趙會穎，楊永剛，張建平，李貴琴，錢玉中，李倩倩

(1.河北省石家莊市第一醫(yī)院老年病科，河北 石家莊 050011；2.河北省石家莊市第一醫(yī)院中醫(yī)科，河北 石家莊 050011)

·論著·

無創(chuàng)性延遲肢體缺血預(yù)適應(yīng)對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

趙會穎1，楊永剛1，張建平1，李貴琴1，錢玉中2，李倩倩1

(1.河北省石家莊市第一醫(yī)院老年病科，河北 石家莊 050011；2.河北省石家莊市第一醫(yī)院中醫(yī)科，河北 石家莊 050011)

目的觀察無創(chuàng)性肢體缺血預(yù)適應(yīng)(noninvasive delayed limbischemic preconditioning，NDLIP)對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。方法將30只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組、缺血再灌注組和NDLIP組各10只。NDLIP組大鼠給予左側(cè)后肢缺血5 min、再灌注5 min，每天1次，連續(xù)操作3 d，然后再制作缺血模型；假手術(shù)組大鼠給予同樣的麻醉和操作，但不進(jìn)行頸總動脈的閉塞；假手術(shù)組和缺血再灌注組不進(jìn)行NDLIP操作。檢測各組大鼠海馬超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量和Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)水平。結(jié)果缺血再灌注組和NDLIP組大鼠海馬MDA含量明顯高于假手術(shù)組，SOD含量明顯低于假手術(shù)組，Bax、Caspase-3表達(dá)水平明顯高于假手術(shù)組，Bcl-2表達(dá)水平明顯低于假手術(shù)組；NDLIP組大鼠海馬MDA含量明顯低于缺血再灌注組，SOD含量明顯高于缺血再灌注組，Bax、Caspase-3表達(dá)水平明顯低于缺血再灌注組，Bcl-2 的表達(dá)水平明顯高于缺血再灌注組。結(jié)論NDLIP能顯著減少腦缺血再灌注損傷后凋亡的發(fā)生和氧化應(yīng)激損傷，對腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。

腦缺血；再灌注損傷；肢體遠(yuǎn)端缺血預(yù)適應(yīng)；大鼠

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.11.002

腦缺血正逐漸成為世界范圍內(nèi)發(fā)病率和病死率的主要原因，主要病理生理表現(xiàn)是急性腦缺血-再灌注損傷[1]。許多關(guān)于中風(fēng)的藥理學(xué)神經(jīng)保護(hù)策略的臨床試驗(yàn)均令人失望，目前缺血性腦血管病的治療方法是腦保護(hù)治療和超早期靜脈溶栓治療[2]。肢體缺血預(yù)適應(yīng)是指肢體短暫缺血后，肢體自身的肌肉或遠(yuǎn)隔部位的組織器官可以耐受較長時間的缺血損傷。由于肢體缺血預(yù)適應(yīng)可通過對機(jī)體相對不太重要的器官進(jìn)行預(yù)適應(yīng)，從而達(dá)到保護(hù)機(jī)體重要器官的作用(如心臟、腦等)，因此其具備很好的臨床應(yīng)用價值，已經(jīng)逐漸成為目前研究的熱點(diǎn)。筆者采用無創(chuàng)性肢體缺血預(yù)適應(yīng)(noninvasive delayed limbischemic preconditioning，NDLIP)的方法對大鼠缺血再灌注模型進(jìn)行研究，旨在探討其對大鼠腦再灌注損傷的保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材 料 與 方 法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及實(shí)驗(yàn)試劑 健康SPF級雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量240～280 g，由河北省實(shí)驗(yàn)動物中心提供。動物飼養(yǎng)室室溫調(diào)節(jié)在22～25 ℃，給予動物12 h光照和12 h黑暗環(huán)境。主要試劑：超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)檢測試劑盒(美國abcam公司)，β-actin抗體、Bax、Bcl-2及Caspase-3抗體(美國abcam公司)。大鼠分為假手術(shù)組、缺血再灌注組和NDLIP組各10只。

