李亞丹，楊 輝，盧向陽，田 云*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.長沙環(huán)境保護(hù)職業(yè)技術(shù)學(xué)院環(huán)境科學(xué)系，湖南 長沙 410004)

不同飼料飼養(yǎng)黃牛瘤胃厭氧真菌的多樣性對比研究

李亞丹1,2，楊 輝1，盧向陽1，田 云1*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.長沙環(huán)境保護(hù)職業(yè)技術(shù)學(xué)院環(huán)境科學(xué)系，湖南 長沙 410004)

【目的】探究不同飼料飼養(yǎng)黃牛瘤胃厭氧真菌多樣性的差異，了解芒草單一飼料飼養(yǎng)時瘤胃中特殊的真菌種類?！痉椒ā客ㄟ^構(gòu)建芒草單一喂養(yǎng)、混合飼料飼養(yǎng)的黃牛瘤胃微生物18S rRNA基因文庫，來對比分析單一飼喂芒草對瘤胃厭氧真菌多樣性的影響?！窘Y(jié)果】發(fā)現(xiàn)持續(xù)喂養(yǎng)18個月后，混合飼料飼養(yǎng)牛瘤胃真菌包含的種類較分散，無明顯的優(yōu)勢類別，而芒草單一喂養(yǎng)牛瘤胃真菌包含的種類相對集中，主要集中在Orpinomycessp.，Piromycessp.，Neocallimastixfrontalis，Microdochiumsp.幾種。【結(jié)論】使用芒草單一飼養(yǎng)確實改變了黃牛瘤胃中真菌的組成，并且其中優(yōu)勢真菌類群很可能與芒草的降解有密切關(guān)系，為今后開發(fā)瘤胃微生物資源在生物能源方面的利用奠定基礎(chǔ)。

黃牛；瘤胃；芒草；18S rRNA；真菌

【研究意義】反芻動物瘤胃微生物長期處于恒定溫度、恒定pH值、低氧氣濃度的特殊環(huán)境，所以瘤胃微生物的純分離培養(yǎng)受到極大的限制。【前人研究進(jìn)展】20世紀(jì)70年代末，研究人員首次發(fā)現(xiàn)瘤胃內(nèi)存在一個重要的微生物類群，厭氧真菌[1]。最近，仍有諸多新的微生物種陸續(xù)分離出來，如Mitsuokellajalaludinii[2]，Eubacteriumpyruvativorans[3]和Cellulosilyticumruminicola[4]。瘤胃中厭氧真菌游動孢子數(shù)為103～105/mL，對于瘤胃微生物類別的認(rèn)識在不斷地豐富。瘤胃真菌的生物量約占瘤胃微生物總量的8 %[5]。截止2000年，瘤胃中已有15種厭氧真菌分離成功。根據(jù)其孢子、菌絲的形態(tài)分類，可將瘤胃真菌劃分為多中心類型和單中心類型。其中，多中心類型真菌主要包括Orpinomyces和Anaeromyces兩個屬，單中心類型真菌主要包括Neocallimastix，Promyces，Caeomyces3個屬,具體詳見表1。

表1 瘤胃主要真菌種類[5-6]

瘤胃真菌不僅能分泌產(chǎn)生纖維素酶，真菌的穿透生長還使植物組織纖維內(nèi)部張力減小，使其變得疏松而易于降解。有研究證實，在無瘤胃細(xì)菌存在條件下，瘤胃真菌能完成粗纖維飼料中的干物質(zhì)62 %的降解[6]，瘤胃真菌對于瘤胃內(nèi)的纖維質(zhì)成分的高效降解能力可見一斑?！颈狙芯壳腥朦c】因此，通過高纖維含量飼料對黃牛進(jìn)行馴養(yǎng)，研究黃牛瘤胃真菌多樣性的改變，對今后研究瘤胃對食物的消化吸收，以及利用牛瘤胃真菌資源降解纖維質(zhì)材料的工作存在重要的意義?！緮M解決的關(guān)鍵問題】擬通過構(gòu)建牛瘤胃真菌18S rRNA基因克隆文庫的方法，分析飼喂單一芒草和普通飼料對于牛瘤胃真菌多樣性的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物飼養(yǎng)及樣品采集

