李維妮，張宇翔，魏建平，袁亞宏，韓曉江，岳田利*

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊陵 712100）

益生菌發(fā)酵蘋果汁工藝優(yōu)化及有機(jī)酸的變化

李維妮，張宇翔，魏建平，袁亞宏，韓曉江，岳田利*

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊陵 712100）

以紅富士蘋果為原料，進(jìn)行乳酸菌發(fā)酵蘋果汁工藝條件優(yōu)化并分析發(fā)酵期間蘋果汁有機(jī)酸的變化。選擇Lactobacillus paracasei 20241、Bifidobacterium animalis 6165、Streptococcus thermophilus 6063和Lactobacillus acidophilus 6005混合發(fā)酵蘋果汁，以活菌數(shù)和感官評(píng)分為主要指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，研究不同的菌種比例、接種量、發(fā)酵時(shí)間等對(duì)蘋果汁活菌數(shù)和感官評(píng)分的影響。結(jié)果表明，乳酸菌發(fā)酵蘋果汁的優(yōu)化工藝條件為菌種比例1∶1∶1∶1、接種量2%、發(fā)酵時(shí)間24 h、發(fā)酵溫度37 ℃，在此條件下得到的活菌數(shù)為1.985×108CFU/m L，感官評(píng)分為80.23 分。采用最佳工藝條件發(fā)酵蘋果汁，利用高效液相色譜法對(duì)發(fā)酵過(guò)程中蘋果汁有機(jī)酸的變化情況進(jìn)行分析，結(jié)果表明：經(jīng)過(guò)發(fā)酵后，蘋果酸和琥珀酸含量下降明顯（P＜0.05），而乳酸、奎寧酸、檸檬酸、酒石酸、丙酮酸和莽草酸含量均顯著提高（P＜0.05）。

乳酸菌；蘋果汁；發(fā)酵；工藝優(yōu)化；有機(jī)酸

乳酸菌是一類可發(fā)酵糖類產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌的統(tǒng)稱，在人體內(nèi)可幫助機(jī)體消化，是益生菌的重要組成部分。研究表明，食品中加入益生菌有益于健康，可提高免疫力，維持腸道微生態(tài)平衡和降低患癌風(fēng)險(xiǎn)[1]。果蔬中所含糖類、無(wú)機(jī)鹽、維生素等均易被人體吸收，是重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[2]。

蘋果汁富含多種營(yíng)養(yǎng)成分，其中，蘋果酸是最主要的有機(jī)酸，還有奎寧酸、莽草酸、檸檬酸和琥珀酸等[3]，是良好的生理堿性食品[4]。

目前，有許多國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)乳酸菌發(fā)酵果蔬汁進(jìn)行研究。在工藝優(yōu)化方面，崔莉等[5]利用腸膜明串珠菌和植物乳桿菌按2∶1的比例混合后發(fā)酵黃秋葵汁后活菌數(shù)可達(dá)108CFU/m L，優(yōu)化工藝條件為接種量5%、發(fā)酵溫度35 ℃和發(fā)酵時(shí)間72 h。張曉等[6]利用植物乳桿菌、短乳桿菌和魯氏酵母混合發(fā)酵芹菜汁，通過(guò)優(yōu)化試驗(yàn)得到最佳工藝條件為菌種比例2∶2∶1、接種量7%和發(fā)酵溫度30 ℃，此條件下乳酸菌活菌數(shù)可達(dá)1.78×108CFU/m L。王凱旋等[7]利用乳酸菌LAB-5發(fā)酵桑葚汁，以乳酸產(chǎn)量為響應(yīng)值，確定的最佳發(fā)酵工藝為發(fā)酵時(shí)間6.85 h、發(fā)酵溫度35 ℃和接種量3.13%，有效提升了乳酸產(chǎn)量。劉磊等[8]采用梯度濃度馴化法將保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌以1∶1的比例接入龍眼汁中，經(jīng)響應(yīng)面法得到最佳工藝條件為發(fā)酵時(shí)間12 h、發(fā)酵溫度45 ℃、接種量3%和脫脂奶粉添加量5%，有效提升了龍眼汁的酸度，并且使得其揮發(fā)性風(fēng)味植物發(fā)生顯著變化。在有機(jī)酸方面，Herrero等[9]研究2 種不同溫度下酵母菌和蘋果酸乳酸菌混合發(fā)酵蘋果汁，受到溫度的影響，蘋果酸在發(fā)酵過(guò)程中被完全代謝，且在蘋果酸下降結(jié)束后乳酸也開(kāi)始下降，而乙酸則大量生成。Leila等[10]將酵母菌和乳酸菌混合發(fā)酵蘋果酒，當(dāng)酵母衰亡后，乳酸菌活菌數(shù)達(dá)到最大，在酒精發(fā)酵階段蘋果酸被完全消耗，而乳酸發(fā)酵過(guò)程中一直有乳酸生成。

