曾玉坤 劉玲 丁紅珂 杜麗 張彥

(廣東省婦幼保健院 醫(yī)學(xué)遺傳中心，廣東 廣州 511400)

針對孕期耳聾基因突變攜帶者配偶行相應(yīng)基因測序在降低出生缺陷中的意義研究

曾玉坤 劉玲 丁紅珂 杜麗 張彥

(廣東省婦幼保健院 醫(yī)學(xué)遺傳中心，廣東 廣州 511400)

目的探討針對孕期耳聾基因突變攜帶者配偶行相應(yīng)基因測序在降低出生缺陷中的意義。方法采用遺傳性耳聾基因芯片檢測試劑盒對廣東地區(qū)2003例聽力正常且無耳聾家族史的孕婦進行GJB2、SLC26A4、GJB3和mtDNA12SrRNA這4個耳聾相關(guān)基因的9個致聾突變位點檢測。對檢出的耳聾基因攜帶者丈夫進行耳聾基因芯片檢測和相應(yīng)基因測序，雙方檢測發(fā)現(xiàn)為同一耳聾基因突變攜帶者的孕婦在知情同意的前提下再對其胎兒進行耳聾基因產(chǎn)前診斷。結(jié)果檢出孕婦攜帶者103例，檢出率5.14%。這103例攜帶者的丈夫中檢出同樣為相應(yīng)基因的攜帶者6例， 其中SLC26A4基因雜合突變與GJB2基因雜合突變攜帶者各3例。6對夫婦在充分告知和知情同意的前提下通過羊水穿刺進行胎兒耳聾基因產(chǎn)前診斷，1例胎兒確診為GJB2基因c.109 G>A雜合突變攜帶者，1例為GJB2基因c.235delC純合突變患者，1例為SLC26A4基因IVS7-2A>G/c.2086 C>T雙雜合突變患者，還有1例為GJB2基因c.511_512 ins AACG雜合攜帶者，另有2例為正?；蛐?。結(jié)論在聽力正常孕婦中使用基因芯片進行耳聾基因篩查，檢出耳聾基因攜帶者，然后對其丈夫進行耳聾基因篩查和相應(yīng)基因序列分析，針對雙方為同一基因治病突變攜帶者的夫婦進行相應(yīng)基因的產(chǎn)前基因診斷，可以有效降低先天性耳聾患兒的出生率。

耳聾基因；攜帶者；篩查；產(chǎn)前診斷

耳聾是嚴重影響人類生活質(zhì)量的致殘性疾病，也是最常見的出生缺陷之一，60% 以上的新生兒耳聾是由遺傳因素所導(dǎo)致，遺傳性耳聾包括綜合征型耳聾和非綜合征型耳聾，其中非綜合征型耳聾約占70%[1]，分子診斷技術(shù)的迅速發(fā)展使得其目前已成為檢測遺傳性耳聾的主要方法。針對中國人群的研究及流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明，中國人群的主要遺傳性耳聾致病基因包括GJB2、GJB3、SLC26A4和mtDNA12SrRNA，其中GJB2基因突變所致的遺傳性耳聾占散發(fā)患者的30%～40%[2.3]，在耳聾患者中最為常見。由于耳聾患者大多以散發(fā)的形式在人群中隨機出現(xiàn)，因而每個家庭都存在生育耳聾患兒的可能性。熱點突變基因的篩查可以實現(xiàn)遺傳性耳聾的早防早治，是目前家庭中預(yù)防耳聾患兒出生最為經(jīng)濟有效的方法，尤其對有明確遺傳學(xué)病因和遺傳風(fēng)險的耳聾家庭，選擇產(chǎn)前診斷技術(shù)可有效避免遺傳性耳聾兒的出生。

1 資料與方法

1.1 基本資料 受檢對象來自2014 年12月至 2015 年12月間在本院醫(yī)學(xué)遺傳中心門診就診、聽力正常、本人及配偶身體健康、無已知的其他疾病、且沒有耳聾家族史及不良生育史的孕婦2003例。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 抽取受檢者外周血3ml，枸櫞酸鈉抗凝。試劑盒提取 DNA(廈門致善)，取 2μl 用Thermo NANO DROP 2000 進行定量和純度檢測，保證每一樣本 DNA 濃度大于100 ng /μl，純度 OD260/280介于1.7～2.0之間。

