鄭坤杰，武 革，耿建林，吳美芬，方 爍

(1.哈勵遜國際和平醫(yī)院內分泌科，河北 衡水 053000；2.廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院內分泌科，廣東 湛江 524001)

不同降糖藥物對2型糖尿病大鼠胰島β細胞凋亡及再生作用的影響

鄭坤杰1，武 革2*，耿建林1，吳美芬2，方 爍2

(1.哈勵遜國際和平醫(yī)院內分泌科，河北 衡水 053000；2.廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院內分泌科，廣東 湛江 524001)

目的觀察不同降糖藥物對2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)大鼠胰島β細胞凋亡與再生作用的影響。方法將SD大鼠隨機分為正常對照組、T2DM未治療組、利拉魯肽組、西格列汀組、羅格列酮組各20只。正常對照組給予普通飼料，其余各組給予高脂飼料喂養(yǎng)8周后以鏈脲佐菌素30 mg/kg腹腔注射，成模后分別給予上述三藥治療4周。其余2組給予等量生理鹽水皮下注射。于治療前后分別取大鼠血清，以蘇木精-伊紅染色觀察胰島細胞組織學改變，以原位末端標記法檢測胰島β細胞凋亡，以實時熒光定量逆轉錄-聚合酶鏈反應法檢測胰島細胞胰腺十二指腸同源盒-1(pancreatic duodenal homeobox-1，PDX-1)基因的表達。結果利拉魯肽組、羅格列酮組及西格列汀組治療后空腹血糖較T2DM組及治療前均明顯降低(P<0.05)。胰島結構及胰島細胞數(shù)量均明顯好于未治療組，胰島β細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。結論利拉魯肽、羅格列酮及西格列汀均可改善T2DM大鼠血糖，利拉魯肽對減少體質量優(yōu)于西格列汀及羅格列酮，3種藥物均可增加胰島β細胞數(shù)量、減少β細胞凋亡，其機制可能與增加胰島β細胞PDX-1基因的表達有關，以利拉魯肽作用更優(yōu)。

糖尿病,2型；細胞凋亡；大鼠

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.11.005

在2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)的藥物治療中，除良好的血糖控制，減少胰島β細胞凋亡、延緩β細胞衰竭，是T2DM治療面臨的困惑和挑戰(zhàn)。與傳統(tǒng)的格列酮類增敏劑對β細胞功能改善作用相比，新型腸促胰素類藥物對胰島β細胞凋亡及再生作用是否更具優(yōu)勢？本研究通過建立T2DM大鼠模型，觀察利拉魯肽、羅格列酮及西格列汀對T2DM大鼠血糖及胰腺β細胞凋亡、再生作用的影響，并探討其對胰島β細胞增殖與再生的作用的可能機制。

1 材 料 與 方 法

1.1 實驗動物 選取60只健康雄性SD大鼠(SPF級)，體質量為180～220 g, 購自廣東醫(yī)學院實驗動物中心，許可證號：SCXK(粵)2008-0008。

1.2 主要試劑及儀器 STZ購自Sigma公司，原位胰島細胞胰腺十二指腸同源盒-1(pancreatic duodenal homeobox-1，PDX-1)購自Roche公司，Recombinant DNase Ⅰ(RNase-free)購自日本TAKARA公司，Real-time PCR 試劑盒購自日本TOYOBO公司，反轉錄試劑盒購自美國Promega公司，利拉魯肽購自諾和諾德公司，西格列汀購自默沙東公司，羅格列酮購自重慶太極集團，血糖儀及血糖檢測試紙條購自德國羅氏公司。

1.3 動物模型的建立、分組及給藥 雄性SD大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，按隨機數(shù)字表法分為正常對照組、糖尿病未治療組、利拉魯肽組、西格列汀組、羅格列酮組各20只。正常對照組給予普通飼料喂養(yǎng)，其余各組給予高脂飼料喂養(yǎng)8周。實驗組大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素30 mg/kg，正常對照組注射同等體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。72 h后測隨機尾靜脈血糖。以2次隨機血糖≥16.7 mmol/L為造模成模，利拉魯肽組給予利拉魯肽200 μg/kg皮下注射、2次/d，西格列汀組給予西格列汀100 mg/kg灌胃、1次/d，羅格列酮組給予羅格列酮4 mg/kg灌胃、1次/d，共4周。正常對照組和未治療組組給予相同體積生理鹽水皮下注射。

1.4 檢測指標及方法

1.4.1 血糖、體質量測定 藥物治療前和藥物治療后監(jiān)測小鼠的體質量和血糖。

1.4.2 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色觀察胰島細胞組織學改變 將固定于10%甲醛中的胰島脫水后常規(guī)石蠟包埋，切片。將切片二甲苯脫蠟、梯度乙醇化，伊紅染色，蘇木精復染，梯度脫水，二甲苯透明，中性樹脂膠封片。光鏡下觀察，進行病理學分析。

