干腌火腿的蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展

張敬竟+劉姝韻+王桂瑛+程志斌+谷大海+徐志強(qiáng)+普岳紅+廖國周

摘 要：干腌火腿是一種重要的傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品，其在長達(dá)10 個多月的加工過程中會發(fā)生顯著的蛋白質(zhì)降解現(xiàn)象，并產(chǎn)生大量小分子肽類與游離氨基酸。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)以其高通量、高靈敏度及高準(zhǔn)確性的特點(diǎn)被越來越多地應(yīng)用于發(fā)酵肉制品蛋白質(zhì)降解研究領(lǐng)域。本文主要綜述了干腌火腿加工過程中蛋白質(zhì)降解的研究進(jìn)展，旨在為干腌火腿的品質(zhì)調(diào)控提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：干腌火腿；蛋白質(zhì)組學(xué)；蛋白質(zhì)降解

Progress in Proteomic Research of Protein Degradation in Dry-Cured Ham

ZHANG Jingjing1，2， LIU Shuyun1，2， WANG Guiying1，2， CHENG Zhibin2， GU Dahai1，2， XU Zhiqiang1，2， PU Yuehong1，2，*， LIAO Guozhou1，2，*

（1. College of Food Science and Technology， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China；

2. Livestock Product Processing Engineering and Technology Research Center of Yunnan Province， Kunming 650201， China）

Abstract： Dry-cured ham is an important traditional fermented meat product of China. Significant protein breakdown occurs to produce a large quantity of small peptides and free amino acids during the processing of dry-cured ham， which lasts as long as over 10 months. Proteomics technology has been increasingly applied in the field of research on protein degradation in fermented meat products thanks to its characteristics such as high throughput， sensitivity and accuracy. This paper focuses on a review of recent progress in the research on protein degradation during the processing of dry-cured ham with the aim of providing a reference for the quality control of dry-cured ham.

Key words： dry-cured ham； proteomics； protein degradation

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201708012

中圖分類號：TS251.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2017）08-0060-04

干腌火腿是以豬后腿為原料，經(jīng)以食鹽為主的腌制劑干腌、干燥脫水和發(fā)酵成熟等主要工藝加工而成的一種具有典型質(zhì)地和風(fēng)味的肉制品，是最重要的傳統(tǒng)肉制品類別之一。世界上著名的干腌火腿有西班牙的伊比里亞火腿和索娜拉火腿、法國的巴約納火腿和科西嘉火腿以及中國的金華火腿和宣威火腿等[1]。干腌火腿需要經(jīng)歷長達(dá)10 個月或更長時間的加工過程，在這一過程中火腿本身會發(fā)生一系列生物化學(xué)反應(yīng)，并形成其最終的特征質(zhì)地和風(fēng)味[2]。

在干腌火腿漫長的加工過程中，火腿中的肌肉蛋白質(zhì)和脂肪發(fā)生了復(fù)雜的生物化學(xué)和物理化學(xué)變化，其中最重要的變化就是蛋白質(zhì)的水解和脂肪的氧化分解[3]。蛋白質(zhì)水解是內(nèi)源酶導(dǎo)致的肌肉蛋白質(zhì)的降解，是迄今為止干腌火腿加工過程中被研究最多的生物化學(xué)現(xiàn)象[4-5]，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、二維凝膠電泳（two-dimensional gel electrophoresis，2-DGE）和高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）是用于研究干腌火腿加工過程中的蛋白質(zhì)變化、蛋白質(zhì)分離及鑒定所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)片段，從而探究其風(fēng)味物質(zhì)形成機(jī)理的最常用手段[6-8]。本文主要對運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析干腌火腿的蛋白質(zhì)降解規(guī)律及其多肽鑒定的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，旨在為干腌火腿的品質(zhì)調(diào)控提供參考依據(jù)。

1 干腌火腿的加工工藝

世界各國的干腌火腿加工普遍使用鹽處理作為保存、干燥和加工的工藝手段，其主要目的是獲得高附加值的產(chǎn)品，并且由于此種工藝所得產(chǎn)品的安全性高、感官特性良好，因此被消費(fèi)者所贊賞，產(chǎn)品特性受原料和工藝過程的調(diào)節(jié)[9]。雖然國際上對干腌火腿進(jìn)行加工的條件不同，但其實(shí)質(zhì)均在于保持產(chǎn)品性質(zhì)的穩(wěn)定，以確保消費(fèi)的安全性，同時促進(jìn)產(chǎn)品感官特性的發(fā)展。

