白芨中天然化合物的酶解法提取

吳威+趙天明+張振+張學(xué)俊+李雄

摘要：對白芨中的天然化合物進(jìn)行酶解法提取，為其開發(fā)利用提供技術(shù)參考。以純水、70%乙醇提取為對照，采用酸性蛋白酶、果膠酶、纖維素酶對白芨塊莖進(jìn)行相繼酶解，并對各提取物中的成分進(jìn)行HPLC分析。酶解法與水提法、醇提法提取的白芨塊莖中物質(zhì)種類及含量存在明顯差異。酶解法是比水提法和醇提法更為有效的白芨天然產(chǎn)物提取方法，所得提取的化學(xué)成分種類多，提取效率高。

關(guān)鍵詞：白芨；天然化合物；酶解；HPLC；化學(xué)成分

中圖分類號： R284.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2017）17-0175-04

別稱白及，為蘭科白芨屬多年生草本植物[1]，其化學(xué)成分主要是聯(lián)芐類（bibenzyls）、菲類（phenanthrenes）及其衍生物，如丁香樹脂酚、β-谷甾醇、沒食子酸等。此外，還有少量的揮發(fā)油、黏液質(zhì)、白芨甘露聚糖（bletilla mannan）以及淀粉、葡萄糖等[2-4]。白芨具有收斂止血、消腫生肌、抗菌消炎、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理功效，臨床上廣泛用于治療出血、瘡瘍腫毒、皮膚皸裂、潰瘍、燙灼傷等病，療效顯著[5-10]。另外，白芨中含有豐富的白芨多糖膠，在食品中可作為增稠劑；在化妝品等行業(yè)也有較好的應(yīng)用[11-13]。

白芨天然產(chǎn)物的傳統(tǒng)提取方法有水提取、有機(jī)溶劑提取法等，但有研究表明，純水提取的物質(zhì)相對有限，高溫操作會引起熱敏性有效成分的大量分解；有機(jī)溶劑提取物中殘余溶劑不易除去，且成本相對較高[13]。然而，酶解法有其他傳統(tǒng)方法達(dá)不到的優(yōu)點(diǎn)，如反應(yīng)條件溫和，不破壞目標(biāo)天然產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，保持了其活性和藥效；有效地破壞植物組織和細(xì)胞，有利于胞內(nèi)外大量天然產(chǎn)物的溶出，提取效率高；原料無須粉碎，利于提取液過濾除雜和減少有效成分的損失等。目前尚未見到酶解法提取白芨的研究報(bào)道，本研究采用酸性蛋白酶、果膠酶和纖維素酶相繼對白芨塊莖中的天然活性成分進(jìn)行酶解提取，為中藥白芨的進(jìn)一步開發(fā)及應(yīng)用提供技術(shù)參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

白芨，由貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供；酸性蛋白酶（50 000 U/g）、果膠酶（50 000 U/g）、纖維素酶（50 000 U/g），均購自張家港市金源生物化工有限公司；食品添加劑檸檬酸和檸檬酸鈉，均購自濰坊英軒實(shí)業(yè)有限公司；無水乙醇（分析純99.7%），購自天津市富宇精細(xì)化工有限公司；99.9%色譜純乙腈，購自美國Tedia公司；色譜純異丙醇，購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀，購自安捷倫公司；Eclipse Plus C18（3.5 μm，3.0 mm×100 mm），購自安捷倫公司；BSA224S電子分析天平，購自常州萬泰天平儀器有限公司；UH-5300紫外可見分光光度計(jì)，購自天美（中國）科學(xué)儀器有限公司；SHA-C水浴恒溫振蕩器，購自常州澳華儀器有限公司；RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，購自上海越眾儀器設(shè)備有限公司；TGL 16M 凱特離心機(jī)，購自鹽城市凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；SB-120D超聲波清洗機(jī)，購自寧波新藝超聲波設(shè)備有限公司；DZ-2BCII真空干燥箱，購自天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1白芨處理取干燥的白芨塊莖，壓成厚度為0.1～02 cm的裂制薄片，干燥環(huán)境遮光保存，待用。

1.3.2蛋白酶提取在4個(gè)編號為1、2、3、4的 1 000 mL 三角瓶中分別加入50 g白芨。將2 000 mL pH值為3.2的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液分4次與6 g酸性蛋白酶于500 mL燒杯中混合，4次洗脫后收集的酶解液合并，平均倒入4個(gè)三角瓶中，搖勻后置于54 ℃水浴搖床上同時(shí)同條件進(jìn)行振蕩，酶解終止時(shí)間分別為2、4、6、12 h。按時(shí)分別取出，抽濾后分別在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（60 ℃）上濃縮至15～20 mL，加入無水乙醇至終體積為50 mL并對應(yīng)編號，趁熱劇烈振蕩混合充分后靜置過夜，取上清液離心進(jìn)行高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測分析，醇沉沉淀 45 ℃ 下進(jìn)行真空干燥，并計(jì)算提取率。