由于我國(guó)對(duì)果蔬的加工利用率低，造成了極大浪費(fèi)，而果蔬發(fā)酵飲料則為果蔬資源的加工利用提供了一條有效的解決途徑[11]。乳酸菌進(jìn)行蘋果酸-乳酸發(fā)酵，不僅賦予果蔬汁更好的發(fā)酵風(fēng)味，而且使果蔬汁具有能調(diào)節(jié)人體腸道微環(huán)境的功效，并提高礦質(zhì)元素的吸收利用，增強(qiáng)免疫力等[12-13]。相關(guān)研究表明，通過(guò)乳酸菌發(fā)酵果蔬汁可產(chǎn)生一些功能性物質(zhì)，如與抗氧化作用密切相關(guān)的多酚類化合物[14-15]、含量極低且不可缺少的維生素[16]等。目前，各種果蔬汁和果酒不斷涌現(xiàn)，果蔬發(fā)酵汁已由單一原料、單一發(fā)酵劑發(fā)展至現(xiàn)在的多種原料、多種復(fù)合發(fā)酵劑[17]，多菌協(xié)同發(fā)酵能夠賦予果蔬汁更優(yōu)的風(fēng)味和口感。但所選菌種數(shù)較少，范圍較窄，多為單菌發(fā)酵或雙菌發(fā)酵，且在國(guó)內(nèi)外，在乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中對(duì)有機(jī)酸進(jìn)行具體分析方面的報(bào)道很少。

本實(shí)驗(yàn)以紅富士蘋果為主要原料，利用副干酪乳桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌和嗜酸乳桿菌協(xié)同發(fā)酵蘋果汁，研究不同菌種比例、接種量和發(fā)酵時(shí)間對(duì)蘋果汁活菌數(shù)和感官評(píng)分的影響，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，并對(duì)蘋果汁中的有機(jī)酸進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。旨在研制出一種富含能夠調(diào)節(jié)人體腸道功能的乳酸菌蘋果汁，不僅拓寬了對(duì)乳酸菌的選擇，還優(yōu)化了發(fā)酵工藝條件并分析出有機(jī)酸的具體變化，為乳酸菌在發(fā)酵果蔬汁方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅富士蘋果（Malus pumila M ill.）購(gòu)于陜西楊凌，9月中下旬采摘，大小均一，無(wú)機(jī)械損傷，無(wú)病害或腐爛。

副干酪乳桿菌20241（Lactobacillus paracasei）、動(dòng)物雙歧桿菌6165（Bifidobacterium animalis）、嗜熱鏈球菌6063（Streptococcus thermophilus）、嗜酸乳桿菌6005（Lactobacillus acidophilus），保存于西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院食品發(fā)酵工程與食品安全實(shí)驗(yàn)室。

MRS肉湯培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品蘋果酸、乳酸、檸檬酸，莽草酸、奎寧酸、丙酮酸、琥珀酸、酒石酸（純度≥98%） 上海源葉生物科技有限公司；磷酸銨、磷酸（均為色譜純）美國(guó)Sigma-Aldrich公司；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

2000JP-1型離心果汁機(jī) 南通金橙機(jī)械有限公司；YXQ-LS-70A型立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HC-3018R型高速冷凍離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；YT-CJ-2ND型超凈工作臺(tái)北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司；HWS-80型智能恒溫恒濕箱 寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠；超純水機(jī) 上海優(yōu)普實(shí)業(yè)有限公司；LC-15C高效液相色譜儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 蘋果汁的制備

