劉姝+房耀維+王淑軍+焦豫良+陳國強+潘建梅+金志勇

摘要：為開發(fā)1種基于共培養(yǎng)的抗菌性海洋放線菌平板高效篩選方法，并對菌株提高放線菌產抗菌物質能力的機制進行探索，以單獨培養(yǎng)的海葵共附生放線菌為對照，研究與菌株共培養(yǎng)對?？哺缴Ｑ蠓啪€菌抗菌性菌株篩選效率的影響，以及不同生長期蠟樣芽孢桿菌菌株Bacillus cereus AS1.1846的發(fā)酵液、發(fā)酵液添加量和添加時間對放線菌菌株AAA015抗菌活性的影響，初步探索提高放線菌抗菌活性的機制。結果表明，通過平板共培養(yǎng)可以顯著提高抗菌性海洋放線菌篩選效率。B. cereus AS1.1846從穩(wěn)定期開始分泌到胞外提高放線菌抗菌活性、對熱穩(wěn)定的次生代謝產物，少量的該物質即可顯著提高菌株AAA015的抗菌活性。獲得了1種基于共培養(yǎng)的高效抗菌活性海洋放線菌平板篩選方法。

關鍵詞：平板；共培養(yǎng)；海洋放線菌；抗菌活性；篩選

中圖分類號： S182文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）17-0254-05

收稿日期：2016-04-19

基金項目：國家自然科學基金（編號：31201687）；江蘇省自然科學基金面上項目（編號：BK20141249、BK20151282）；江蘇省海洋資源開發(fā)研究院開放課題（編號：JSIMR201422、JSIMR201506）；淮海工學院科研創(chuàng)新基金（編號：Z2014016）；江蘇省高?！扒嗨{工程”。

作者簡介：劉姝（1975—），女，江西南昌人，博士，副教授，主要從事海洋微生物資源開發(fā)與利用研究。E-mail：jdliushu@163.com。

通信作者：房耀維，博士，副教授，主要從事海洋微生物次級代謝產物研究。E-mail：foroei@163.com?？股卦谌祟惻c植物病原微生物的斗爭中起到了舉足輕重的作用[1]。但是，由于抗生素的廣泛使用乃至濫用，導致多重耐藥菌（multidrug-resistant pathogens，簡稱MDR）出現(xiàn)并有蔓延態(tài)勢，篩選新穎的抗菌活性物質用于生物農藥的開發(fā)成為對抗多重耐藥菌的主要方法之一[2-3]。不幸的是，盡管抗菌活性物質篩選技術、合成生物學以及化學修飾技術快速發(fā)展，但新型抗菌活性物質的發(fā)現(xiàn)速率卻依然難以滿足藥劑市場的需求，導致公眾健康仍然面臨巨大威脅[4]。幅員遼闊、環(huán)境復雜多樣的海洋蘊含種類、數(shù)量極其巨大的新穎抗菌活性物質[5]。研究表明，目前篩選獲得的抗菌物質只是寶藏的冰山一角，更多的新穎抗菌活性物質有待研究者去開發(fā)[6]。因此，需要進一步開發(fā)快速的抗菌活性物質篩選技術。

傳統(tǒng)的抗菌活性微生物篩選建立在單獨培養(yǎng)的基礎上。而自然情況下，微生物是雜居混生的，爭奪營養(yǎng)和生存空間被認為是微生物產抗菌物質的主要誘因之一[7-8]，通過微生物共培養(yǎng)發(fā)酵可顯著提高多種微生物產抗菌物質水平可以進一步對此進行佐證[9]?？梢?，單獨培養(yǎng)降低了微生物產抗菌物質的可能性，不利于抗菌活性物質的篩選。模擬自然環(huán)境，基于共培養(yǎng)方式篩選產抗菌活性物質的微生物菌株，理論上具有更好的篩選潛在產抗菌物質微生物的能力。放線菌是微生物中產抗菌活性物質的佼佼者[10]。本研究以?？哺缴Ｑ蠓啪€菌為研究對象，擬開發(fā)1種基于平板共培養(yǎng)的篩選具有抗菌活性海洋放線菌的高效方法，對提高菌株抗菌活性的物質來源進行探索。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品采集連云港連島海域（34°76′N，119°48′E）活黃?？瑯悠分糜跓o菌玻璃瓶內，立即放于冰盒保存，并盡快送回實驗室進行處理。

