒光PCR方法和普通PCR方法檢測(cè)市售蓮蓉月餅的蕓豆成分

將市售的40 批次不同廠家不同種類(lèi)的蓮蓉月餅進(jìn)行DNA提取后，分別用普通PCR法和實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)進(jìn)行相互驗(yàn)證，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4、5及表2。

圖4 市售樣品檢測(cè)結(jié)果Fig. 4 Am p lification curves for commercial sam p les

圖5 蓮蓉制品中蕓豆成分DNA凝膠電泳圖譜Fig. 5 Gel electrophoresis of am p lified DNA from kidney bean in lotus seed paste product

通過(guò)以上實(shí)時(shí)熒光PCR和普通PCR比較結(jié)果表明，1、2、3、17、18這5 批含有蕓豆成分的蓮蓉月餅使用實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)均呈現(xiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增，與食品標(biāo)簽標(biāo)識(shí)完成一致；而使用普通PCR法檢測(cè)，17、18號(hào)樣品含有蕓豆成分未出現(xiàn)目的條帶，與食品標(biāo)簽標(biāo)識(shí)不一致，存在漏檢現(xiàn)象。標(biāo)識(shí)純蓮蓉月餅的為20 種，實(shí)時(shí)熒光PCR法檢出有蕓豆成分為10 種，檢出率50%，普通PCR法檢出蕓豆成分為5 種，檢出率25%。未標(biāo)示蓮蓉含量的月餅共15 種，實(shí)時(shí)熒光PCR法檢出有蕓豆成分為8種，檢出率53.3%，普通PCR法檢出蕓豆成分為4 種，檢出率26.7%。

表2 市售樣品用實(shí)時(shí)熒光PCR和普通PCR法檢測(cè)結(jié)果比對(duì)Tab le 2 Com parison of the results of real time fluorescence PCR and conventional PCR for commercial sam p les

3 討 論

熒光PCR自1995年由美國(guó)App lied Biosystem s公司推出開(kāi)始問(wèn)世，該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR技術(shù)從定性到定量的飛躍，而且比普通PCR特異性更強(qiáng)、操作更加方便快捷，并有效地解決了常規(guī)PCR污染及對(duì)操作人員健康隱患的問(wèn)題。目前，熒光PCR已經(jīng)得到了較為廣泛的應(yīng)用。熒光定量PCR技術(shù)在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上，在PCR擴(kuò)增過(guò)程中加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；剛開(kāi)始時(shí)，探針結(jié)合在DNA任意一條單鏈上；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’端-3’端外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步[26]。

本研究建立的蕓豆實(shí)時(shí)熒光PCR方法對(duì)蓮蓉制品中的蕓豆成分進(jìn)行定性檢測(cè)，DNA質(zhì)量濃度靈敏度可到達(dá)1 pg/μL，比標(biāo)準(zhǔn)靈敏度0.5 ng提升近500 倍，含量檢測(cè)靈敏度可達(dá)到0.01%。對(duì)40 種市售月餅進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果實(shí)時(shí)熒光PCR法蕓豆成分檢出率57.5%，普通PCR法蕓豆成分檢出率30%，實(shí)時(shí)熒光PCR法比普通PCR法檢出率高出將近一倍。對(duì)5 種外包裝標(biāo)識(shí)有蕓豆成分的蓮蓉月餅檢測(cè)結(jié)果表明，實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)準(zhǔn)確率為100%，普通PCR法檢測(cè)準(zhǔn)確率只有60%。由于蓮蓉制品為深加工產(chǎn)品，在加工過(guò)程中DNA遭到嚴(yán)重破壞，而且受物理、化學(xué)或生物等因子的影響使DNA質(zhì)量降低[27]，蓮蓉制品中還含有大量的糖分和油脂[28]，都是可能導(dǎo)致了普通PCR法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確率不高的因素。而實(shí)時(shí)熒光PCR法由于靈敏度高，能實(shí)時(shí)記錄擴(kuò)增情況，受干擾因素少，檢測(cè)準(zhǔn)確度高，可免去電泳，無(wú)需觸毒，操作更簡(jiǎn)便，也更快速、安全，因此更適合目前市場(chǎng)的檢測(cè)需求。