挑選→清洗→去核→切塊→榨汁→護(hù)色→酶解→抽濾→調(diào)酸→-20 ℃冷凍待用

1.3.2 蘋果汁的發(fā)酵

將保存于甘油管的4 株乳酸菌分別置于MRS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，于37 ℃無(wú)菌環(huán)境下靜置培養(yǎng)24 h。再分別接種于100 m L蘋果汁種子液中，于37 ℃靜置培養(yǎng)18 h，活菌數(shù)約達(dá)1×107CFU/m L，將副干酪乳桿菌20241、動(dòng)物雙歧桿菌6165、嗜熱鏈球菌6063和嗜酸乳桿菌6005 4株菌分別按照不同的配比方式，以不同的接種量接種于500 m L蘋果汁中，于37 ℃靜置發(fā)酵不同時(shí)間，發(fā)酵結(jié)束后置于-20 ℃冰箱下保存待用。

1.3.3 蘋果汁活菌數(shù)測(cè)定和感官評(píng)定

活菌數(shù)按傾注平板法計(jì)數(shù)[18]。為了評(píng)價(jià)不同的發(fā)酵方式對(duì)蘋果汁感官品質(zhì)的影響，由20 名專業(yè)的老師和學(xué)生組成感官評(píng)定小組，從色澤、體態(tài)、香氣和口感4 個(gè)方面對(duì)各個(gè)蘋果汁樣品進(jìn)行評(píng)分。評(píng)分細(xì)則如表1所示。

表1 感官評(píng)分細(xì)則Table 1 Criteria for sensory evaluation of fermented app le juice

1.3.4 乳酸菌發(fā)酵蘋果汁工藝條件的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.4.1 發(fā)酵溫度的確定

經(jīng)處理的蘋果汁，初始糖度為14.03 °Brix，pH值為5.85，將副干酪乳桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌按照1∶1∶1∶1的菌種比例接入蘋果汁中，接種量為3%，分別在31、33、35、37、39、41 ℃發(fā)酵26 h，比較各蘋果汁的活菌數(shù)和感官評(píng)分。

1.3.4.2 菌種比例的確定

經(jīng)處理的蘋果汁，初始糖度為14.03 °Brix，pH值為5.85，分別將副干酪乳桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌按照1∶2∶1∶2、2∶2∶1∶1、1∶1∶1∶1、1∶1∶2∶2、2∶1∶2∶1、1∶2∶2∶1的菌種比例接入蘋果汁中，接種量為3%，37 ℃發(fā)酵26 h，比較各蘋果汁的活菌數(shù)和感官評(píng)分。

1.3.4.3 接種量的確定

經(jīng)處理的蘋果汁，初始糖度為14.03 °Brix，pH值為5.85，將副干酪乳桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌按照1∶1∶1∶1的菌種比例接入蘋果汁中，接種量分別為1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%，37 ℃發(fā)酵26 h，比較各蘋果汁的活菌數(shù)和感官評(píng)分。

1.3.4.4 發(fā)酵時(shí)間的確定

經(jīng)處理的蘋果汁，初始糖度為14.03 °Brix，pH值為5.85，將副干酪乳桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌按照1∶1∶1∶1的菌種比例接入蘋果汁中，接種量為3%，在37 ℃分別發(fā)酵21、22、23、24、25、26、27、28、29、30 h，比較各蘋果汁的活菌數(shù)和感官評(píng)分。

1.3.5 乳酸菌發(fā)酵蘋果汁的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)分析結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用中心組合試驗(yàn)（center combination design，CCD）設(shè)計(jì)方法，選擇菌種比例、接種量和發(fā)酵時(shí)間這3個(gè)影響較大的因素，設(shè)計(jì)三因素五水平響應(yīng)面試驗(yàn)，以活菌數(shù)和感官評(píng)分為響應(yīng)值進(jìn)行優(yōu)化。兩個(gè)響應(yīng)值所占權(quán)重各為50%。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 CCD試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and their levels used for central com posite design