實驗動物為湘西黃牛。在長沙縣江背鎮(zhèn)烏川湖村分組飼養(yǎng)(3頭/組)，試驗組 (M)僅以新鮮芒草為飼料，對照組 (C)以混合飼料酒糟、豆渣、干草為飼料，飼養(yǎng)時間為18個月。兩種飼料的纖維素含量采用VELP型纖維素測定儀測定(表2)。

牛屠宰后帶無菌手套分組取牛瘤胃內(nèi)容物進(jìn)行混合，再分為50 g/份，在液氮中速凍，帶回實驗室，置于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 高分子量瘤胃微生物總DNA的提取

以牛瘤胃內(nèi)容物為實驗對象，通過除雜等步驟，得到瘤胃微生物，參照文獻(xiàn)[7]方法，提取總DNA，分別獲得試驗組總DNA和對照組總DNA。

1.3 PCR反應(yīng)體系及條件

以真菌18S rRNA基因擴(kuò)增引物[8]：(EF4：5′-GGAAGGGRTGTATTTATTAG-3′，fung5：5′-CTAAAA GTCCTGGTTCCCC-3′)和總DNA為模板，通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增真菌18S rRNA基因。

1.4 18S rRNA基因克隆文庫的構(gòu)建

每個模板同時進(jìn)行3個平行PCR反應(yīng)，將3次PCR產(chǎn)物混合以減少隨機(jī)性偏差。PCR產(chǎn)物用DNA純化試劑盒純化后的產(chǎn)物與pMD18-T載體按如下體系混勻，于16 ℃連接1 h。熱擊轉(zhuǎn)化后，加入500 μl新鮮LB培養(yǎng)基，恢復(fù)培養(yǎng)1 h后在含Amp (100 μg/mL)的固體LB培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布。試驗組18S rRNA基因文庫標(biāo)記為FM，對照組18S rRNA基因標(biāo)記為FC。液體培養(yǎng)將得到的菌落的對應(yīng)菌液進(jìn)行備份保藏。

1.5 核糖體DNA擴(kuò)增片段限制性內(nèi)切酶分析

選用四堿基限制性內(nèi)切酶MspⅠ和AfaⅠ先后2次對文庫中菌落的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切分析。酶切產(chǎn)物經(jīng)3 %瓊脂糖電泳檢測，根據(jù)酶切譜帶初步確定克隆的分類單位 (OUT)。將經(jīng)過兩次酶切分析的具有不同酶切譜帶的克隆初步確定為不同的分類單位，測序由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。

表2 飼料成分比例

1.6 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建及各OTU比例分析

使測序序列進(jìn)行拼接，NCBI在線Blast n比對，獲得各序列在GeneBank中相似性最高的序列，下載用于與本實驗結(jié)果序列共同構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。用Neighbor-Jioning法構(gòu)建進(jìn)化樹，Bootstrap檢驗進(jìn)化樹，自展數(shù)為1000。歸納整理序列信息，統(tǒng)計各運(yùn)籌分類單元 (operational taxonomic units，OTU)及其所包含的克隆數(shù)，計算各個分類單元在文庫中所占比例。

2 結(jié)果與分析

根據(jù)測序結(jié)果進(jìn)行結(jié)果中各序列間的比對，將完全一致序列歸為一個OUT，再與Genebank數(shù)據(jù)庫中已知真菌18S rRNA基因進(jìn)行比對分析瘤胃真菌多樣性。