1.3.3果膠酶提取待酸性蛋白酶提取完全后分別收集各時(shí)段三角瓶中所有白芨殘余固體物繼續(xù)進(jìn)行果膠酶酶解。將2 000 mL pH值為3.6的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液分4次與6 g果膠酶于500 mL燒杯中混合，4次洗脫后收集的酶解液合并，平均倒入4個(gè)三角瓶中與白芨殘余物混勻，置于 50 ℃ 水浴搖床上同時(shí)進(jìn)行振蕩，酶解時(shí)間及后續(xù)操作同“1.3.2”節(jié)。

1.3.4纖維素酶提取待果膠酶提取完全后分別收集濾紙上的殘?jiān)c瓶中剩余的白芨合并，繼續(xù)進(jìn)行纖維素酶提取。將2 000 mL pH值為5.2的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液分4次與6 g纖維素酶于500 mL的燒杯中混勻，4次洗脫后合并酶解液，平均倒入4個(gè)三角瓶中，置于50 ℃水浴搖床上同時(shí)進(jìn)行振蕩，酶解時(shí)間及后續(xù)操作同“1.3.2”節(jié)。

1.3.5純水對照組于4個(gè)編號為1、2、3、4的 1 000 mL 三角瓶中分別加入50 g白芨。將2 000 mL純水平均倒入這4個(gè)三角瓶中，搖勻后置于50 ℃水浴搖床上同時(shí)同條件進(jìn)行振蕩，提取時(shí)間及后續(xù)操作同“1.3.2”節(jié)。

1.3.6乙醇對照組于4個(gè)編號為1、2、3、4的 1 000 mL 三角瓶中分別加入50 g白芨。將2 000 mL 70%乙醇溶液平均倒入這4個(gè)三角瓶中，搖勻后置于50 ℃水浴搖床上同時(shí)同條件進(jìn)行振蕩，提取時(shí)間及后續(xù)操作同“1.3.2”節(jié)。

1.3.7HPLC測定方法測定樣品為酸性蛋白酶提取物、果膠酶提取物、纖維素酶提取物，以及對照組純水提取物和70%乙醇提取物。樣品經(jīng)0.45 μm的針頭微孔濾膜注射入進(jìn)樣瓶中，進(jìn)樣量為10 μL，色譜柱為等徑3.5 μm的Eclipse Plus C18反相柱，柱長100 mm，柱徑3.0 mm，柱溫40 ℃，梯度淋洗，流動(dòng)相流速為0.45 mL/min，流動(dòng)相A溶液為5%乙腈，流動(dòng)相B溶液為95%乙腈，淋洗梯度：0～5 min，B溶液0 ～10%；5～10 min，B溶液10%～20%；10～30 min，B溶液 20%～30%；30～45 min，B溶液30%～60%；45～55 min，B溶液60%～100%。紫外檢測波長為220 nm。endprint

2結(jié)果與分析

2.1提取物的吸光特性

取同時(shí)段等量的水提、醇提、酸性蛋白酶、果膠酶、纖維素酶提取液合并混勻，離心取上清液，經(jīng)稀釋后于190～600 nm 范圍內(nèi)進(jìn)行可見紫外吸收掃描。由圖1可知，提取物的最大紫外吸收峰出現(xiàn)在220 nm處，也就是說白芨中在紫外線下有強(qiáng)吸收的物質(zhì)在該坡長下幾乎都能檢測到。272 nm處也有1個(gè)紫外吸收峰，但在該處檢測到的物質(zhì)種類較少，為了對提取物組分進(jìn)行較全面的檢測，所以試驗(yàn)選取220 nm作為HPLC檢測的波長。