1.3.6 有機(jī)酸測(cè)定

參照Y E M engq i等[19]的方法并在此基礎(chǔ)上改進(jìn)。取1 m L發(fā)酵蘋果汁，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)行色譜分析。色譜條件：W aters xTerra M S C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相0.01 m o l/L(NH4)3PO4，用H3PO4調(diào)pH值至2.70；洗脫程序?yàn)榈榷认疵?；樣品過(guò)0.45 μm有機(jī)系濾膜；流速0.7 m L/m in；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，采用Origin 9.0軟件作圖，用SPSS 22.0軟件進(jìn)行方差顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果汁發(fā)酵條件的單因素試驗(yàn)

2.1.1 發(fā)酵溫度對(duì)蘋果汁活菌數(shù)及感官評(píng)分的影響

圖1 發(fā)酵溫度對(duì)活菌數(shù)和感官評(píng)分的影響Fig. 1 Effect of different tem perature on viable count and sensory evaluation

如圖1所示，當(dāng)發(fā)酵溫度較低時(shí)，乳酸菌生長(zhǎng)和繁殖速度較慢，活菌數(shù)隨著溫度的升高而顯著增加（P＜0.05）。當(dāng)溫度高于37 ℃時(shí)，蘋果汁的活菌數(shù)變化不明顯（P＞0.05）。在35～39 ℃時(shí)，感官評(píng)分差異不顯著（P＞0.05），而溫度過(guò)高對(duì)蘋果汁的風(fēng)味和口感也會(huì)有所影響。當(dāng)發(fā)酵溫度為37 ℃時(shí)，蘋果汁的活菌數(shù)為23.6×107CFU/m L，感官評(píng)分為82 分。綜合考慮選擇37 ℃為最佳溫度。

2.1.2 菌種比例對(duì)蘋果汁活菌數(shù)及感官評(píng)分的影響

如圖2所示，當(dāng)副干酪乳桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌比例為1∶2∶2∶1時(shí)蘋果汁的活菌數(shù)最多，為29.9×107CFU/m L，顯著高于其他組（P＜0.05）。當(dāng)菌種比例為1∶1∶1∶1時(shí)感官評(píng)分最高，為80 分。為進(jìn)一步檢驗(yàn)不同菌種比例對(duì)蘋果汁活菌數(shù)和感官評(píng)分的影響是否顯著，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果P值均小于0.01，不同菌種比例下的活菌數(shù)和感官評(píng)分差異極顯著。因此在該單因素試驗(yàn)中，綜合考慮后選擇副干酪乳桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌比例為1∶2∶2∶1為最佳比例，并確定1∶2∶2∶1、2∶1∶2∶1、1∶1∶1∶1、2∶2∶1∶1和1∶2∶1∶2的菌種比例作為下一步工藝優(yōu)化的5 個(gè)水平。

圖2 菌種比例對(duì)活菌數(shù)和感官評(píng)分的影響Fig. 2 Effect of ratio among probiotic strains on viable count and sensory evaluation

2.1.3 接種量對(duì)蘋果汁活菌數(shù)及感官評(píng)分的影響

圖3 接種量對(duì)活菌數(shù)和感官評(píng)分的影響Fig. 3 Effect of inoculum size on viab le count and sensory evaluation

如圖3所示，當(dāng)接種量在1%～3%時(shí)，活菌數(shù)隨接種量的增加呈明顯上升的趨勢(shì)（P＜0.05）。當(dāng)接種量為3%時(shí)，蘋果汁的活菌數(shù)為最高，達(dá)21.0×107CFU/m L，顯著高于其他組（P＜0.05）。當(dāng)接種量大于3%時(shí)，活菌數(shù)呈逐漸下降趨勢(shì)。從整體來(lái)看，感官評(píng)分隨著接種量的增大呈現(xiàn)出逐漸減少的趨勢(shì)。采用方差分析法對(duì)蘋果汁的活菌數(shù)和感官評(píng)分進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果接種量對(duì)活菌數(shù)和感官評(píng)分均極顯著（P＜0.01）?？紤]節(jié)約成本、簡(jiǎn)便操作等因素，選擇接種量為3%，并且選擇1%、2%、3%、4%和5%的接種量作為下一步工藝優(yōu)化的5 個(gè)水平。