1.4.3 TUNEL檢測胰島細胞凋亡 按試劑盒說明操作。結果判斷：凋亡細胞核著染深棕色,同時對照連續(xù)切片中胰島素染色陽性的細胞定為凋亡的β細胞。每個視野中β細胞的凋亡率=每個視野中β細胞的凋亡數(shù)÷該視野中β細胞的總數(shù)×100%,每張切片隨機選擇3個視野，分別計算凋亡率后取平均值作為該樣本胰島β細胞的凋亡率。

1.4.4 Real-Time RT-PCR法檢測胰腺組織PDX-1 mRNA的表達 Trizol 一步法提取總RNA。取2 μg mRNA逆轉錄為cDNA，進行PCR擴增(反應條件：95 ℃ 5 min、95 ℃ 15 s、62 ℃ 30 s，40個循環(huán)，62 ℃ 30 s收集熒光信號)；融解曲線分析：溫度60～95 ℃。PDX-1 mRNA的引物由南京金斯瑞科技有限公司合成，上游引物5′-GCGAGATGCTGGCAGACC TCT-3′，下游引物5′-GGCAGACCTGGCGGTTCACAT- 3′,片段長度94 bp;以18 sRNA為內參，上游引物5′-GAATTCCCAGTAAGTGCGGGTCATA- 3′，下游引物5′-CGAGGGCCTCACTAAACCATC-3′，片段長度108 bp;PCR反應條件：95 ℃ 5 min、95 ℃ 15 s、62 ℃ 30 s，40個循環(huán)，62 ℃ 30 s收集熒光信號；融解曲線分析：溫度60～95 ℃。DNA擴增儀自動分析并計算結果。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料比較分別采用配對t檢驗、F檢驗及SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠體質量及血糖情況 治療后的糖尿病未治療組、西格列汀組及羅格列酮組體質量較治療前增加，與正常對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；利拉魯肽組體質量與正常對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；利拉魯肽組體質量低于糖尿病未治療組、西格列汀組及羅格列酮組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。治療前糖尿病未治療組、利拉魯肽組、西格列汀組及羅格列酮組血糖高于正常對照組(P<0.05)；治療后利拉魯肽組、西格列汀組及羅格列酮組血糖明顯降低，且均低于糖尿病未治療組(P<0.05)；利拉魯肽組血糖低于西格列汀組及羅格列酮組(P<0.05)；西格列汀組血糖與羅格列酮組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

組別體質量(g)治療前治療后血糖(mmol/L)治療前治療后正常對照組369．66±27．71407．40±19．245．13±0．645．32±0．79糖尿病未治療組403．37±14．96?425．9±15．01?a14．17±0．72?16．81±2．05?a利拉魯肽組405．55±23．67?402．9±17．52#△☆14．40±0．94?8．99±1．61?#△☆a西格列汀組400．92±16．57?421．24±23．25?a14．48±0．95?10．50±1．63?#a羅格列酮組400．19±15．63?427．73±22．79?a14．18±0．87?11．10±1．65?#aF4．9113．786197．24861．316P0．0020．0090．0000．000

*P<0.05與正常對照組比較 #P<0.05與糖尿病未治療組比較 △P<0.05與羅格列酮組比較 ☆P<0.05與西格列汀組比較(SNKq檢驗) aP<0.05與同組治療前比較(配對t檢驗)

2.2 各組大鼠胰腺組織HE染色 正常對照組：胰島呈圓形或卵圓形，分布均勻，形狀規(guī)則、界限清楚，胰島細胞數(shù)量多。糖尿病未治療組：胰島體積變小，分布彌散，部分胰島排列、形狀不規(guī)則，結構不清，胰島細胞數(shù)量減少，部分可見細胞核固縮。利拉魯肽組、西格列汀組和羅格列酮組：胰島形狀偶可見不規(guī)則，界限稍模糊，胰島細胞數(shù)量較糖尿病未治療組增多，而3組間差異不明顯。見圖1。

2.3 各組大鼠胰島β細胞凋亡率 與正常對照組比較，實驗組胰島β細胞凋亡率均明顯增高(P<0.05)；與糖尿病未治療組比較，利拉魯肽組、西格列汀組及羅格列酮組凋亡率均降低(P<0.05)；利拉魯肽組凋亡率低于西格列汀組和羅格列酮組(P<0.05)；西格列汀組凋亡率與羅格列酮組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2，圖2。

組別凋亡率正常對照組9．12±1．20糖尿病未治療組41．43±3．24?利拉魯肽組19．53±1．52?#△☆西格列汀組21．89±2．18?#羅格列酮組22．04±1．88?# F306．030 P0．000