由表1可知，該文庫中19條序列與數(shù)據(jù)庫已知序列的序列相似性<97 %，約占總數(shù)的29.23 %，說明以芒草作為單一飼料的牛瘤胃真菌種類的新穎性強(qiáng)。其中FM-010和FM-017各包含5條序列，分別與Orpinomycessp.的18S rRNA基因序列相似性達(dá)到97 %，Orpinomycessp.很可能是試驗組牛瘤胃中的優(yōu)勢真菌種類。進(jìn)行序列的進(jìn)化關(guān)系分析時，發(fā)現(xiàn)其中一支包括FM-012、FM-011、FM-010、FM-006、FM-009、FM-004、FM-013、FM-007、FM-016、FM-022、FM-017、FM-023，所包含33個克隆占文庫容量的50.77 % (圖1)。

而在對照組牛瘤胃真菌18S rRNA基因文庫中的41個克隆，絕大部分的序列與數(shù)據(jù)庫已知序列的相似性≥97 %，只有4條序列 (FC-009)與已知序列相似性<97 %，Gibellulopsisnigrescens(FC-010)為該庫中的優(yōu)勢種，包含6條序列，占14.63 %(表2)。通過構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹 (圖2)發(fā)現(xiàn)，同樣該庫中存在一支與已知序列親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的分支，包含12個OUT，分別為FC-001、FC-006、FC-008、FC-009和FC-002的分支與其他真菌的親緣關(guān)系比較遠(yuǎn)，約占總數(shù)的34.14 %。

圖1 芒草馴養(yǎng)牛瘤胃真菌18S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of fungual 18S rRNA gene sequences from Miscanthus sinensis (+) library

NumberofclonesinMiscanthussinensis(+)libraryNumberofclonesinMiscanthussinensis(-)libraryOrpinomycessp.303Piromycessp.92Neocallimastixsp.114Microdochiumsp.40Rhizophlyctisrosea20CandidatusMethanosphaerula20Pyrenochaetaacicola10Sarocladiumzeae06Aspergillusniger04Alternariaalternata05Candidacastellii03Ascomycotasp.04Gibellulopsisnigrescens06Neosartoryaudagawae04

圖2 混合飼料飼養(yǎng)牛瘤胃真菌18S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of fungual 18S rRNA gene sequences from Miscanthus sinensis (-) library

比較試驗組和對照組18S rRNA基因文庫序列信息發(fā)現(xiàn)，混合飼料飼養(yǎng)的瘤胃真菌比對信息所包含的種類比較分散，如Orpinomycessp.，Sarocladiumzeae，Aspergillusniger，Piromycessp.，Alternariaalternata，Candidacastellii，Ascomycotasp.，Gibellulopsisnigrescens，Neosartoryaudagawae，而芒草單一喂養(yǎng)的牛瘤胃真菌包含的種類則相對集中，主要集中在Orpinomycessp.，Piromycessp.，Neocallimastixfrontalis，Microdochiumsp.幾種 (表3)。

3 討 論

纖維素、半纖維素以及木質(zhì)素經(jīng)多種化學(xué)鍵復(fù)合而形成天然木質(zhì)纖維素，這種復(fù)雜的高分子化合物很難被任何單一的水解酶降解、破壞，因此需要多種酶協(xié)同作用完成其降解利用[9]。反芻動物之所以能夠大量采食木質(zhì)纖維含量高的植物莖桿類飼料，正是依靠瘤胃內(nèi)的各種細(xì)菌、真菌及瘤胃原生動物所分泌的多種纖維素、木質(zhì)素、半纖維素降解的酶的統(tǒng)一作用。其中厭氧真菌會優(yōu)先附著于植物材料表面，通過真菌假根對植物細(xì)胞壁的降解作用而進(jìn)入植物維管組織內(nèi)，這種物理性降解，能夠削弱木質(zhì)化組織的抗性，穿透植物表皮角質(zhì)層屏障，使得內(nèi)部的成分暴露，更容易接觸瘤胃微生物產(chǎn)生的降解酶[10]。真菌在植物材料內(nèi)部擴(kuò)張，使植物纖維變得疏松，更加利于其它微生物與植物材料的接觸。在降解植物細(xì)胞壁的同時，厭氧真菌還分泌多種纖維素酶，據(jù)Lee等研究證實，厭氧真菌所產(chǎn)生的纖維素酶活力比目前工業(yè)上常用的纖維素酶活力高出很多倍[11]。