2.1.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)蘋果汁活菌數(shù)及感官評(píng)分的影響

如圖4所示，發(fā)酵至21～26 h時(shí)，蘋果汁活菌數(shù)升高較快，并且在發(fā)酵26 h時(shí)達(dá)到最大值30.0×107CFU/m L，之后則呈下降趨勢(shì)，相對(duì)應(yīng)的感官評(píng)分也降低，可見(jiàn)發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)對(duì)蘋果汁的風(fēng)味和口感有所影響。為進(jìn)一步檢驗(yàn)發(fā)酵時(shí)間對(duì)蘋果汁活菌數(shù)和感官評(píng)分的影響是否顯著，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果表明發(fā)酵時(shí)間對(duì)兩者有極顯著影響（P＜0.01）。綜合考慮，選擇26 h為最佳發(fā)酵時(shí)間，并選擇22、24、26、28 h和30 h的發(fā)酵時(shí)間作為下一步工藝優(yōu)化的5 個(gè)水平。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)活菌數(shù)和感官評(píng)分的影響Fig. 4 Effect of fermentation time on viable count and sensory evaluation

2.2 CCD響應(yīng)面優(yōu)化

2.2.1 優(yōu)化結(jié)果和方差分析

利用Design-Expert軟件對(duì)表3中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析，得到活菌數(shù)（Y1）和感官評(píng)分（Y2）對(duì)自變量菌種比例（A）、接種量（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）的回歸方程分別為：Y1=15.41-3.45A-0.62B-1.06C+2.79AB+1.87AC+2.76BC-0.77A2-3.29B2-2.46C2。Y2=73.96+0.64A-0.47B-0.52C+3.00AB+0.93AC-1.30BC+1.59A2+0.034B2-0.21C2。

表3 CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Central com posite design w ith experimental results

由表4和表5可知，2 個(gè)模型中P值均小于0.01，說(shuō)明本試驗(yàn)所選用的二次多項(xiàng)模型差異極顯著。失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05）。模型決定系數(shù)R2（活菌數(shù)）值為0.992 2，R2（感官評(píng)分）值為0.991 0，說(shuō)明活菌數(shù)和感官評(píng)分的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值之間具有較好的擬合度，所以該模型擬合效果較好，可以用此模型分析和預(yù)測(cè)乳酸菌發(fā)酵蘋果汁的主發(fā)酵工藝。在響應(yīng)值為活菌數(shù)的模型中，A（菌種比例）、B（接種量）、C（發(fā)酵時(shí)間）及AB、AC、BC的交互作用及二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)蘋果汁活菌數(shù)的影響極顯著。在響應(yīng)值為感官評(píng)分的模型中，A（菌種比例）、B（接種量）、C（發(fā)酵時(shí)間）及AB、AC、BC的交互作用及A2對(duì)蘋果汁感官評(píng)分的影響極顯著，B2和C2對(duì)其影響則不顯著。

2.2.2 因素間交互作用分析

由圖5可知，根據(jù)等高線的形狀可以明顯地反映出試驗(yàn)因素之間交互作用顯著性的強(qiáng)弱，例如菌種比例、接種量、發(fā)酵時(shí)間及其交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。當(dāng)?shù)雀呔€的形狀為橢圓形或馬鞍形時(shí)，說(shuō)明其交互作用顯著；當(dāng)?shù)雀呔€的形狀為圓形時(shí)，說(shuō)明其交互作用不顯著[20]。在交互作用對(duì)蘋果汁的活菌數(shù)和感官評(píng)分影響中，菌種比例、接種量和發(fā)酵時(shí)間兩兩因素交互項(xiàng)均產(chǎn)生了顯著影響。

