李彥宏，胡深強，王 杰，賈先波，賴松家

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物遺傳育種研究所，四川 成都 611130)

家兔ANGPTL4基因多態(tài)性及其與生長性狀的關(guān)聯(lián)性分析

李彥宏，胡深強，王 杰，賈先波，賴松家*

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物遺傳育種研究所，四川 成都 611130)

【目的】探究家兔血管生成素樣蛋白4(angiopoietin-like protein 4, ANGPTL4)基因第6外顯子內(nèi)的多態(tài)性及其與家兔部分生長性狀的關(guān)聯(lián)性?！痉椒ā坎捎肞CR產(chǎn)物測序法檢測家兔ANGPTL4基因外顯子內(nèi)的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)位點，并應(yīng)用PCR-RFLP酶切分型技術(shù)對3個家兔品種(天府黑兔、伊拉兔和新西蘭兔)共495個群體樣本進行酶切分型，分析SNPs與3個家兔品種部分生長性狀的關(guān)聯(lián)性。【結(jié)果】ANGPTL4基因第6外顯子中共檢測發(fā)現(xiàn)3個遺傳變異位點(c.823 G>A為非同義突變，c.867 T>C和c. 975 T>C均為同義突變)，且完全處于連鎖狀態(tài) (r2≥0.75)，由此選擇c.823 G>A位點作為遺傳效應(yīng)分析位點。關(guān)聯(lián)性分析得出3個家兔群體內(nèi)AG基因型和GG基因型與3個品種部分生長性狀具有較高的遺傳效應(yīng)。【結(jié)論】ANPGTL4基因可以是與家兔生長發(fā)育相關(guān)的候選基因，以此為培育肉兔新品種提供輔助分子遺傳選擇依據(jù)。

ANGPTL4基因；多態(tài)性；生長性狀；關(guān)聯(lián)性分析；家兔

【研究意義】血管生成素樣蛋白4(Angiopoietin-like protein4,ANGPTL4)被許多研究證實并歸類于類血管生成素家族，是調(diào)控脂肪細胞分化的重要信號分子。而在家兔ANGPTL4基因研究中已被測出全長為4971 bp，且含7個外顯子，同時可以編碼411個氨基酸。早期研究發(fā)現(xiàn)ANGPTL4蛋白的表達具有選擇性，分別在脂肪組織和胚胎中集中表達。而在不同來源的脂肪組織中表達也不一樣，如只表達于內(nèi)臟脂肪組織，其他器官脂肪組織(心臟、肝臟、肺、腎)少量表達[1]。ANGPTL4對脂肪組織的形成起抑制作用，其原因有可能是ANGPTL4蛋白產(chǎn)生水解作用，進一步纏繞折疊成卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域和纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)的小片段產(chǎn)物，從而引起脂肪細胞分化發(fā)生改變[2]。脂肪酸的氧化和解耦聯(lián)作用已被證實對脂肪組織降解起重要作用。在脂肪組織形成的過程中，過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR-α、PPAR-β和PPAR-γ)可以在脂肪組織中產(chǎn)生解耦聯(lián)作用降低脂質(zhì)的含量，而ANGPTL4基因在脂肪組織中過表達后可以通過調(diào)節(jié)脂肪酶的活性去調(diào)節(jié)脂肪代謝，從而調(diào)節(jié)器官組織內(nèi)的脂肪酸和甘油三酯的形成，使組織內(nèi)脂肪含量得到有效降解[3-5]?！厩叭搜芯窟M展】Yoon等[6]的研究表明ANGPTL4是PPAR-α和PPAR-γ的下游因子，對血管生成和代謝具有重要促進作用。在肝臟、心臟、骨骼肌和腸中， PPAR-α、PPAR-γ和缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1(hypoxiain duciblefa)可以通過激活A(yù)NGPTL4基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控脂類物質(zhì)的代謝[7]。ANGPTL4基因的cSNPs位點已在人類和小鼠中發(fā)現(xiàn)其與體脂率的高低有明顯的相關(guān)性。legry等[4]在人的研究中發(fā)現(xiàn)ANGPTL4基因rs4076317位點的具有多態(tài)性，并與青年的體脂率顯著性相關(guān)聯(lián)，這些多態(tài)性位點均與PPARγ表達高低有關(guān)。Kim等[8]也在小鼠的中發(fā)現(xiàn)ANGPTL4基因表達水平與小鼠的體重升高呈正相關(guān)?！颈狙芯壳腥朦c】因此，ANGPTL4基因?qū)游餀C體的脂肪能量代謝以及生長發(fā)育中起重要作用。由此ANGPTL4基因可能與家兔的生長性狀可能存在密切聯(lián)系?！緮M解決關(guān)鍵問題】由此檢測了家兔ANGPTL4基因的遺傳變異位點，并分析了與3個家兔品種生長性狀的聯(lián)系，為家兔分子標記輔助育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所選3個肉兔品種: 新西蘭兔172只、天府黑兔165只、伊拉兔158只。所有試驗家兔均隨機從四川農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)基地選取健康無疾病、3代之內(nèi)無親緣關(guān)系的家兔。所選3個家兔群體的飼養(yǎng)和管理均保持一致，并做好防疫工作。所購飼料購自四川金川農(nóng)飼料有限公司的肉兔全價顆粒飼料，試驗期間家兔自由采食飲水，并測定35、42、56、70和84日齡5個階段的個體體重數(shù)據(jù)。試驗結(jié)束后剪取家兔部分耳組織塊，放入添加有75 %酒精的1.5 mL的無菌EP管內(nèi)，并盡快置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA的提取