2.2提取物的HPLC檢測

在白芨植物組織中存在大量的具有高活性的天然化合物，而這些組織的生命活動(dòng)是由于植物的各種生物酶的代謝及合成作用體現(xiàn)的，這些酶大多是蛋白質(zhì)。利用蛋白酶可以降解白芨組織中的酶蛋白使組織內(nèi)活性物質(zhì)溶出。而植物很多組織之間的結(jié)合都是通過果膠質(zhì)將它們黏接在一起的，經(jīng)過蛋白酶的酶解會使這些果膠質(zhì)充分暴露出來，再用果膠酶降解成為小分子成分，從而有助于細(xì)胞間果膠內(nèi)的天然物質(zhì)溶解出來，同時(shí)還會使植物細(xì)胞壁變得更為疏松，便于纖維素酶繼續(xù)酶解。植物細(xì)胞壁的主要成分是纖維素及少量的果膠類物質(zhì)，這些物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有大量的羥基，具有親水疏油的性質(zhì)，有機(jī)溶劑無法滲入細(xì)胞內(nèi)，纖維素酶可針對性地降解細(xì)胞壁和細(xì)胞間質(zhì)中的纖維素、半纖維素等成分，提高細(xì)胞膜的通透性，便于胞內(nèi)的天然物質(zhì)溶出[14-16]。

由于酶解白芨植物組織是兩相生物化學(xué)反應(yīng)，反應(yīng)速度比化學(xué)反應(yīng)慢，所以酶解提取天然產(chǎn)物的反應(yīng)時(shí)間是影響生物活性物質(zhì)提取效果的重要因素。本試驗(yàn)于不同時(shí)間下對白芨天然產(chǎn)物進(jìn)行提取，并利用搖床進(jìn)行振蕩以加快反應(yīng)速度，同時(shí)以純水、70%乙醇提取作對照。

2.2.1酸性蛋白酶提取的化學(xué)成分由圖2可知，酸性蛋白酶酶解提取的白芨物質(zhì)種類較多，組成復(fù)雜。提取時(shí)間對提取的物質(zhì)種類無影響，但對物質(zhì)的含量影響較大。a峰物質(zhì)的含量在提取2～6 h內(nèi)逐漸增加，但在6 h后卻略微下降；15～20 min溶出的物質(zhì)含量隨著酶解時(shí)間的增加而增大，尤其是b峰物質(zhì)變化最明顯；c、d峰物質(zhì)的含量隨著酶解時(shí)間的增加均有所下降，尤其是在6 h后下降趨勢更明顯。綜合來看，6 h為酸性蛋白酶酶解提取白芨中天然化合物的最佳時(shí)間。另外，酸性蛋白酶對白芨組織的破壞作用常隨著酶解時(shí)間的增加而增大，溶出的主要物質(zhì)含量也增加，但長期的氧氣接觸或酶解作用都可能會引起某些物質(zhì)的氧化或降解，而這種現(xiàn)象在隨后的果膠酶和纖維素酶酶解過程中均存在。

2.2.2果膠酶提取的化學(xué)成分由圖3可知，繼酸性蛋白酶酶解后， 再用果膠酶酶解白芨剩余物時(shí)仍有大量的天然產(chǎn)物

溶出，其主要的物質(zhì)種類和酸性蛋白酶相同，但物質(zhì)含量卻均有所下降，尤其是e、f、c、d峰物質(zhì)。此外，果膠酶提取2 h時(shí)溶出了酸性蛋白酶提取物中沒有的g峰物質(zhì)，其含量較大，但隨著提取時(shí)間的增加，其含量在逐漸下降，并在隨后的纖維素酶提取物中不再出現(xiàn)，表明g峰物質(zhì)主要存在黏連細(xì)胞的胞間果膠質(zhì)中，同時(shí)也說明繼蛋白酶酶解6 h后再用果膠酶酶解2 h，此時(shí)提取的物質(zhì)種類較多，含量較大。

2.2.3纖維素酶提取的化學(xué)成分由圖4可知，經(jīng)酸性蛋白酶和果膠酶相繼酶解后的剩余白芨固體再經(jīng)纖維素酶酶解得到的物質(zhì)成分顯著減少，尤其是在酶解10 min后沒有物質(zhì)出現(xiàn)。經(jīng)纖維素酶酶解仍有大量的a峰物質(zhì)，說明a峰物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)外均大量存在。胞內(nèi)的其他物質(zhì)在纖維素酶提取物中均未得到，可能大多是一些親水性物質(zhì)，在酸性蛋白酶和果膠酶酶解過程中幾乎均已水解溶出，再用纖維素酶酶解時(shí)，溶出的物質(zhì)就極少。在纖維素酶酶解提取物中沒有出現(xiàn)g峰物質(zhì)，進(jìn)一步說明g峰物質(zhì)主要存在于黏連細(xì)胞的胞間果膠中。另外，隨著提取時(shí)間的增加，a峰的峰面積明顯下降，因此，經(jīng)酸性蛋白酶和果膠酶相繼酶解后，再用纖維素酶酶解提取白芨天然化合物的最佳時(shí)間為2 h。