*P<0.05與正常對照組比較 #P<0.05與糖尿病未治療組比較 △P<0.05與羅格列酮組比較 ☆P<0.05與西格列汀組比較(SNK-q檢驗)

2.4 各組大鼠胰腺組織PDX-1 mRNA的表達 與正常對照組比較，實驗組PDX-1 mRNA的表達量均明顯降低(P<0.05)；與糖尿病未治療組比較，利拉魯肽組、西格列汀組和羅格列酮組PDX-1 mRNA的表達量明顯增高，作用強度依次為利拉魯肽組>西格列汀組>羅格列酮組(P<0.05)。見表3。

組別 PDX?1mRNA正常對照組組 4．44±0．15糖尿病未治療組1．06±0．07?利拉魯肽組 3．09±0．08?#△☆西格列汀組 2．88±0．13?#△羅格列酮組 2．22±0．10?#F 1082．755P 0．000

*P<0.05與正常對照組比較 #P<0.05與糖尿病未治療組比較 △P<0.05與羅格列酮組比較 ☆P<0.05與西格列汀組比較(SNK-q檢驗)

圖2 各組大鼠胰島細胞凋亡情況(×400)A．正常對照組；B．糖尿病未治療組；C．利拉魯肽組；D．西格列汀組；E．羅格列酮組Figure2 Apoptosisrateofβ?cellineachgroupmice(×400)

3 討 論

人類PDX-1在出生及成年后呈特異性表達于90%的β細胞和少量的(10%)δ細胞。近年來，由于PDX-1基因在胰島素分泌過程中不可缺少，PDX-1在胰腺發(fā)育、分化、再生及胰島素分泌過程中的作用受到關注[1-3]。因此，越來越多的研究致力于利用PDX-1在β細胞分化發(fā)育中的關鍵作用，將胚胎干細胞、成體肝細胞或胰腺導管上皮細胞等非胰島素分泌細胞誘導分化成為具有分泌胰島素功能的細胞[4]。白立國等[5]發(fā)現(xiàn)PDX-1基因可促進人脂肪間充質干細胞分化為胰島樣細胞。但長期高血糖、脂代謝紊亂可以損傷PDX-1基因,使PDX-l表達下調,使胰島素的分泌減少，導致β細胞功能逐漸衰退,進而加重糖脂代謝紊亂。本研究結果顯示，糖尿病未治療組大鼠空腹血糖較正常對照組明顯增高，PDX-1 mRNA表達下降,胰腺組織HE染色顯示胰島細胞數(shù)量減少。表明糖毒性對T2DM大鼠胰島β細胞具有損傷作用，導致胰島β細胞數(shù)量減少，而T2DM大鼠胰腺PDX-1表達的減少，可能正是T2DM大鼠胰島β細胞功能減弱的重要原因。

研究表明，利拉魯肽及其類似物能夠通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍組織中的信號通路減緩胃腸道排空，抑制食欲，或改變飲食偏嗜，減輕體質量。本研究利拉魯肽治療后大鼠體質量較糖尿病未治療組、西格列汀組及羅格列酮組均明顯降低。吳嘉鳴等[6]亦發(fā)現(xiàn)利拉魯肽可明顯減輕2型糖尿病患者體質量指數(shù)，而西格列汀治療前后大鼠體質量無明顯變化。這與郭云飛等[7]研究結果顯示DPP-4抑制劑總體上不增加體質量一致。

本研究利拉魯肽、西格列汀及羅格列酮治療后空腹血糖均較T2DM組明顯降低(P<0.05)，而利拉魯肽較西格列汀、羅格列酮對空腹血糖下降的作用更為明顯，西格列汀組空腹血糖與羅格列酮組差異無統(tǒng)計學意義。正如Yang等[8]的研究表明，高脂飲食聯(lián)合脂聯(lián)素基因敲除誘導INS抵抗小鼠模型，給予利拉魯肽干預，可明顯改善糖代謝及INS敏感性。還有研究表明，DPP-4抑制劑西格列汀可以通過提高GLP-1水平，降低胰高血糖素，降低肝臟及腸道內載TG脂蛋白的水平來影響TG水平以及改善血糖[9]。