1.2 模型制作 NDLIP組大鼠麻醉后，以無創(chuàng)血壓儀自制套管置于大鼠左后肢根部，加壓，以脈搏消失、皮膚發(fā)紺、肢體遠(yuǎn)端皮溫下降為缺血的依據(jù)；減壓，以肢體遠(yuǎn)端皮溫上升、脈搏出現(xiàn)、皮膚紅潤為再灌注的依據(jù)；給予左側(cè)后肢缺血5 min、再灌注5 min，每天1次，連續(xù)操作3 d，然后再制作缺血模型。假手術(shù)組大鼠給予同樣的麻醉和操作，但不進(jìn)行頸總動脈的閉塞。假手術(shù)組和缺血再灌注組不進(jìn)行NDLIP操作。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 試劑盒檢測SOD和 MDA含量 各組取5只大鼠缺血再灌注24 h后斷頭取腦，分離大鼠海馬組織，應(yīng)用SOD和MDA試劑盒檢測各組大鼠海馬SOD和MDA的表達(dá)情況。

1.3.2 Western blot檢測大鼠海馬Bax、Bcl-2及 Caspase-3的表達(dá) 各組取5只大鼠麻醉后快速斷頭取腦，分離海馬組織、提取蛋白。海馬組織使用RIPA組織裂解液進(jìn)行裂解(冰上30 min)，4 ℃條件下，應(yīng)用離心機(jī)(16 000 r/min)將勻漿進(jìn)行離心30 min，提取上清液，采用BCA法測定蛋白濃度。將樣本加入每個泳道，應(yīng)用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，室溫下進(jìn)行電泳(3 h)，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上(4 ℃、電壓100 V)。放入5%脫脂牛奶的緩沖液中處理1 h。與下列抗體孵育(4 ℃ 過夜)：抗Bax抗體(1∶1 000)、抗Bcl-2抗體(1∶1 000)、抗Caspase-3抗體(1∶2 000)、β-actin抗體 (1∶2 000)。洗膜，室溫暗室環(huán)境下與二抗孵育結(jié)合1 h。然后應(yīng)用紅外成像系統(tǒng)掃摸。每個目的蛋白的光密度值/β-actin 光密度值得出的比值為各目的蛋白相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料比較分別采用單因素方差分析和q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠海馬MDA和SOD含量比較 缺血再灌注組和NDLIP組大鼠海馬MDA含量明顯高于假手術(shù)組，SOD含量明顯低于假手術(shù)組(P<0.05)；NDLIP組大鼠海馬MDA 的含量明顯低于缺血再灌注組，SOD含量明顯高于缺血再灌注組(P<0.05)。見表1。

組別 MDA(nmol/mg)SOD(U/mg)假手術(shù)組 0．74±0．199．02±1．08缺血再灌注組1．55±0．28?3．54±0．76?NDLIP組 1．13±0．16?#6．85±0．69?#F 97．357124．531P 0．0000．000

*P<0.05與假手術(shù)組比較 #P<0.05 與缺血再灌注組比較(q檢驗(yàn))

2.2 各組大鼠海馬Bax、Bcl-2及Caspase-3表達(dá)水平比較 缺血再灌注組和NDLIP組大鼠海馬Bax、Caspase-3表達(dá)水平明顯高于假手術(shù)組，Bcl-2表達(dá)水平明顯低于假手術(shù)組(P<0.05)；NDLIP組大鼠海馬Bax、Caspase-3表達(dá)水平明顯低于缺血再灌注組，Bcl-2表達(dá)水平明顯高于缺血再灌注組(P<0.05)。見表2，圖1。

組別 BaxBcl?2Caspase?3假手術(shù)組 0．187±0．0260．703±0．1330．096±0．015缺血再灌注組0．648±0．157?0．246±0．039?0．462±0．068?NDLIP組 0．425±0．161?#0．534±0．064?#0．219±0．035?#F 89．573107．249156．372P 0．0000．0000．000

*P<0.05與假手術(shù)組比較 #P<0.05與缺血再灌注組比較(q檢驗(yàn))

圖1各組大鼠海馬Bax、Bcl-2及Caspase-3蛋白表達(dá)
Figure1TheproteinexpressionofBax,Bcl-2andCaspase-3indifferentgroups

3 討 論

腦灌注全面或局灶性減少導(dǎo)致的腦缺血損傷是全世界范圍內(nèi)殘疾和死亡發(fā)生的最常見和重要的原因。這些患者可能會遭受各種各樣的難題，如運(yùn)動障礙、感覺障礙、記憶障礙以及缺血性損傷導(dǎo)致的許多情緒和社會問題[3]。到目前為止，大多數(shù)癥狀并不能得到有效治療。目前，急性缺血性腦損傷患者的神經(jīng)保護(hù)或腦修復(fù)治療并不能滿足臨床需求。藥物治療的效果也不盡如人意。因此，大腦保護(hù)機(jī)體自身免受有害刺激并從損傷中修復(fù)的內(nèi)源性機(jī)制正在成為研究的熱點(diǎn)。