本試驗使用DNA試劑盒(TIANGEN, Beijing)對3個家兔品種群體內(nèi)共計495份樣本的DNA進行了提取，并使用核酸蛋白分析儀分析DNA濃度(OD260/OD280在1.7～1.8)和1.5 %瓊脂糖電泳實驗分析DNA的提取效果，提取完畢使其儲存于-20 ℃低溫冰箱備用。

1.3 引物設(shè)計和PCR擴增

參照在NCBI上家兔ANGPTL4基因的DNA序列(GenBank 登錄號：NW_003159393)，利用Primer Premier5.0軟件對ANGTL4基因外顯子6設(shè)計引物(表1)。

隨機選取30個DNA樣本進行PCR擴增。PCR擴增體系為10 μl，其中包含5 μl 2×TaqPCR MasterMix，F(xiàn)/R引物各0.4 μl，DNA模板1 μl以及3.2 μl滅菌超純水，PCR反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸50 s，38個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，12 ℃保存。以上引物和所得PCR擴增產(chǎn)物均由成都市擎科生物有限公司進行引物的合成和產(chǎn)物的測序。

1.4 PCR產(chǎn)物測序和SNP位點篩選

隨機選取3個家兔品種群體內(nèi)30個DNA樣本，對ANGPTL4基因的第6外顯子進行PCR擴增，然后收集樣品的PCR產(chǎn)物在成都市擎科生物有限公司進行純化驗證，并使用SeqMan軟件和Chromas軟件分析變異位點。應(yīng)用Haplo View軟件使所測SNP位點的連鎖不平衡得到確定。

1.5 PCR-RFLP基因分型

本試驗使用在線軟件WatCut(http://watcut.uwaterloo.ca/template.php?act=snp_new)對所需限制性內(nèi)切酶的進行初步選擇，并使用Primer Premier5.0確定其特異性，由此本試驗優(yōu)先選擇Cfr42I酶(SacII)(貨號：ER0202)(購自賽默飛世爾科技公司)使遺傳變異位點得到準確的酶切分型結(jié)果。酶切體系為10 μl：10×FastDigest Green Buffer 1.0 μl，20×Oligonucleotide(0.01 mM) 0.5 μl，PCR產(chǎn)物3.0 μl，Cfr42I (SacII)酶 0.3 μl，ddH2O 5.2 μl。然后酶切體系輕輕搖勻離心后靜置于37 ℃恒溫水浴鍋中60～80 min，完畢后取出所得混合物，采用瓊脂糖凝膠電泳(1.5 %)檢測PCR產(chǎn)物片段酶切結(jié)果，并在膠圖上做好基因型標記，以便用于統(tǒng)計分析。

表1 PCR引物引物信息

小寫字母a、b和c分別代表c.823 G>A、c.867 T>C和c. 975 T>C The lowercase abc represent the sites c.823 G>A, c.867 T>C and c. 975 T>C, respectively圖1 ANGPTL4基因測序結(jié)果Fig.1 The sequencing consequence of ANGPTL4 gene