1.1.2試驗菌株蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus AS1.1846）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus AS1.2465）、大腸桿菌（Escherichia coli AS1.487）、啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae AS2.114）、巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris GS115）、擴展青霉（Penicillium expansum AS3.3703）、熒光假單胞菌（Pseudomouas fluorescens AS1.1802）、黑曲霉（Aspergillus niger AS3.350），來源于中國普通微生物菌種保藏中心。

1.1.3培養(yǎng)基?？哺缴啪€菌分離培養(yǎng)基：天然海沙提取物（NRS提取物）90 mL，?？崛∥?0 mL，海水900 mL，pH值自然。NRS提取物的制備：用500 mL海水清洗900 mL取自潮間帶的海沙，4 ℃ 保存。?？崛∥锏闹苽洌夯铧S?？?0 g，加海水90 mL，高速勻漿后，8層紗布過濾，現(xiàn)配現(xiàn)用。培養(yǎng)基滅菌降溫后添加放線菌酮、萘啶酮酸至終濃度分別為100、25 mg/L。指示菌和共培養(yǎng)菌培養(yǎng)基的配制：細菌和真菌分別采用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)[11]和PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)[11]，固體培養(yǎng)基添加2%瓊脂。種子培養(yǎng)基為2216E培養(yǎng)基，發(fā)酵產抗菌物質培養(yǎng)基采用Zhang等報道的發(fā)酵培養(yǎng)基[12]。所有培養(yǎng)基均在1×105 Pa條件下滅菌20 min。

1.2平板共培養(yǎng)篩選抗菌性海葵共附生放線菌

如圖1所示，從1 mL移液槍槍頭擴口端剪下12 mm，制成塑料圓柱體，1×105 Pa滅菌20 min，備用。預共培養(yǎng)的菌株發(fā)酵活化后用三區(qū)劃線法分離單菌落。在無菌條件下，將10 g濕?？湃霚缇匿X合金盤子內，放置于超凈臺中24 h使樣品干燥，再用研磨棒輕輕地將樣品壓成粉末。用直徑為

14 mm的泡沫塑料棒輕壓粉末作為印章，在固體培養(yǎng)基上依次影印8～9次，培養(yǎng)3～10 d至出現(xiàn)單菌落。根據(jù)放線菌菌落顏色、形狀、大小以及簡單染色后顯微鏡觀察菌株基內菌絲、氣生菌絲、孢子絲和孢子形態(tài)分辨不同放線菌，標記編號，并保存菌種。

分別吸取100 μL培養(yǎng)至對數(shù)生長期的E. coli AS1.487涂布平板，用于抗菌活性測定。將塑料圓柱體窄口端置于單菌落上，輕壓至圓柱體接觸皿底，取出后，將塑料圓柱體寬口端置于?？哺缴啪€菌單菌落上，用鑷子輕壓窄口端瓊脂，使圓柱中上下瓊脂層接觸，30 ℃共培養(yǎng)3 d后，將共培養(yǎng)圓柱體移至含菌平板上，用于抗菌活性篩選。以塑料圓柱體窄口端為無菌瓊脂，寬口端為放線菌的單培養(yǎng)菌株為對照（CK）。培養(yǎng)2 d后，置于S. aureus AS1.2465、P. fluorescens AS1.1802、S. cerevisiae AS2.114以及P. expansum AS3.3703含菌平板上，30 ℃培養(yǎng)3 d后測定抑菌圈直徑。endprint

1.3不同共培養(yǎng)菌株對3株放線菌產抗菌物質的影響

將S. aureus AS1.2465、B. cereus AS1.1846、E. coli AS1.487、P. fluorescens AS1.1802、P. pastoris GS115、S. cerevisiae AS2.114、P. expansum AS3.3703以及A. niger AS3.350分別與3株具有抗菌活性的放線菌菌株（編號分別為AAA015、AAA016和AAA162）共培養(yǎng)，以單培養(yǎng)的菌株為對照，置于不同供試菌平板上，30 ℃培養(yǎng)3 d后測定抑菌圈直徑。