2.2.4純水提取的化學(xué)成分由圖5可知，純水提取的白芨化學(xué)成分種類較多，在13～22 min集中出峰明顯且含量較大。在22 min后溶出的物質(zhì)種類較少，含量也極低，可能主要是一些極性較小的親脂性成分。提取時(shí)間對提取物質(zhì)的種類無影響，但對物質(zhì)的含量影響較大，表現(xiàn)為隨著提取時(shí)間的增加，提取的物質(zhì)含量也在增加，尤其是a峰和b峰。

2.2.570%乙醇提取的化學(xué)成分乙醇是提取中藥有效成分常用的有機(jī)溶劑之一，常用于提取極性較小的化合物。采用適宜濃度的乙醇能提取親脂性化合物和親水性物質(zhì)。

由圖6可知，70%乙醇提取的白芨物質(zhì)種類比純水提取的物質(zhì)種類豐富。在4～22 min內(nèi)出現(xiàn)的物質(zhì)種類和純水提取的基本一致，但在22～50 min內(nèi)出現(xiàn)的物質(zhì)種類比水提取的豐富，含量也比水提取的大。表明在4～22 min內(nèi)出現(xiàn)的物質(zhì)主要以親水性物質(zhì)為主，22～50 min內(nèi)溶出的除了純水提取的物質(zhì)外，還多了一些脂溶性物質(zhì)。另外，提取時(shí)間為2、4、6、12 h時(shí)，提取的物質(zhì)種類是相同的，但隨著提取時(shí)間的增加，j、k等峰面積在6 h后下降明顯，說明6 h為70%乙醇提取白芨天然產(chǎn)物的最佳時(shí)間。

2.2.6酶提與水提、醇提提取的化學(xué)成分比較由圖7可知，從提取的物質(zhì)種類上看，h、i峰物質(zhì)主要存在于酸性蛋白酶、果膠酶和纖維素酶提取物中，而在水提和醇提提取物中沒有出現(xiàn)；c、d峰物質(zhì)主要存在于酸性蛋白酶和果膠酶提取物中，在纖維素酶、水提、醇提提取物中沒有出現(xiàn)；g峰物質(zhì)是酸性蛋白酶、纖維素酶、水提、醇提提取均得不到的，而在果膠酶提取物中卻大量存在，說明g峰主要存在于黏連細(xì)胞的胞間果膠中，只有通過果膠酶對胞間質(zhì)的破壞才能使該物質(zhì)溶出；另外，醇提取與水提取、酶提取相比較，在集中出峰的13～22 min 內(nèi)溶出的物質(zhì)種類大致是相同的，而在22～50 min內(nèi)溶出的物質(zhì)種類差異較大，醇提提取物中溶出的j、k等2種峰物質(zhì)在水提和酶解提取物中沒有出現(xiàn)，也就是說醇提取物中除了包含水提取的物質(zhì)外，還提取出了一些脂溶性物質(zhì)。綜合看來，酶解提取物中h、i、c、d、g峰物質(zhì)是水提和醇提均無法得到的。endprint

從提取的物質(zhì)含量上看，a、e、m、f等4種峰物質(zhì)在酶解、水提和醇提提取物中均大量存在，但物質(zhì)含量卻存在較大的差異。酸性蛋白酶提取6 h時(shí)，a峰的峰面積為純水提取12 h的1.75倍，為醇提取6 h的2.7倍；e峰的峰面積為純水提取12 h的1.5倍，為醇提取6 h的0.9倍；m峰的峰面積為純水提取12 h的0.5倍，為醇提取6 h的0.5倍；f峰的峰面積為純水提取12 h的0.9倍，為醇提取6 h的0.8倍。綜合分析可知，利用酶法提取白芨天然化合物比水提取和70%乙醇提取更有效，提取的物質(zhì)種類較多，提取效率高。

2.2.7酶解與水提法提取率的比較白芨塊莖中含有大量的親水性活性成分如白芨多糖膠等，采用水提-醇沉法可以大量獲得，但往往含有蛋白質(zhì)、淀粉等諸多雜質(zhì)。而采用全酶法提取時(shí)，蛋白酶可以除去大量的蛋白質(zhì)，低溫可避免淀粉的糊化溶出。圖8為不同時(shí)間下酶提（酸性蛋白酶、果膠酶、纖維素酶相繼提?。┖退?次后得到的醇沉干燥物提取量的比較，由圖8可知，提取時(shí)間對物質(zhì)的提取率影響較大，2種提取方法提取的物質(zhì)量均在6 h時(shí)達(dá)到最大，6 h后逐漸下降；從提取效率上看，同等條件下酶解法的優(yōu)勢更明顯，其提取率是純水提取的3～5倍。