圖2 ANGPTL4蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.2 The domain prediction of ANGPTL4 protein

1.6 數(shù)據(jù)處理

本試驗使用SPSS 22.0軟件中的一般線性模型(general linear model，GLM)程序用于分析ANGPTL4基因的SNP位點與3個家兔品種的生長性狀之間的遺傳效應(yīng)，數(shù)據(jù)分析結(jié)果用最小二乘均數(shù)±標準誤(mean ± SE)表示。

Yijk=μ+Gi+Bj+Sk+eijk

其中：Yijk和Yjk代表個體生長性狀測量值；μ代表群體平均數(shù)；Gi代表基因型效應(yīng)；Bj代表品種效應(yīng)；Sk代表性別效應(yīng)；eijk代表隨機誤差。

2 結(jié)果與分析

2.1 ANGPTL4基因SNP位點檢測

如圖1所示，第6外顯子內(nèi)存在3個遺傳變異位點(c.823 G>A、c.867 T>C和c. 975 T>C)，其中c.823 G>A為錯義突變，c.867 T>C和c. 975 T>C均為同義突變。

2.2 家兔ANGPTL4基因遺傳位點分析

如圖2所示，3個遺傳變異位點(c.823 G>A，c.867 T>C和c. 975 T>C)均位于FBG結(jié)構(gòu)域中，這3個突變位點可能會對ANGPTL4蛋白的功能產(chǎn)生影響，由此需要進一步對SNPs進行連鎖平衡分析。

如圖3所示，c.823 G>A與c.867 T>C、c. 975 T>C處于完全連鎖狀態(tài)，且具有相似的遺傳效應(yīng)，其中c.823 G>A與其余兩個SNPs連鎖程度非常強(r2值分別為0.89和0.82)。由此本試驗最后選擇c.823 G>A點作為ANGPTL4基因的候選SNP進行后續(xù)研究。

2.3 PCR-RFLP分型

利用PCR-RFLP分別對天府黑兔、伊拉兔和新西蘭兔共計495份樣本DNA中ANGPTL4基因c.823 G>A位點進行酶切分型。所使用限制性內(nèi)切酶為Cfr42I (SacII)(貨號：ER0202)購于賽默飛世爾科技公司(Thermo Fisher Scientific)。使用1.5 %瓊脂糖凝膠電泳所得酶切分型結(jié)果如圖4所示，依次分別呈現(xiàn)GG基因型、AA基因型和AG基因型。

SNP1-3分別代表c.823 G>A、c.867 T>C和c. 975 T>CSNP1-3 represent c.823 G>A, c.867 T>C and c. 975 T>C圖3 ANGPTL4基因SNPs 連鎖不平衡分析Fig.3 Linkage disequilibrium analysis of SNPs in ANGPTL4 gene

2.4 家兔ANGPTL4基因SNP位點與生長性狀的相關(guān)性

通過統(tǒng)計所得c.823 G>A位點的基因頻率、基因型頻率和遺傳參數(shù)及卡方檢驗χ2的統(tǒng)計結(jié)果。

如表2所示，c.823 G>A位點分別在3個家兔品種內(nèi)發(fā)現(xiàn)G和A等位基因和AA、AG和GG基因型，其中G等位基因和GG基因型均具有優(yōu)勢效應(yīng)。而c.823 G>A遺傳多態(tài)性位點在每個家兔群體內(nèi)的PIC均為中度多態(tài)(0.25A位點在3個品種內(nèi)中的選擇潛力較大。通過卡方檢驗結(jié)果得出該位點存在Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)(P>0.05)，可進一步分析與該位點相關(guān)的遺傳效應(yīng)。

2.5 c.823 G>A位點與家兔生長性狀的關(guān)聯(lián)性分析

對c.823 G>A位點與3個品種家兔群體樣本的35～84日齡階段的個體重進行關(guān)聯(lián)性分析(表3)，表明在天府黑兔群體中AG基因型樣本群體在5個生長階段個體重顯著高于其它2個基因型，但GG群體日增重呈極顯著(P<0.01)；在伊拉兔樣本群體內(nèi)，AG型群體樣本的體重均值在70日齡階段高于其它兩個，并且日增重高于AA(P<0.05)。而GG型個體在后期3個階段(56～84日齡)的體重均值高于AA型和AG型，且日增重極顯著(P<0.01)；在新西蘭兔群體內(nèi)，兩組樣本群體(AG型和GG型)在84日齡階段體重均值和日增重均呈顯著(P<0.05)。