1.4不同處理形式的B. cereus AS1.1846菌體、發(fā)酵液的制備及抗菌活性測定

將斜面保藏的B. cereus AS1.1846接種至裝有50 mL液體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30 ℃、160 r/min培養(yǎng)36 h。吸取10 mL發(fā)酵液，8 000 r/min離心5 min，上清液過0.22 μm的濾膜，記作無細胞上清液（cell-free supernatants，簡稱CFS）。量取1/2 CFS，沸水煮10 min，記作hs-CFS，稱取濕質量0.1 g的菌體，用10 mL無菌生理鹽水清洗3次后，重懸于10 mL無菌生理鹽水中，冰水浴，超聲波破碎菌體（400 W，超聲3 s，停7 s，共超聲10 min），鏡檢無完整細胞，記作SC，量取1/2 SC，1×105 Pa滅菌30 min，記作hs-SC。將塑料圓柱體寬口端置于無菌瓊脂平板上，輕壓至圓柱體接觸皿底，取出后，在無菌條件下，分別向塑料圓柱體內加入 50 μL CFS、hs-CFS、SC、hs-SC，置于S. aureus AS1.2465、E. coli AS1.487、S. cerevisiae AS2.114以及P. expansum AS3.3703含菌平板上，30 ℃培養(yǎng)3 d后測定抑菌圈直徑。

1.5不同處理形式的B. cereus AS1.1846菌體及發(fā)酵液對放線菌菌株AAA015、AAA016、AAA162產抗菌物質的影響

在海葵共附生放線菌分離培養(yǎng)基平板上采用三區(qū)劃線法分離單菌落，塑料圓柱體寬口端置于單菌落上，輕壓至圓柱體接觸皿底，取出后，在無菌條件下，分別向塑料圓柱體內加入20 μL CFS、hs-CFS、SC和hs-SC，以未加入任何物質的菌株為對照，置于S. aureus AS1.2465、E. coli AS1.487、S. cerevisiae AS2.114、P. expansum AS3.3703含菌平板上，30 ℃培養(yǎng)3 d后測定抑菌圈直徑。采用牛津杯法，利用菌株S. aureus AS1.2465、E. coli AS1.487、S. cerevisiae AS2.114以及P. expansum AS3.3703測定CFS、hs-CFS、SC和hs-SC抗菌活性。

1.6添加CFS提高菌株AAA015抗菌活性的條件

1.6.1不同生長期菌株B. cereus AS1.1846 CFS對菌株AAA015抗菌活性的影響利用吸光度法測定菌株B. cereus AS1.1846在波長為600 nm處的生長曲線，分別取對數(shù)生長期、穩(wěn)定期前期、穩(wěn)定期后期和衰亡期的發(fā)酵液，利用“1.4”節(jié)的方法制備CFS。用接種環(huán)將斜面保存菌種AAA015接種至裝有30 mL 2216E培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30 ℃、160 r/min 培養(yǎng)36 h后作為種子培養(yǎng)基，按1%的接種量接種至裝有50 mL Zhang等報道的發(fā)酵培養(yǎng)基[12]的250 mL三角瓶中，同時添加不同生長時期的CFS 2 mL，30 ℃、160 r/min培養(yǎng)3 d，8 000 r/min離心5 min，發(fā)酵液過 0.22 μm 濾膜后，采用牛津杯法，以S. aureus AS1.2465、E. coli AS1.487、S. cerevisiae AS2.114以及P. expansum AS3.3703為供試菌測定抗菌活性。以未添加CFS的單獨培養(yǎng)菌株為對照。

1.6.2CFS添加量對菌株AAA015抗菌活性的影響其他條件按照“1.6.1”節(jié)方法不變，在接種Zhang等報道的發(fā)酵培養(yǎng)基[12]時分別向不同三角瓶內添加穩(wěn)定期后期的CFS 05、1、2、3、4 mL，30 ℃、160 r/min 培養(yǎng)3 d，8 000 r/min離心 5 min，發(fā)酵液過 0.22 μm 濾膜后，采用牛津杯法測定抗菌活性。以未添加CFS的單獨培養(yǎng)菌株為對照。