由于受到純分離培養(yǎng)條件的限制，對于瘤胃內(nèi)厭氧真菌多樣性的認(rèn)識一直不夠全面。沈贊明等從水牛瘤胃中分離得到Piromycessp.，Neocallimastixsp.，Orpinomycessp.，分離到的Neocallimastixsp.和Orpinomycessp.具有CMCase活力[12]。用不同飼料喂養(yǎng)牛，由于飼料中植物種類不同，其木質(zhì)纖維的組成成分也不相同，因此降解過程所依賴的真菌種類和比例也有相應(yīng)變化[13]。另一項對日糧組成影響瘤胃厭氧真菌的研究表明，當(dāng)日糧組成纖維含量較高時，厭氧真菌的數(shù)量增加，反之厭氧真菌數(shù)量則低[1,14]。

4 結(jié) 論

本文通過與數(shù)據(jù)庫已知序列的比對，得到芒草馴養(yǎng)牛瘤胃真菌也集中在Orpinomycessp.，Piromycessp.，Neocallimastixfrontalis幾種，并與已知瘤胃內(nèi)纖維降解菌種類部分一致。而在混合飼料飼養(yǎng)的牛瘤胃內(nèi)真菌種類較多，不集中。這也從一定程度上說明了長期單一飼喂芒草對于瘤胃內(nèi)的厭氧真菌種類有較大影響，且芒草馴養(yǎng)很可能使瘤胃真菌種類顯現(xiàn)出更利于降解纖維質(zhì)材料的方向。Orpinomycessp.，Piromycessp.，Neocallimastixsp.等屬與芒草降解的具體關(guān)系需要進(jìn)一步深入研究加以確定。對瘤胃厭氧真菌認(rèn)識的進(jìn)一步豐富，有助于更好掌握瘤胃微生態(tài)總體變化，以及更加深入地利用其分泌的多種纖維質(zhì)降解酶所形成的酶系統(tǒng)，并很可能為芒草這一高纖維質(zhì)含量的非糧食類植物在生物燃料方向的開發(fā)利用擴(kuò)寬了降解酶資源。

[1]Bauchop T. The rumen anaerobic Fungi:colonizers of plant fibre[J]. Ann Rech Vet, 1979, 10:246-248.

[2]Lan GQ, Abdullah N.Mitsuokellajalaludiniisp. nov., from the rumens of cattle in Malaysia[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2002, 52:713-718.

[3]Wallace R J, McEwan N R, Miyagawa E, et al.Eubacteriumpyruvativoranssp. nov., a novel non-saccharolytic anaerobe from the rumen that ferments pyruvate and amino acids, forms caproate and utilizes acetate and propionate[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2003, 53:965-970.

[4]Shichun C, Xiuzhu D.Cellulosilyticumruminicolagen. nov., sp. nov., isolated from yak rumen contents, and reclassification ofClostridiumlentocellumasCellulosilyticumlentocellumcomb[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2010, 60:845-849.

[5]AkinDE,WindhamWR.Influenceofdietonrumenfungi.Intheroleofprotozoaandfungiinruminantdigestion(OECD/UNEInter-nationalseminal) (EdsJVNolan,LengRA,DemeyerDI)[M].Pe-nambulbooksArmidale,NewSouthWales,Australia,1989:75-82.

[6]Wilson C A. Studies on the cellulase of the rumen anaerobic fungus Neoeallimastrix orfntalis,with special reference to the capacity of the enzyme to degrade[J]. Enzyme and Microbial Teehnology, 1994, 14:258-264.