表4 活菌數(shù)的方差分析Tab le 4 Analysis of variance of viable count

表5 感官評(píng)分的方差分析Table 5 Analysis of variance of sensory evaluation

2.2.3 模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)該回歸方程求得優(yōu)化后的最佳工藝參數(shù)為副干酪乳桿菌∶動(dòng)物雙歧桿菌∶嗜熱鏈球菌∶嗜酸乳桿菌菌種比例1∶1∶1∶1、接種量2%、發(fā)酵時(shí)間24 h，此條件下發(fā)酵得到的蘋果汁活菌數(shù)預(yù)測(cè)值為21.44×107CFU/m L，感官評(píng)分為78.35分。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，該條件下發(fā)酵得到的蘋果汁的活菌數(shù)為19.85×107CFU/m L，與預(yù)測(cè)值相比誤差為7.4%，感官評(píng)分為80.23 分，與預(yù)測(cè)值相比誤差為2.4%，可見(jiàn)通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化方法得到的蘋果汁最佳工藝條件比較可靠。

2.3 最佳發(fā)酵條件下蘋果汁有機(jī)酸的動(dòng)態(tài)變化

蘋果汁富含多種有機(jī)酸，還可在發(fā)酵中產(chǎn)生，這些有機(jī)酸的種類和含量對(duì)蘋果汁發(fā)酵后的感官品質(zhì)有著重要的影響[21]。果汁中的有機(jī)酸不僅對(duì)果汁的感官特性、穩(wěn)定性、可接受性和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)上有重要影響[22-23]，還能避免或抑制許多引起果汁腐敗的潛在有害微生物的生長(zhǎng)[24]。采用上述所得最佳工藝條件對(duì)蘋果汁進(jìn)行發(fā)酵，并用高效液相色譜法監(jiān)測(cè)發(fā)酵過(guò)程中蘋果汁各有機(jī)酸的變化趨勢(shì)。在蘋果汁發(fā)酵過(guò)程中，共監(jiān)測(cè)了8 種常見(jiàn)有機(jī)酸的變化情況。

圖5 不同因素交互作用對(duì)蘋果汁活菌數(shù)和感官評(píng)分影響的響應(yīng)面圖Fig. 5 Response surface plots showing the interactive effects of different factors on viable count and sensory evaluation of app le juice

表6 發(fā)酵過(guò)程中各有機(jī)酸含量的變化Table 6 Changes in organic acids contents during fermentation

蘋果酸是蘋果汁中最重要且含量最高的一種有機(jī)酸，乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中，不但利用蘋果酸合成乳酸等多種物質(zhì)，而且利用其他物質(zhì)合成蘋果酸。如表6所示，蘋果汁中蘋果酸的初始質(zhì)量濃度為2 918.90 mg/L，發(fā)酵6 h后含量達(dá)到最大值，之后迅速下降，這可能是由于乳酸菌在進(jìn)行蘋果酸-乳酸發(fā)酵時(shí)分解了蘋果酸。發(fā)酵期間，乳酸菌進(jìn)行三羧酸循環(huán)，作為生物體三羧酸循環(huán)的中間體，蘋果酸參與多個(gè)不同的生化反應(yīng)，所以其含量處在動(dòng)態(tài)變化中。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，蘋果酸被分解為其他物質(zhì)而導(dǎo)致含量下降，發(fā)酵結(jié)束時(shí)的最終質(zhì)量濃度為1 574.36 mg/L，較發(fā)酵前含量顯著降低（P＜0.05），這與Herrero等[9]利用乳酸菌和酵母混合發(fā)酵所得蘋果汁中蘋果酸含量顯著下降的結(jié)果相吻合。乳酸也是蘋果汁中重要的有機(jī)酸，乳酸初始質(zhì)量濃度為61.26 mg/L，在發(fā)酵初期，乳酸含量變化不大，隨著乳酸菌的數(shù)量增多，在乳酸菌進(jìn)行蘋果酸-乳酸發(fā)酵過(guò)程中，蘋果酸向乳酸轉(zhuǎn)變，且蘋果汁中的葡萄糖經(jīng)糖酵解途徑降解成丙酮酸，后者在乳酸脫氫酶的作用下，直接被還原為乳酸，從而導(dǎo)致乳酸含量不斷升高。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，乳酸含量達(dá)到最高值1 679.3 mg/L，較發(fā)酵前顯著升高（P＜0.05），這與Ellendersen等[25]利用干酪乳桿菌發(fā)酵蘋果汁過(guò)程中乳酸的變化趨勢(shì)相似。