1.6.3CFS添加時間對菌株AAA015抗菌活性的影響利用吸光度法測定菌株AAA015在波長600 nm處的生長曲線。其他條件按照“1.6.1”節(jié)方法不變，分別在菌株AAA015培養(yǎng)初期、對數(shù)生長期、穩(wěn)定期加入2 mL CFS，160 r/min培養(yǎng) 3 d 后采用牛津杯法測定抗菌活性。

2結果與分析

2.1平板共培養(yǎng)篩選具有抗菌活性的?？哺缴啪€菌

以單獨培養(yǎng)為對照，通過與B. cereus AS1.1846共培養(yǎng)，及利用S. aureus AS1.2465、E. coli AS1.487、S. cerevisiae AS2.114、P. expansum AS3.3703含菌平板進行共培養(yǎng)，篩選具有抗菌活性的?？哺缴啪€菌。結果如表1和圖2所示，利用平板共培養(yǎng)法和單獨培養(yǎng)法對129株?？哺缴啪€菌的抗菌活性進行篩選，共培養(yǎng)篩選法對S. aureus AS1.2465、E. coli AS1.487、S. cerevisiae AS2.114以及P. expansum AS3.3703的抗性菌株篩出率均顯著顯著高于單獨培養(yǎng)法。選取其中抗菌活性最高的放線菌菌株（編號分別為AAA015、AAA016和AAA162）用于后續(xù)研究。endprint

2.2不同共培養(yǎng)菌株對3株放線菌產抗菌物質的影響

選革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、酵母菌、絲狀真菌各2

種分別與3株具有抗菌活性的放線菌菌株共培養(yǎng)，以單培養(yǎng)的菌株為對照，置于不同供試菌平板上，30 ℃培養(yǎng)3 d后測定抑菌圈（表2）?？傮w看出，3種放線菌和8株菌株共培養(yǎng)后，部分共培養(yǎng)后顯著提高了菌株的抗菌活性。有趣的是菌株AAA015與菌株B. cereus AS1.1846共培養(yǎng)后，產生了抗S. cerevisiae AS2.114的活性。

2.5添加CFS提高菌株AAA015抗菌活性的條件

2.5.1不同生長期菌株B. cereus AS1.1846 CFS對菌株AAA015抗菌活性的影響菌株B. cereus AS1.1846在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上的生長曲線見圖3。制備培養(yǎng)16、20、34、40 h 后的CFS，分別添加到菌株AAA015發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵后利用牛津杯法測定發(fā)酵液抗菌活性（圖4）。不同生長期的CFS對菌株AAA015抗菌活性的影響有顯著差異。在B. cereus AS1.1846的對數(shù)生長中期及穩(wěn)定初期，雖然CFS提高了菌株的抗菌活性，但是提高不顯著，而穩(wěn)定后期及衰亡期可顯著提高菌株的抗菌活性。初步表明提高放線菌抗菌活性的物質產生于B. cereus AS1.1846的穩(wěn)定期，可能屬于次生代謝產物。

2.5.2CFS添加量對菌株AAA015抗菌活性的影響由圖5可知，當CFS添加量超過1 mL后，其抗菌活性不再顯著提高甚至略有下降趨勢。表明提高菌株AAA015抗菌活性的物質具有濃度效應，達到一定閾值后，不再提高。

2.5.3CFS添加時間對菌株AAA015抗菌活性的影響利用吸光度法測定的菌株AAA015生長曲線見圖6。根據(jù)生長曲線，分別在菌株AAA015培養(yǎng)0、12、24、32、40、52 h時加入1 mL CFS，160 r/min培養(yǎng)3 d后采用牛津杯法測定抗菌活性。

從發(fā)酵起始至衰亡期到來之前，添加CFS可以顯著提高AAA015菌株的抗菌活性，但穩(wěn)定期之前添加CFS的抗菌活性顯著高于穩(wěn)定后期添加的抗菌活性（圖7）。