缺血預(yù)適應(yīng)為誘導(dǎo)內(nèi)源性的神經(jīng)保護(hù)作用提供了一種有效的方式。缺血預(yù)適應(yīng)的概念最早是由Murry等[4]于1986年在缺血性心臟病模型中描述的。除了對心肌的保護(hù)作用，在肝臟、腎臟和大腦中，同樣可以發(fā)現(xiàn)缺血預(yù)適應(yīng)發(fā)揮對抗急性缺血再灌注損傷的現(xiàn)象[5-6]。通過動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)反復(fù)的、短暫的、非致命性的缺血再灌注可使機(jī)體產(chǎn)生一系列內(nèi)源性物質(zhì)，可減小梗死面積，有效對抗持續(xù)致命性的腦缺血和再灌注損傷，被認(rèn)為是一種強(qiáng)有力的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制。但是，到目前為止，缺血預(yù)適應(yīng)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制仍然不是十分明確。

凋亡是一種程序化的死亡方式，以一系列明確的細(xì)胞形態(tài)和生物學(xué)改變?yōu)樘卣?。大腦缺血后通過多種死亡信號通路激活凋亡的發(fā)生，尤其是Caspase的激活[7-8]。Caspases或半胱氨酸依賴性、天冬氨酸調(diào)控性蛋白酶，是一組在細(xì)胞凋亡中起重要作用的半胱氨酸蛋白酶[9]。研究者將Caspases定義為“劊子手”蛋白質(zhì)，說明了其重要地位。有2種類型的凋亡相關(guān)Caspases酶：觸發(fā)劑(頂端)Caspases和效應(yīng)器(劊子手)Caspases酶。Caspase-9屬于觸發(fā)劑Caspases，而Caspase-3和Caspase-6屬于效應(yīng)器Caspases酶。Caspase-3可以促使DNA出現(xiàn)片段化，進(jìn)而激活內(nèi)切酶并分裂核DNA，最終引起細(xì)胞死亡，在線粒體調(diào)節(jié)的凋亡過程中起到了至關(guān)重要的作用。因此，Caspase-3促進(jìn)凋亡發(fā)生[10]，通過對Caspase-3的抑制作用能有效抑制凋亡的進(jìn)程。Bcl-2家族的蛋白質(zhì)位于線粒體外膜，調(diào)控著下游Caspases的激活，故在線粒體調(diào)控的凋亡途徑中扮演著關(guān)鍵的細(xì)胞內(nèi)關(guān)卡作用[11-13]。Bcl-2家族主要包括Bcl-2和Bax，它們在功能上是截然相反的：Bcl-2是重要的凋亡抑制蛋白，Bax促進(jìn)凋亡的發(fā)生[14-15]。本研究采用免疫印記方法檢測Bax、Bcl-2及Caspase-3的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NDLIP下調(diào)海馬Caspase-3和Bax的表達(dá)，但上調(diào)了海馬Bcl-2的表達(dá)。表明NDLIP具有明顯的抗凋亡特性。

MDA和SOD是與氧化應(yīng)激密切相關(guān)的指標(biāo)。MDA是氧化應(yīng)激時脂質(zhì)出現(xiàn)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，MDA與氧化應(yīng)激的程度呈正相關(guān)[16]，可視為與氧化應(yīng)激損傷密切相關(guān)的代表性標(biāo)志物。氧化應(yīng)激損傷會損害抗氧化防御系統(tǒng)，影響抗氧化物酶的表達(dá)[17]。大腦缺血再灌注損傷與氧化應(yīng)激損傷密切相關(guān)[18-20]。缺血再灌注后腦組織產(chǎn)生大量的氧自由基，影響細(xì)胞膜中磷脂的多聚不飽和脂肪酸，引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，產(chǎn)生大量的脂質(zhì)過氧化物和自由基，導(dǎo)致腦組織細(xì)胞功能和(或)結(jié)構(gòu)的變化。本研究結(jié)果顯示，缺血再灌注組大鼠海馬MDA含量明顯高于假手術(shù)組，SOD的活性明顯降低于假手術(shù)組，NDLIP組大鼠海馬MDA的含量明顯低于缺血再灌注組，SOD含量明顯高于缺血再灌注組。表明NDLIP能夠有效地減少缺血再灌注后大鼠腦中氧自由基的損傷，增強(qiáng)大腦的抗氧化應(yīng)激能力，這可能是NDLIP對大腦產(chǎn)生保護(hù)作用的生物學(xué)機(jī)制之一。