奎寧酸是蘋果汁中含量較高的高等植物特有的脂環(huán)族有機(jī)酸，在蘋果汁中的含量?jī)H次于蘋果酸。如表6所示，發(fā)酵開(kāi)始時(shí)，奎寧酸的質(zhì)量濃度為203.90 mg/L，發(fā)酵前12 h變化大，之后奎寧酸含量迅速上升，至發(fā)酵結(jié)束質(zhì)量濃度達(dá)最大值445.47 mg/L，較發(fā)酵前含量顯著升高（P＜0.05）。檸檬酸是三羧酸循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物，含量處于動(dòng)態(tài)變化中，在蘋果汁中的初始含量為24.62 mg/L，含量上升至12 h時(shí)達(dá)最大值，之后又逐漸下降，可能是由于蘋果酸-乳酸發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌將檸檬酸分解成丙酮酸和乙酸，也有轉(zhuǎn)化為乳酸的現(xiàn)象，其代謝中間產(chǎn)物還能產(chǎn)生乙偶姻和雙乙酰等風(fēng)味化合物[26]，這些物質(zhì)對(duì)蘋果汁的風(fēng)味有較大影響。發(fā)酵結(jié)束時(shí)質(zhì)量濃度為28.73 mg/L，較發(fā)酵前顯著升高（P＜0.05），而鄭欣等[27]利用多種乳酸菌混合發(fā)酵荔枝汁后檸檬酸沒(méi)有顯著變化（P＞0.05）。

莽草酸代謝存在于大量高等植物和微生物中，以莽草酸作為中間體，在生物體內(nèi)合成分解，生成其他物質(zhì)[28]。莽草酸在蘋果汁中含量較低，如表6所示，發(fā)酵開(kāi)始時(shí)其含量為6.80 mg/L，發(fā)酵過(guò)程的變化趨勢(shì)較平穩(wěn)，這與Herrero等[9]研究的蘋果酸乳酸菌協(xié)同酵母發(fā)酵蘋果汁中奎寧酸的變化趨勢(shì)相似。發(fā)酵結(jié)束時(shí)含量為7.01 mg/L，較發(fā)酵前含量顯著升高（P＜0.05）。

琥珀酸在蘋果酸-乳酸途徑中，可通過(guò)部分丙酮酸氧化為乙酸和H+，H+再將延胡索酸還原得到琥珀酸。另一方面，也可通過(guò)酒石酸分解而生成，但生成量較少[26]。Dudley等[29]研究表明，乳酸菌能夠利用三羧酸循環(huán)產(chǎn)生的檸檬酸合成琥珀酸，同時(shí)還會(huì)產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸，直接影響果汁的酸味。如表6所示，琥珀酸在蘋果汁中的初始含量為99.49 mg/L，發(fā)酵14 h后一直處在較低水平，結(jié)束時(shí)質(zhì)量濃度為1.04 mg/L，較發(fā)酵前含量顯著降低（P＜0.05）。酒石酸在蘋果汁中的初始質(zhì)量濃度為89.58 mg/L。發(fā)酵6 h時(shí)達(dá)最高值，之后呈下降趨勢(shì)，酒石酸能夠被乳酸菌降解生成乳酸和乙酸，使揮發(fā)酸含量增加[30]。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，酒石酸含量為101.45 mg/L，較發(fā)酵前顯著升高（P＜0.05）。丙酮酸是糖酵解、蘋果酸-乳酸發(fā)酵、三羧酸循環(huán)等生物體基本代謝途徑的中間產(chǎn)物。如表6所示，初始質(zhì)量濃度為7.32 mg/L，發(fā)酵6 h后達(dá)到最大值，之后呈下降趨勢(shì)，這可能是由于在厭氧條件下，所有的乳酸菌都能代謝丙酮酸而產(chǎn)生乙酸、乳酸和雙乙酰等產(chǎn)物[26]。發(fā)酵結(jié)束時(shí)質(zhì)量濃度為23.74 mg/L，較發(fā)酵前含量顯著升高（P＜0.05）。