圖4 ANGPTL4基因c.823 G>A位點酶切分型結(jié)果Fig.4 The typing result of ANGPTL4 gene c.823 G>A loci by RFLP

3 討 論

3.1 ANGPTL4基因多態(tài)性分析

本試驗發(fā)現(xiàn)ANGPTL4基因的第6個外顯子中存在3個變異位點(c.823 G>A，c.867 T>C和c. 975 T>C)均位于ANGPTL4基因所特有的FBG結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域位于纖維蛋白原中的β和γ鏈的C端，其分別由α、β和γ 3條多肽鏈的N端通過二硫鍵連接組成[9]。3條鏈的C端各自形成一個球狀區(qū)域，在血液凝集過程中凝集下游信號因子的作用，其中β和γ鏈的C端結(jié)構(gòu)域基本相同，即為FBG結(jié)構(gòu)域[10]。而這3個SNPs均位于FBG結(jié)構(gòu)域，由此推測SNPs對ANGPTL4蛋白結(jié)構(gòu)域的功能具有一定影響，從而對家兔生長發(fā)育具有一定影響。而進一步分析發(fā)現(xiàn)3個SNPs位點(c.823 G>A、c.867 T>C和c. 975 T>C)高度連鎖，由此這3個位點具有相似的遺傳效應(yīng)。因此，本試驗最終選擇非同義突變c.823 G>A位點作為候選SNP進行后續(xù)研究。

表2 ANGPTL4基因SNP c.823 G>A位點基因頻率與基因型頻率

表3 ANGPTL4基因c.823 G>A位點對生長性狀的遺傳效應(yīng)分析

注：35 W、42 W、56W、70 W和84 W分別表示35日齡、42日齡、56日齡、70日和84日齡體重；ADG表示35～84日齡平均日增重;小寫字母(ab)和大寫字母(AB)分別表示差異性顯著(P<0.05)和差異極顯著(P<0.01)；TFBR、YLR和NZR分別表示天府黑兔、伊拉兔和新西蘭兔。

Note: 35 W, 42 W, 56, 70 W, and 84 W represent the body weight of 35, 42, 56, 70 and 84 days of age respectively; ADG represents the average daily gain from 28 to 84 days of age. Lower case letters (ab) and capital letters (AB) indicated significant difference (P<0.05) and significant difference (P<0.01); TFBR, YLR and NZR represent the rabbit breed Tianfu black rabbit, IRA rabbit and New Zealand rabbit, respectively.

以參照多態(tài)信息含量(polymorphism information content,PIC)指標為依據(jù)，對c.823 G>A位點在3個家兔品種內(nèi)的基因多態(tài)性分析表明該位點在各個群體中均表現(xiàn)為中度多態(tài)(0.25A位點具有較高的選擇潛力，需要與家兔的生長性狀的進行關(guān)聯(lián)性分析。