總之，缺血或缺氧預(yù)適應(yīng)的調(diào)節(jié)機(jī)制是一個復(fù)雜的細(xì)胞調(diào)控過程，包括多重細(xì)胞信號通路，從而增強(qiáng)機(jī)體對缺血、缺氧的耐受性。到目前為止，有許多機(jī)制可能與缺血損傷的調(diào)節(jié)作用有關(guān)，尤其是在冠心病方面。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種關(guān)鍵分子和信號傳導(dǎo)途徑，包括GABA受體、誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶、腺苷、熱休克蛋白等?？梢钥隙ǖ氖?，腦缺血耐受可以保護(hù)神經(jīng)元，還能有效維持大腦功能。但是，關(guān)于這種類型的調(diào)節(jié)或交叉耐受性之間的關(guān)系，所涉及的研究很少。今后將進(jìn)一步研究各種調(diào)節(jié)方法的共同機(jī)制，從而能夠從藥理學(xué)上開發(fā)其保護(hù)作用。

[1] Mingsan Miao,Lihua Cao,Ruiqi Li,et al. Protective effect of chlorogenic acid on the focal cerebral ischemia reperfusion rat models[J]. Saudi Pharm J，2017,25(4):556-563.

[2] Catanese L,Tarsia J,Fisher M. Acute ischemic stroke therapy overview[J]. Circ Res，2017,120(3):541-558.

[3] Vasquez-Vivar J,Shi Z,Luo K,et al. Tetrahydrobiopterin in antenatal brain hypoxia-ischemia-induced motor impairments and cerebral palsy[J]. Redox Biol，2017,13:594-599.

[4] Murry CE,Jennings RB,Reimer KA. Preconditioning with ischemia:a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium[J]. Circulation，1986,74(5):1124-1136.

[5] Theodoraki K,Karmaniolou I,Tympa A,et al. Beyond preconditioning:postconditioning as an alternative technique in the prevention of liver ischemia-reperfusion injury[J]. Oxid Med Cell Longev，2016，2016:8235921.

[6] Zhang Y,Zhang X,Chi D,et al. Remote ischemic preconditioning for prevention of acute kidney injury in patients undergoing on-pump cardiac surgery:a systematic review and Meta-analysis[J]. Medicine(Baltimore)，2016,95(37):e3465.

[7] Nagy Z,Nardai S. Cerebral ischemia/repefusion injury:From bench space to bedside[J]. Brain Res Bull，2017,134:30-37.

[8] García de la Cadena S,Massieu L. Caspases and their role in inflammation and ischemic neuronal death. Focus on caspase-12[J]. Apoptosis，2016,21(7):763-777.

[9] Nakajima YI,Kuranaga E. Caspase-dependent non-apoptotic processes in development[J]. Cell Death Differ，2017,24(8):1422-1430.

[10] Chang CT,Korivi M,Huang HC,et al. Inhibition of ROS production,autophagy or apoptosis signaling reversed the anticancer properties of Antrodia salmonea in triple-negative breast cancer(MDA-MB-231) cells[J]. Food Chem Toxicol,2017,103:1-17.

[11] Lindsay J,Esposti MD,Gilmore AP. Bcl-2 proteins and mitochondria--specificity in membrane targeting for death[J]. Biochim Biophys Acta，2011,1813(4):532-539.

[12] Zheng JH,Viacava Follis A,Kriwacki RW,et al. Discoveries and controversies in BCL-2 protein-mediated apoptosis[J]. FEBS J，2016,283(14):2690-2700.

[13] Birkinshaw RW,Czabotar PE. The BCL-2 family of proteins and mitochondrial outer membrane permeabilisation[J]. Semin Cell Dev Biol，2017[Epub ahead of print].

[14] Garner TP,Lopez A,Reyna DE,et al.Progress in targeting the BCL-2 family of proteins[J]. Curr Opin Chem Biol，2017,39:133-142.