[7]李亞丹. 芒草馴養(yǎng)湘西黃牛(Bostaurus)瘤胃微生物多樣性及β-葡萄糖苷酶新基因的克隆與表達(dá)研究[D]. 長沙: 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)博士論文, 2012.

[8]Jorgensen H B, Johansson T, Canback B, et al. Selective foraging of fungi by collembolans in soil[J]. Biology Letter, 2005(1):243-246.

[9]朱永濤, 劉巍峰, 王祿山, 等. 不依賴微生物培養(yǎng)的纖維素降解酶及基因資源的挖掘[J]. 生物工程學(xué)報, 2009, 25: 1838-1843.

[10]張 輝. 瘤胃內(nèi)真菌降解粗纖維的研究進(jìn)展[J]. 黃牛雜志, 1997, 23: 49-51.

[11]Lee S S, Shin K J, Kim W Y, et al. The rumen ecosystem: As a fountain source of novel enzyme [J]. Asian Aust J Anim Sci, 1999, 12(6): 988-1001.

[12]沈贊明, 韓正康. 水牛瘤胃厭氧真菌的分離和鑒定[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 1993, S1.

[13]Dipti W P, Scott E D. Rumen Bacterial Diversity Dynamics Associated with Changing from Bermudagrass Hay to Grazed Winter Wheat Diets[J]. Microbiology Ecology, 2010, 59(3):511-522.

[14]Orpin C G, Joblin K N. The rumen anaerobic fungi[M]. In:Hobson P N, Stewart C S(Eds), Rumen Microbial Eeosystem. London, UK: Blaekie Aeademic & Professional, 1997:140-195.

EvaluationofFungalDiversityinRumenofYellowCattle(Bostaurus)FedMiscanthussinensisorCommonMixedFeedstuff

LI Ya-dan1,2,YANG Hui1,LU Xiang-yang1,TIAN Yun1*

(1.College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Hunan Changsha 410128, China；2.College of Environmental Science, Changsha Environmental Protection College, Hunan Changsha 410004, China)

【Objective】This study aimed to detect whetherMiscanthussinensiscould increase the special population of rumen fibrolitic fungi. 【Methods】The experiment was conducted by constructing two 18S rRNA gene libraries using ruminal samples from yellow cattle fed with either common mixed feedstuff (group C) orM.Sinensis(group M), and the diversity of ruminal fungi in the rumens of cattle of both groups was identified. 【Results】Based on the comparative analysis of these two groups, the fungal composition in group C/M was found to be: there wereOrpinomycessp.,Sarocladiumzeae,Aspergillusniger,Piromycessp.,Alternariaalternata,Candidacastellii,Ascomycotasp.,Gibellulopsisnigrescens,Neosartoryaudagawaein rumen of mixed forage feeding cattle, in contrast, the species in rumen ofMiscanthussinensisfeeding cattle was concentrated relatively:Orpinomycessp.,Piromycessp.,Neocallimastixfrontalis,Microdochiumsp..【Conclusion】Feeding cattle withM.sinensiswill change the fungal composition in the rumen; the increased fungi may be responsible for digestingM.sinensis, which will benefit us in further screening of potentially valuable bio-enzymes.

Cattle；Rumen；Miscanthussinensis；18S rRNA；Fungi

1001-4829(2017)10-2371-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.10.035

2016-12-05

湖南省戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)關(guān)鍵共性技術(shù)導(dǎo)向類項目(2015GK1017)；湖南省教育廳科學(xué)研究項目(15K058, 16C0018)

李亞丹(1984-)，女，河北石家莊人，博士研究生，工程師，環(huán)境微生物技術(shù)，E-mial: 469480533@qq.com；*為通訊作者：田 云，男，湖南沅江人，博士研究生，教授，微生物學(xué)，E-mial: tianyun@hunau.edu.cn。

S182

A

(責(zé)任編輯 李 潔)