蘋果汁發(fā)酵過(guò)程中，蘋果酸、酒石酸和丙酮酸均在發(fā)酵6 h時(shí)達(dá)到最大值，檸檬酸則是在發(fā)酵12 h時(shí)達(dá)到最大值；此外，乳酸和奎寧酸均一直處于上升趨勢(shì)，在發(fā)酵結(jié)束時(shí)達(dá)到最大值；而莽草酸的質(zhì)量濃度波動(dòng)不大，沒(méi)有明顯的最大值，琥珀酸則處于下降趨勢(shì)，發(fā)酵結(jié)束質(zhì)量濃度較低。除了蘋果酸和琥珀酸經(jīng)過(guò)發(fā)酵后含量顯著下降（P＜0.05）外，其他有機(jī)酸的含量均顯著升高（P＜0.05）。

3 結(jié) 論

利用副干酪乳桿菌20241、動(dòng)物雙歧桿菌6165、嗜熱鏈球菌6063和嗜酸乳桿菌6005 4 株菌發(fā)酵紅富士蘋果汁，通過(guò)單因素試驗(yàn)，選擇37 ℃為發(fā)酵溫度。在蘋果汁發(fā)酵過(guò)程中，菌種比例、接種量、發(fā)酵時(shí)間對(duì)蘋果汁活菌數(shù)和感官評(píng)分均有顯著影響。通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化所得蘋果汁發(fā)酵的最佳工藝條件為副干酪乳桿菌20241、動(dòng)物雙歧桿菌6165、嗜熱鏈球菌6063和嗜酸乳桿菌6005菌種比例1∶1∶1∶1、接種量2%、發(fā)酵時(shí)間24 h，在此條件下得到的活菌數(shù)為19.85×107CFU/m L，感官評(píng)分為80.23分。采用高效液相色譜法檢測(cè)最佳發(fā)酵條件下蘋果汁有機(jī)酸的變化情況，其中蘋果酸和琥珀酸經(jīng)發(fā)酵后含量下降明顯（P＜0.05），而乳酸、奎寧酸、檸檬酸、酒石酸、丙酮酸和莽草酸含量均顯著提高（P＜0.05）。

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Optimization of Fermentation of Apple Juice by Probiotics and Organic Acids Evolution during Fermentation

LI Weini, ZHANG Yuxiang, WEI Jianping, YUAN Yahong, HAN Xiaojiang, YUE Tianli*
(College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)

The fermentation of Fuji apple juice by lactic acid bacteria was optimized and changes in organic acids during

fermentation were analyzed. Lactobacillus paracasei 20241, Bifidobacterium animalis 6165, Streptococcus thermophilus 6063 and Lactobacillus acidophilus 6005 were used as mixed cultures in the fermentation of apple juice. The optimization of culture composition, inoculum size and fermentation time was performed using one-factor-at-a-time method and response surface methodology. Viable cell count and sensory score were used as response variables. The results showed that the optimal fermentation conditions were as follows: ratio of four probiotic strains, 1:1:1:1; inoculum size, 2%; fermentation time, 24 h; and temperature, 37 ℃. Under these conditions, viable cell count was 1.985 × 108CFU/m L and sensory score was 80.23 points. Malic acid and succinic acid contents decreased significantly after fermentation (P ＜ 0.05), while lactic acid, quinic acid, citric acid, tartaric acid, pyruvic acid and shikim ic acid contents significantly increased (P ＜ 0.05) as demonstrated by HPLC analysis.

lactic acid bacteria; apple juice; fermentation; process optim ization; organic acids

10.7506/spkx1002-6630-201722013

TS255.4

A

1002-6630（2017）22-0080-08

李維妮, 張宇翔, 魏建平, 等. 益生菌發(fā)酵蘋果汁工藝優(yōu)化及有機(jī)酸的變化[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(22): 80-87.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722013. http://www.spkx.net.cn

LI Weini, ZHANG Yuxiang, WEI Jianping, et al. Optimization of fermentation of apple juice by probiotics and organic acids evolution during fermentation[J]. Food Science, 2017, 38(22): 80-87. (in Chinese w ith English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722013. http://www.spkx.net.cn

2017-03-10

“十三五”國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃重點(diǎn)專項(xiàng)（2017YFD0400702）

李維妮（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：236099531@qq.com

*通信作者：岳田利（1965—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)及食品安全控制。E-mail：yuetl@nwafu.edu.cn