3結(jié)論

中藥所含的化學(xué)成分十分復(fù)雜，既含有多種有效成分，又有無效成分，有些還包含有毒成分，提取其有效成分并進(jìn)一步加以分離、純化，得到有效單體是中藥研究領(lǐng)域中的一項(xiàng)重要內(nèi)容。好的提取方法能最大限度地提取其中的有效成分，提高中藥制劑的內(nèi)在質(zhì)量和臨床治療效果，使中藥的藥效得以最大限度地發(fā)揮。本研究通過HPLC對酶提取、純水提取、70%乙醇提取的白芨塊莖中化學(xué)成分進(jìn)行檢測分析，結(jié)果表明，酶法提取物中的化學(xué)成分種類比純水提取和醇提取豐富，且水溶性物質(zhì)提取率較高，但對提取物中的化學(xué)成分鑒定還在進(jìn)一步的研究中。另外，雖然酶解法對提取白芨中的天然化學(xué)成分有著較大的優(yōu)勢，但為發(fā)揮酶提取技術(shù)的最大優(yōu)勢，除了嚴(yán)格控制酶反應(yīng)時(shí)間外，還須綜合考慮酶解溫度、pH值、底物的濃度、抵制劑和激動(dòng)劑等酶反應(yīng)條件對白芨提取效果的影響。

參考文獻(xiàn)：

[1]孫樂樂，楊永紅，劉軍凱，等. 白及的本草考證[J]. 中藥材，2010，33（12）：1965-1968.

[2]仰蓮，彭成，李小紅，等. 白及的化學(xué)成分及生物活性研究進(jìn)展[J]. 中藥與臨床，2014，5（6）：59-64.

[3]孫愛靜，龐素秋，王國權(quán). 中藥白及化學(xué)成分與藥理活性研究進(jìn)展[J]. 環(huán)球中醫(yī)藥，2016，9（4）：507-511.

[4]陶阿麗，金耀東，劉金旗，等. 中藥白芨化學(xué)成分、藥理作用及臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（11）：6-9.

[5]Qian C D，Jiang F S，Yu H S，et al. Antibacterial biphenanthrenes from the fibrous roots of Bletilla striata[J]. Journal of Natural Products，2015，78（4）：939-943.

[6]Wang Y J，Huang W Z，Zhang J Z，et al. The therapeutic effect of Bletilla striata extracts on LPS-induced acute lung injury by the regulations of inflammation and oxidation[J]. Rsc Advances，2016，6（92）：89338-89346.

[7]Sun A J，Liu J Q，Pang S Q，et al. Two novel phenanthraquinones with anti-cancer activity isolated from Bletilla striata[J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，2016，26（9）：2375-2379.

[8]Wang W，Meng H. Cytotoxic，anti-inflammatory and hemostatic spirostane-steroidal saponins from the ethanol extract of the roots of Bletilla striata[J]. Fitoterapia，2015，101：12-18.

[9]Wang Y，Liu D，Chen S J，et al. A new glucomannan from Bletilla striata：structural and anti-fibrosis effects[J]. Fitoterapia，2014，92（2）：72-78.

[10]李雨晴，楊嘉偉，王康才，等. 白芨種子無菌萌發(fā)特性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（4）：253-255.

[11]芮海云，吳國榮，陳景耀，等. 白芨中性雜多糖的分離純化與結(jié)構(gòu)分析[J]. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，31（1）：30-33.

[12]張宇思，姚正穎，劉金香，等. 基于原球莖液體培養(yǎng)的白芨快速繁殖研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（10）：59-62，331.

[13]孔令?yuàn)? 白芨多糖的提取與功效研究[D]. 上海：上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院，2015.

[14]呂長鑫，李萌萌，徐曉明，等. 響應(yīng)面分析法優(yōu)化纖維素酶提取紫蘇多糖工藝[J]. 食品科學(xué)，2013，34（2）：6-10.

[15]金辰光，陳瑞戰(zhàn)，譚莉，等. 響應(yīng)面優(yōu)化復(fù)合酶提取夏枯草多糖[J]. 長春師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，35（2）：49-53.

[16]吳瓊，于淑艷，鄒險(xiǎn)峰，等. 超聲波協(xié)同果膠酶提取黑木耳粗多糖[J]. 食品研究與開發(fā)，2014，35（10）：33-36.謝冬娣，覃麗丹. 咪鮮胺添加助劑在采后荸薺保藏中的應(yīng)用[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（17）：179-182.endprint