1.2.2 基因芯片檢測 應(yīng)用耳聾基因芯片(北京博奧生物有限公司)進行遺傳性耳聾基因突變熱點篩查，按試劑盒說明書進行操作。該芯片可檢測中國人中常見的 4 個耳聾基因中的 9 個熱點突變，包括GJB2(35 del G、176 del 16、235 del C、299 del AT)、GJB3 538C>T、SLC26A4(2168A>G、IVS7-2 A>G) 和 線 粒 體 12S rRNA(1494 C>T、1555 A>G)。

1.2.3 隨訪 對于芯片檢測結(jié)果為突變攜帶者的孕婦，電話隨訪并建議其丈夫進行基因芯片檢測及相應(yīng)致聾基因測序(上海生工生物工程有限公司)。

1.2.4 產(chǎn)前檢測 對夫妻雙方為同一致聾基因突變攜帶者的情況，經(jīng)夫妻雙方知情同意簽字，在B超定位引導(dǎo)下行羊膜腔穿刺術(shù)，抽取羊水8～10m用于接種培養(yǎng)，定期觀察收獲羊水培養(yǎng)后的細胞使用邁納德公司DNA提取試劑盒提取細胞DNA，經(jīng)3500XL 全自動基因分析儀排除母血污染后，對胎兒進行基因芯片檢測及相應(yīng)致聾基因測序(上海生工生物工程有限公司)。

2 結(jié)果

2.1 在受檢的2003例孕婦標本中，共檢103例耳聾基因攜帶者，檢出率 5.14%，其中GJB2 雜合突變型 68例，占 3.39% ；SLC26A4 雜合突變型 23 例，占 1.15% ；GJB3 雜合突變型 3例，占 0.15% ；線粒體12S rRNA雜合突變型3例，占0.15%，GJB2(235delC)/SLC26A4(IVS7-2A>G 雙雜合突變型6 例，占 0.3%。

2.2 對103例突變攜帶者進行電話隨訪，通過宣教及知情告知，這103位孕婦的丈夫均接受了耳聾基因芯片及相應(yīng)基因的測序檢測，最終查出6 例與其配偶發(fā)生相同基因突變的攜帶者。相關(guān)結(jié)果如表1。

表1 6例耳聾基因突變攜帶者檢測結(jié)果

2.3 產(chǎn)前診斷 對這兩對致聾突變攜帶者進行遺傳指導(dǎo)，告知先天性聾兒發(fā)生的幾率和風(fēng)險(GJB2 基因突變致聾屬于常染色隱性遺傳，生育患兒的風(fēng)險為25%)，6對夫妻均接受了產(chǎn)前診斷。相應(yīng)胎兒檢測結(jié)果如下表2。

表2 6例耳聾基因突變攜帶者胎兒檢測結(jié)果

3 討論

耳聾是影響我國出生人口素質(zhì)的重要問題之一，目前臨床上對遺傳性耳聾缺乏有效的治療手段。部分耳聾患兒雖能借助輔助聽力器械改善聽力狀況，但絕大多數(shù)因未能及時診治而影響生活與學(xué)習(xí)，給整個家庭帶來沉重負擔(dān)。我國2006年第二次全國殘疾人抽樣調(diào)查也顯示，聽力殘疾居各類殘疾之首，占全國殘疾人的31%[4]。目前的研究數(shù)據(jù)表明，遺傳性耳聾基因攜帶率達5%[5]，既往僅針對聽力障礙人員的聽力篩查和干預(yù)不足以有效阻斷遺傳性耳聾在整個人群中的傳遞和發(fā)病。此外耳聾患者的發(fā)生更多呈散發(fā)的特點，絕大多數(shù)夫婦在生育聾兒前未有家族史，容易忽視進行耳聾基因的常規(guī)篩查。為避免生育聾兒給家庭造成的沉重負擔(dān)，夫婦在生育前進行耳聾基因篩查意義顯著。然而導(dǎo)致耳聾的病因較為復(fù)雜，致聾基因較多，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的致聾基因已有幾十種，全覆蓋進行檢查費用高昂，時效相對較長，成本較高，目前無法大規(guī)模推廣。因而針對中國人群最常見的熱點突變進行篩查是降低耳聾出生缺陷的最行之有效和經(jīng)濟實用的做法。