本實驗結果還顯示，給予利拉魯肽、西格列汀及羅格列酮治療后，胰島β細胞凋亡率均明顯降低(P<0.05),胰島β細胞數(shù)量增多，胰島β細胞PDX-1 mRNA表達量均增高。表明這三類藥物均可促進胰島β細胞的再生，西格列汀與羅格列酮的差異并不顯著，而利拉魯肽更優(yōu)一籌；而對于胰島β細胞PDX-1基因的表達，利拉魯肽亦更較西格列汀、羅格列酮顯著。有文獻報道，GLP-1類似物Exendin-4誘導的胰島素分泌細胞和胰島細胞在形態(tài)學上類似，在脂肪間充質干細胞的培養(yǎng)液中加入Exendin-4，PDX-1及胰島素基因的表達明顯增多，胰島素陽性細胞的比例增加了4倍，胰島素分泌量亦增加了2.5倍[10]。說明Exendin-4可通過增加PDX-1基因的表達來促進脂肪間充質干細胞向胰島素分泌細胞轉化。研究顯示長期利拉魯肽治療可增加ZDF大鼠胰島β細胞數(shù)量，促進胰島素合成及分泌，并可減少α細胞數(shù)量[11]。此外，大量的研究均表明，利拉魯肽可以通過影響自噬保護高血脂及高血糖誘導的胰島β細胞凋亡，改善胰島β細胞功能[12-13]。研究還發(fā)現(xiàn)，DPP-4抑制劑可增加β細胞分化和增殖，增強胰島體系結構重塑并保持胰島功能[14]。羅格列酮是過氧化物酶增殖物活化受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ)的高親和性配體，研究發(fā)現(xiàn)噻唑烷二酮類藥物可通過激活PPARγ上調游離脂肪酸受體G蛋白偶聯(lián)受體40(G-protein-coupled transmembrane receptor 40,GPR40)和GLUT2的表達，而GPR40活化可增加胰島β細胞基因PDX-1和叉頭框A2(forkhead box A2,FoxA2)的表達水平[15]。

綜上所述，利拉魯肽、西格列汀及羅格列酮均參與及調控了PDX-1基因的表達，促進了胰島β細胞增殖，使胰島β細胞凋亡減少。在降低T2DM大鼠空腹血糖、減輕體質量、增加胰島β細胞PDX-1 mRNA表達方面，利拉魯肽更優(yōu)于西格列汀及羅格列酮。

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Effectsofdifferenthypoglycemicagentsonapoptosisandregenerationofpancreaticbetacellsintype2diabeticrats

ZHENG Kun-jie1，WU Ge2*，GENG Jian-lin1，WU Mei-fen2，F(xiàn)ANG Shuo2

(1.DepartmentofEndocrinology，HarrisonInternationalPeaceHospitalofHengshuiCity，HebeiProvince,Hengshui053000，China； 2.DepartmentofEndocrinology，AffiliatedHospitalofGuangdongMedicalUniversity，Zhanjiang524001，China)

ObjectiveTo observe the role of different drugs on proliferation and regeneration of islet beta cells in type 2 diabetes mellitus(T2DM) rats.MethodsSprague-Dawley rats were randomly divided into normal control group, T2DM group,liraglutide group, sitagliptin group and rosiglitazone group，20 in each group．Normal control group was given normal diet and the other experimental groups were given high fat diet. After eight weeks，the high fat diet group was intraperitoneally injected with streptozotocin 30 mg/kg，and the liraglutide group, the sitagliptin group and the rosiglitazone group were treated for 4 successive weeks. The other groups were treated with normal saline by subcutaneous injection. The blood sample was collected before and after 4 weeks of treatment. Hematoxylin-eosin staining was used to observe the islet cell histology change. TdT-mediated dUTP nick end labeling was used to detect apoptosis of islet cells. Real-time fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain reaction was used to detect the expression of pancreatic duodenal homeobox-1(PDX-1) gene in rat pancreatic islet cells.ResultsAfter treatment, compared with the T2DM group and that before treatmemt, the level of fasting blood glucose in the liraglutide group,sitagliptin group and rosiglitazone group was distinctly lower(P<0.05), the structure and the number of islets were significantly better, the level of apoptosis rate was lower(P<0.05).ConclusionLiraglutide, sitagliptin and rosiglitazone could significantly improve the glucose. The effect of liraglutide on decreasing the body weight was better than that of rosiglitazone and Sitagliptin. Liraglutide, sitagliptin and rosiglitazone could significantly increse the number of pancreatic islet beta cells and decrease the islet cell apoptosis rate, the effect may be associated with an increased expression of PDX-1 gene, the effect of liraglutide was better than that of rosiglitazone and Sitagliptin.

diabetes mellitus, type 2; apoptosis； rats

·論著·

2016-10-11；

2016-10-23

廣東省科技計劃項目(2011B031800231)

鄭坤杰(1986-)女，河北衡水人，哈勵遜國際和平醫(yī)院住院醫(yī)師，醫(yī)學碩士，從事內分泌疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail:wuge427427@126.com

R587.1

A

1007-3205(2017)11-1260-05

(本文編輯：劉斯靜)