據(jù)相關(guān)報(bào)道[29-30]，目前國(guó)內(nèi)蓮蓉制品特別是蓮蓉月餅的餡料存在各種摻假現(xiàn)象，主要是在蓮蓉中摻入白蕓豆蓉，再加入蓮子香精制作出所謂的純蓮蓉餡料。在月餅國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)蓮蓉餡料有著明確的規(guī)定，只有蓮籽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%，才可稱(chēng)為純蓮蓉類(lèi)。從以上檢測(cè)結(jié)果驗(yàn)證了媒體的報(bào)道并非夸大其詞，蓮蓉?fù)郊賳?wèn)題普遍存在。本方法，能更精準(zhǔn)更快速的對(duì)蓮蓉?fù)郊龠M(jìn)行檢測(cè)，也可對(duì)有蓮蓉?fù)郊傩袨榈纳a(chǎn)企業(yè)起到震懾作用，對(duì)打擊以次充好、以劣充優(yōu)的銷(xiāo)售亂象起重要作用。能更好地規(guī)范市場(chǎng)次序，保障好消費(fèi)者權(quán)益和身體健康。

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A Real-Time PCR Assay for Rapid Detection of Kidney Bean Component in Lotus Seed Paste Product

SUN Liangguang1, HUANG Wenjing2,*
(Wuzhou Institutes Food and Drug Control, Wuzhou 543002, China)

Objective: This study aimed to establish a real-time PCR method for rapid detection of kidney bean components in Lotus seed paste product. Methods: Specific primers and probes were designed based on the highly conserved region of the pvsbe2 gene of Phaseolus coccineus L. Specificity was confi rmed by DNA amplification of lotus seeds and other starchrich plants. In addition, 1 ng/μL DNA of kidney bean was gradually diluted to determ ine its sensitivity. The DNA template of a mixture sample which contained 1% kidney bean and lotus seeds was 10-fold diluted to verify the weight sensitivity.And this method and PCR were applied to determ ine market samples for further validation. Results: This method had a high specificity which displayed no cross reaction w ith lotus seeds and other starch-rich plants. The sensitivity for detecting kidney bean DNA concentration and the proportion of kidney bean component were 1 pg/μL and 0.01%, respectively.The detection results indicated that positive amplification appeared in kidney bean present in lotus-seed-paste moon cake,which conformed to the food labels. Conclusions: The real-time fluorescent PCR method established in this study has the characteristics of high specificity and sensitivity and is suitable for fast detection of kidney bean component in lotus seed paste products.

Lotus seed paste product; kidney bean component; detection; real-time polymerase chain reaction

10.7506/spkx1002-6630-201722049

TS207.3

A

1002-6630（2017）22-0330-05

孫良廣, 黃文婧. 實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)快速檢測(cè)蓮蓉制品中蕓豆成分[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(22): 330-334. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722049. http://www.spkx.net.cn

SUN Liangguang, HU ANG Wenjing. A real-time PCR assay for rapid detection of kidney bean component in lotus seed paste product[J]. Food Science, 2017, 38(22): 330-334. (in Chinese w ith English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201722049. http://www.spkx.net.cn

2016-11-08

孫良廣（1985—），男，主管中藥師，學(xué)士，主要從事食品藥品安全檢驗(yàn)檢測(cè)研究。E-mail：sunliangguang＠163.com。

*通信作者：黃文婧（1984—），女，執(zhí)業(yè)藥師，學(xué)士，主要從事食品藥品安全檢驗(yàn)檢測(cè)研究。E-mail：47990584@qq.com