[15] Brown LM,Hanna DT,Khaw SL,et al. Dysregulation of BCL-2 family proteins by leukemia fusion genes[J]. J Biol Chem，2017,292(35):14325-14333.

[16] Liu H,Zhao M,Yang S,et al. (2R,3S)-Pinobanksin-3-cinnamate improves cognition and reduces oxidative stress in rats with vascular dementia[J]. J Nat Med,2015,69(3):358-365.

[17] Ghorbanzadeh V,Mohammadi M,Mohaddes G,et al. Protective effect of crocin and voluntary exercise against oxidative stress in the heart of high-fat diet-induced type 2 diabetic rats[J]. Physiol Int,2016,103(4):459-468.

[18] Su J,Liu J,Yan XY,et al. Cytoprotective effect of the UCP2-SIRT3 signaling pathway by decreasing mitochondrial oxidative stress on cerebral ischemia-reperfusion injury[J]. Int J Mol Sci,2017,18(7):E1599.

[19] Han JY,Li Q,Ma ZZ,et al. Effects and mechanisms of compound Chinese medicine and major ingredients on microcirculatory dysfunction and organ injury induced by ischemia/reperfusion[J]. Pharmacol Ther,2017,177:146-173.

[20] Cai X,Wang X,Li J,et al. Protective effect of glycyrrhizin on myocardial ischemia/reperfusion injury-induced oxidative stress,inducible nitric oxide synthase and inflammatory reactions through high-mobility group box 1 and mitogen-activated protein kinase expression[J]. Exp Ther Med,2017,14(2):1219-1226.

Theprotectiveeffectofnoninvasivedelayedlimbischemicpreconditioningoncerebralischemiareperfusioninjuryinrats

ZHAO Hui-ying1, YANG Yong-gang1, ZHANG Jian-ping1, LI Gui-qin1, QIAN Yu-zhong2, LI Qian-qian1

(1.DepartmentofGeriatricsandGerontology,theFirstHospitalofShijiazhuangCity,HebeiProvince，Shijiazhuang050011,China; 2.DepartmentofTraditionalChineseMedicine,theFirstHospitalofShijiazhuangCity,HebeiProvince，Shijiazhuang050011,China)

]ObjectiveTo study the protective effect of noninvasive delayed limb ischemia preconditioning(NDLIP) on cerebral ischemia reperfusion injury in rats.MethodsThirty healthy male SD rats randomly divided into 3 groups, Sham-operated group, ischemic-reperfusion group and NDLIP group(n=10/group). Rats in NDLIP group were subjected to 5 minutes ischemia/5 minutes reperfusion on the left hind limb once a day for 3 consecutive days, then all rats were subjected to cerebral ischemia reperfusion injury. The Sham-operated group gave the same anesthesia and operation, but did not carry out the occlusion of the common carotid artery. The sham-operated group and ischemic-reperfusion group were not performed NDLIP operation. The expression of superoxide dismutase(SOD) and malondialdehyde(MDA) was detected by the kit. The protein expression of Bax, Bcl-2 and Caspase-3 were detected by Western blotting.ResultsCompared with the rats in the Sham-operation group, the contents of the hippocampal MDA, Bax and Casaspe-3 were significantly higher in the ischemic-reperfusion group. Compared with the rats in the ischemic-reperfusion group, the contents of the hippocampal MDA, Bax and Casaspe-3 were significantly decreased in the NDLIP group. Compared with the rats in the Sham-operation group, the contents of the hippocampal SOD and Bcl-2 were significantly decreased in the ischemic-reperfusion group. Compared with the rats in the ischemic-reperfusion group, the contents of the hippocampal SOD and Bcl-2 were significantly increased in the NDLIP group.ConclusionNDLIP could significantly reduce the occurrence of apoptosis and oxidative stress damage after cerebral ischemia reperfusion injury, it has protective effect on cerebral ischemia reperfusion injury.

brain ischemia; reperfusion injury； limb ischemia preconditioning; rats

2017-09-19；

2017-09-30

河北省科技計(jì)劃項(xiàng)目(15277785D)

趙會穎(1964-)，女，天津人，河北省石家莊市第一醫(yī)院主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事老年病診治研究。

R743.31

A

1007-3205(2017)11-1244-04

(本文編輯：趙麗潔)