3討論

自然界中的微生物是雜居混生的，微生物之間相互競爭生存資源和空間是刺激微生物產生抗菌物質的主要因素[13]。通過共培養(yǎng)提高天然產物產量或者刺激新穎天然產物產生的研究報道日益增多。Rateb等發(fā)現(xiàn)煙曲霉（Aspergillus fumigatus）同布利土放線菌（Streptomyces bullii）共培養(yǎng)后，可以產生7種單培養(yǎng)檢測不到的化合物[8]。黃兵等研究了22株放線菌的單培養(yǎng)及它們與枯草芽孢桿菌的共培養(yǎng)發(fā)酵代謝

產物的差異，發(fā)現(xiàn)放線菌FXJ2.014、FXJ1.296、AS 4.1252等3株菌與枯草芽孢桿菌共培養(yǎng)時產生它們在相同條件下單培養(yǎng)時沒有的物質，其中鏈霉菌FXJ2.014單培養(yǎng)時主要產生醌霉素A，共培養(yǎng)時產物中增加了生物活性與醌霉素A有顯著差異的醌霉素結構類似物FXJ2.014-HB[14]。黃艷琴等研究發(fā)現(xiàn)，海綿細菌在抗菌活性方面具有正向和負向的協(xié)同效應[15]。郭鵬飛等通過薄層層析顯色分析、生物自顯影分析證明，共培養(yǎng)能誘導海綿相關微生物產生不同于單培養(yǎng)的代謝產物和抗菌活性物質[16]。共培養(yǎng)利用微生物的這種競爭提高抗菌物質產量或者產生新穎的抗菌物質，用于抗菌性菌株篩選后，可以提高抗菌性菌株，特別是新穎抗菌性菌株或新穎抗菌物質的篩選效率。

關于共培養(yǎng)提高菌株抗菌物質產量或者刺激產生新穎抗菌物質機制的報道較少。主要包括沉默基因簇的激活、群體感應（quorum sensing，簡稱QS）和基因水平轉移（horizontal gene transfer，簡稱HGT）。大部分次級代謝產物合成基因簇在常規(guī)試驗條件下處于沉默狀態(tài)。若這些潛在的生物合成途徑被激活，則有可能發(fā)現(xiàn)許多新活性產物[17-18]。Schroeckh等利用基因芯片技術結合透析試驗和電鏡成像技術證明了Aspergillus nidulans同Streptomyces rapamycinicus接觸后激活了2個次級代謝產物基因簇的表達，產生新穎代謝產物[19]。群體感應是細菌生長到一定密度時相互感應，調控產生獨特的、多樣的群體行為現(xiàn)象。細菌共培養(yǎng)時的種間群體感應調控可以誘導目標微生物的次級代謝[20]。郭秀春等發(fā)現(xiàn)，外源病原菌S. aureus代謝產物中存在某種信號分子，能誘導NJ6-3-1在不產生抗菌物質的生長條件下代謝產生抗菌物質[21]。帶化紅球菌（Rhodococcus fascians）和稠李鏈霉菌（Streptomyces padanus）共培養(yǎng)，放線菌的基因水平轉移誘導R. fascians產生新穎氨基糖苷類抗菌物質[22]。本研究中，菌株B. cereus AS1.1846所分泌的提高放線菌菌株AAA015抗菌活性的物質為次級代謝產物，具有濃度效應，推測和群體感應相關。接下來需要進一步對該物質進行純化、結構鑒定及誘導效應研究，對推測予以證實。

4結論

本研究報道了1種基于平板共培養(yǎng)的抗菌性海洋放線菌篩選方法，和傳統(tǒng)的單培養(yǎng)篩選方法相比，具有簡單易行和明顯提高抗菌性菌株篩選效率等優(yōu)勢。菌株B. cereus AS1.1846在穩(wěn)定期分泌提高放線菌菌株AAA015抗菌活性的物質，在提高菌株AAA015抗菌活性中表現(xiàn)有濃度效應。在海洋放線菌AAA015發(fā)酵起始至衰亡期到來之前，添加含有該物質的CFS可以顯著提高抗菌活性。

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