中國人群的耳聾研究及流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明，目前發(fā)現(xiàn)的主要遺傳性耳聾致病基因包括GJB2、GJB3、SLC26A4和mtDNA12SrRNA等4種。GJB2的突變在中國人群攜帶率高達3.65%[6.7]；SLC26A4基因又稱PDS基因，編碼的蛋白質(zhì)Pendrin主要由疏水性氨基酸組成，屬于離子轉(zhuǎn)運體家族，多項研究表明，大前庭水管綜合征和Pendred 綜合征(前庭水管擴大或伴內(nèi)耳畸形、神經(jīng)性聾和甲狀腺腫)與SLC26A4基因突變有密切的關(guān)系，我國大部分地區(qū)正常人群中，SLC26A4的突變攜帶率為1.85% 左右[8.9]。由于GJB2與SLC26A4基因突變導(dǎo)致的耳聾均為常染色體隱性遺傳，正常人群中這兩種基因突變高攜帶率直接導(dǎo)致GJB2與SLC26A4耳聾的高發(fā)病率。

本研究采用遺傳性耳聾基因芯片檢測試劑盒對來我院就診的2003例聽力正常且無耳聾家族史的孕婦進行GJB2、SLC26A4、GJB3和mtDNA12SrRNA這4個耳聾相關(guān)基因的9個致聾突變位點進行檢測；對檢出的攜帶者其丈夫進行耳聾基因芯片檢測和相應(yīng)基因測序，最終查出6例突變攜帶者，根據(jù)遺傳模式，6個胎兒的發(fā)病風(fēng)險均為25%，通過產(chǎn)前檢測，6個胎兒的耳聾基因檢測結(jié)果分別提示為2例正?；蛐?、2例攜帶者和2例耳聾基因型。攜帶者通過遺傳咨詢建議胎兒將來婚配對象進行相應(yīng)耳聾基因的檢測，避免其后代出現(xiàn)耳聾患兒；妊娠有耳聾基因型的這兩對夫妻則通過遺傳咨詢和知情告知，最終選擇了終止妊娠，不僅避免了耳聾患兒的出生，同時也最大程度減輕了該家庭的痛苦和經(jīng)濟負擔(dān)。

本研究通過對聽力正常且無耳聾家族史孕婦進行耳聾突變基因篩查，再對攜帶者的丈夫進行芯片檢測和相應(yīng)基因測序，對于為同一突變攜帶者的夫妻結(jié)合產(chǎn)前診斷，對胎兒進行基因突變遺傳情況檢測，有效減少遺傳性聾兒的出生，同時對于檢出的突變攜帶者則進行成年后的配偶選擇和優(yōu)生優(yōu)育指導(dǎo)。但對于正常基因型的受檢胎兒需要說明的是，目前的臨床分子診斷亦僅限于GJB2、GJB3 和SLC26A4、線粒體基因等這幾個少數(shù)常見基因，并不能檢測所有的致聾基因，其他已知的耳聾基因綜合考慮檢出率和經(jīng)濟成本目前都無法納入臨床常規(guī)篩查(檢測)范圍[10]，因此，對檢測結(jié)果為野生型者，遺傳咨詢醫(yī)生應(yīng)謹慎解釋相應(yīng)結(jié)果，避免因為知情告知不到位而導(dǎo)致可能存在的隱患。不過隨著人們對遺傳性耳聾認識的深入，芯片及分子診斷技術(shù)在拓展檢測范圍，降低耳聾出生缺陷上將發(fā)揮越來越重要的作用。

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ObjectiveTo study the significance of the gene sequencing for the husbands of the gene mutation carriers of deafness during pregnancy in the decrease of birth defects.MethodGenomic DNA extracted from 2003 normal hearing pregnant women of Guangdong area were subjected to screen for hot spot mutations in theGJB2、GJB3、SLC26A4andmtDNA12SrRNAgene. Array screen and related gene sequence were done for the mutation carriers’ husbands. If couple were the same gene mutation carriers，prenatal diagnosis was used.ResultsA total of 103 pregnant women(5.14%)were found gene mutation carriers. There were 6 husbands have the same gene mutation with their wife. Prenatal diagnosis confirmed two gene mutation fetus patients, two mutation carriers and two normal fetuses.ConclusionsIt’s an effective method to decrease the born of deaf children through deafness genes mutation carriers screening of pregnant women.

deafness gene；carrier；screen；prenatal diagnosis

R714.53

A

10.13470/j.cnki.cjpd.2017.02.005

2016-08-28)

編輯：宋文穎