3.2 ANGPTL4基因與家兔生長性狀相關(guān)性分析

ANGPTL4基因在機體的生長代謝過程中具有重要作用，其可以調(diào)節(jié)血管的生成、脂類物質(zhì)的代謝以及糖類代謝平衡[12]。侯飛等通過檢測多個牛品種(南陽牛、郟縣紅牛、魯西牛等)的ANGPTL4基因編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)存在4個遺傳變異位點，其中，1422 T>C為錯義突變，而其它3個均為同義突變。通過關(guān)聯(lián)性分析表明c. 1422 T>C位點多態(tài)性與不同牛品種的體重呈正相關(guān)[13]。張靜等通過檢測ANGPTL4基因非編碼區(qū)在廣靈大尾羊和小尾寒羊的遺傳變異位點分析發(fā)現(xiàn)存在8個SNPs，其中-1691 C>G和-577 T>G 2個顛換的等位基因頻率在品種之間存在顯著差異。而-1691 C>G和-1625 G>A均以正向超顯性遺傳方式影響綿羊尾長、宰前體重和胴體重，而以負向超顯性效應(yīng)的方式影響廣靈大尾羊的屠宰率[14]。而在本試驗中發(fā)現(xiàn)家兔群體樣本中非同義突變c.823 G>A位點對3個家兔品種的后期增重具有較高的遺傳效應(yīng)，2種基因型(AG和GG)在3個家兔品種中的增重優(yōu)勢明顯，且GG基因型所占群體的日增重極顯著(P<0.01)。因此，c.823 G>A位點與3個家兔品種的生長發(fā)育相關(guān)性明顯。ANGPTL4基因的c.823 G>A位點使絲氨酸(Ser)→甘氨酸(Gly)，從而有可能改變了ANGPTL4蛋白的構(gòu)象和功能。這Ser和Gly在人體內(nèi)屬于非必需氨基酸，而非必需氨基酸在生物代謝過程中也具有重要影響，其中Gly是一種抑制性較強的神經(jīng)遞質(zhì)，在信息傳導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用。當細胞收到刺激后，它通過對神經(jīng)傳導(dǎo)過程中的Na+/K+離子通道的啟閉，從而抑制細胞的信號傳導(dǎo)。而研究證實Gly與動物細胞的免疫和應(yīng)激有密切聯(lián)系，其可能是通過抑制Ca+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、阻止炎癥因子被激活、減少氧應(yīng)激反應(yīng)等其它協(xié)同保護機制[15-16]。因此，在家兔的能量代謝中，ANGPTL4基因c.823 G>A位點有可能直接或間接影響了基因的轉(zhuǎn)錄翻譯過程以及蛋白質(zhì)的構(gòu)象，進一步使蛋白功能增強，從而使家兔在不同的生長階段的日增重起促進作用[17-18]，鑒于本試驗所選取的品種和樣本量有限，其潛在的生物學(xué)效應(yīng)仍需進一步研究。

4 結(jié) 論

ANGPTL4基因的第6外顯子上存在3個SNPs，其中c.823 G>A為非同義突變，c.867 T>C和c. 975 T>C均為同義突變，且3個位點完全連鎖。c.823 G>A遺傳變異分析發(fā)現(xiàn)存在A和G等位基因和AA、AG和GG基因型，其中G和GG均具有優(yōu)勢遺傳效應(yīng)。該c.823 G>A位點的關(guān)聯(lián)性分析表明2種基因型(AG和GG)與所選3個家兔群體樣本部分生長性狀呈顯著(P<0.05)，且GG基因型的平均日增重呈極顯著(P<0.01)。因此，ANGPTL4基因可以作為改良家兔生產(chǎn)性能的候選基因。

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PolymorphismsofANGPTL4GeneandItsAssociationwithGrowthTraitsinRabbits

LI Yan-hong, HU Shen-qiang, WANG Jie, JIA Xian-bo, LAI Song-jia*

(Institute of Animal Genetics and Breeding, Sichuan Agricultural University, Sichuan Chengdu 611130，China)

【Objective】 The aim of this study was to investigate the association between polymorphisms in the angiopoietin like protein 4 (ANGPTL4) gene and growth traits of domestic rabbits. 【Method】 The polymerase chain reaction (PCR) products were first screened for single nucleotide polymorphisms (SNPs) of rabbitANGPTL4 gene by direct DNA sequencing, and the PCR-restriction fragment length polymorphism (RFLP) assay was further used for genotyping of a total of 459 samples from three meat rabbit breeds (Tianfu Black, IRA and New Zealand rabbits). Thereafter, the association of polymorphisms in this gene with growth traits was evaluated. 【Result】 Our results showed that three SNPs, including a non-synonymous mutation c.823 G>A and two synonymous mutations c.867 T>C, and c. 975 T>C, were detected in exon 6 ofANGPTL4. Owing to a completely linkage relationship (r2≥ 0.75) among these three SNPs, only the c.823 G>A was selected for analysis of genetic effects. The association analysis of its genotypes with growth traits revealed that the genotypes of AG and GG were strongly correlated with some growth traits in three breeds of rabbits. 【Conclusion】 These data suggested thatANPGTL4 could be a candidate gene affecting rabbit growth and the SNP c.823 G>A might be used as a potential genetic marker in rabbit breeding.

ANGPTL4 gene; Polymorphism; Growth traits; Association analysis; Rabbit

1001-4829(2017)10-2382-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.10.037

2016-12-26

國家兔產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)(CARS-44-A-2)

李彥宏(1990-)，男，碩士研究生，從事家兔遺傳育種研究方向，417590007@qq.com，*為通訊作者，E-mail: laisj5794@163.com。

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(責任編輯 李 潔)