圖1為Parma火腿的典型加工工藝流程，食鹽在腌制期間逐步滲透進(jìn)入原料肉，然后在烘干過程中通過火腿進(jìn)行擴(kuò)散，烘干結(jié)束時到達(dá)火腿內(nèi)部，熟化和陳化期間的溫度和濕度條件能夠促進(jìn)火腿中的生物化學(xué)反應(yīng)[10]。蛋白質(zhì)水解和脂肪氧化分解是干腌火腿風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生的主要來源。在干腌火腿加工期間發(fā)生的主要生化反應(yīng)為酶促反應(yīng)，包括肌肉蛋白質(zhì)水解、三?；视秃土字M分水解、葡萄糖水解和核苷酸轉(zhuǎn)化[11]。美拉德反應(yīng)、Strecker降解反應(yīng)和一些風(fēng)味前體物質(zhì)的氧化分解反應(yīng)也在該過程中發(fā)生，這些生物及化學(xué)反應(yīng)均有助于產(chǎn)品最終質(zhì)構(gòu)、色澤和風(fēng)味特征的形成[12]。endprint

2 干腌火腿加工過程中的蛋白質(zhì)降解

蛋白質(zhì)降解是干腌火腿加工過程中重要的生化反應(yīng)過程，受工藝過程中的含鹽量、水分活度和溫、濕度的影響，這一過程中參與蛋白質(zhì)降解的內(nèi)源酶主要是組織蛋白酶B、L、D及鈣酶、肌肉二肽酶和氨肽酶等[13]。由圖2可知，內(nèi)肽酶通過切割完整的蛋白質(zhì)降解肌肉蛋白質(zhì)，產(chǎn)生能夠被肽鏈外切酶進(jìn)一步降解的大分子多肽。肌肉內(nèi)肽酶（如組織蛋白酶和鈣酶）的作用直接決定宰后肌肉紋理的變化[14]，宰后肌肉成熟過程中Z盤肌原纖維破碎，蛋白質(zhì)的降解增加了肉的柔軟性。組織蛋白酶B、H、L在干腌火腿加工15 個月后仍具有活性[15-16]，而組織蛋白酶D的活性在加工6～10 個月后消失[17-18]。組織蛋白酶的活性對火腿的質(zhì)地有顯著影響，其活性過高時易導(dǎo)致火腿中蛋白質(zhì)的過度降解，從而破壞肌肉結(jié)構(gòu)，使火腿出現(xiàn)漿糊狀的質(zhì)地缺陷，損害火腿的感官品質(zhì)[19]。鈣酶僅在腌制過程的第1階段參與肌肉蛋白質(zhì)的水解，其穩(wěn)定性較低且在2 周左右活性消失。氨肽酶在火腿加工12 個月后仍能檢測到活性，這也是火腿加工后期游離氨基酸含量顯著增加的原因。

3 干腌火腿加工過程所產(chǎn)肽類的鑒定

3.1 肽類的分離方法

干腌火腿蛋白質(zhì)在酶的作用下逐步水解為多肽，這一過程控制著干腌火腿風(fēng)味的形成速率。多肽的分子質(zhì)量與加工期長短有關(guān)，趙改名等[20]對索娜拉火腿的研究表明，多肽存在4 500～2 700 D、2 700～1 200 D、1 200～500 D、500～375 D和375～160 D 5 個分子質(zhì)量范圍?；鹜戎卸嚯牡姆旨壓头蛛x對于后續(xù)的質(zhì)譜分析至關(guān)重要，使用高分辨率凝膠電泳，如小分子SDS-PAGE（tricine SDS-PAGE），可以將火腿風(fēng)干期間由于蛋白質(zhì)劇烈水解而產(chǎn)生的小蛋白片段、多肽和寡肽分離到1～30 kD的范圍[21]。廖國周等[22]采用2-DGE分析宣威火腿的蛋白質(zhì)組，共發(fā)現(xiàn)1 749 個蛋白點(diǎn)。Lametsch等[23]發(fā)現(xiàn)豬肉肌紅蛋白在宰后貯藏期間及干腌火腿加工期間發(fā)生顯著降解。Picariello等[24]使用2-DGE研究加工12 個月的巴約納火腿，發(fā)現(xiàn)樣品中的肌紅蛋白發(fā)生部分水解，磷酸甘油酸激酶（phosphoglycerate kinase，PGK）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、糖原磷酸化酶（glycogen phosphorylase，muscle associated，PYGM）和肌酸激酶（creatine kinase，CK）完全水解，烯醇化酶和磷酸甘油酸變位酶（phosphoglycerate mutase，PGAM）直到火腿風(fēng)干結(jié)束后仍然存在，而丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）是唯一在11 個月的干燥期后含量保持恒定的酶。

干腌火腿風(fēng)干期間所產(chǎn)肽類的序列鑒定通常需要進(jìn)一步的分離技術(shù)或與色譜技術(shù)結(jié)合，以純化這一過程中產(chǎn)生的包含肽和蛋白質(zhì)的復(fù)雜混合物?？臻g排阻色譜法（size exclusion chromatography，SEC）是一種非常簡便的方法，火腿中的蛋白質(zhì)經(jīng)酸、有機(jī)溶劑或加熱產(chǎn)生沉淀后，可以使用SEC對從火腿中提取出的一定平均分子質(zhì)量的肽進(jìn)行一級分餾[25-26]。二級分餾方法，如反向高效液相色譜（reversed phase-HPLC，RP-HPLC）已經(jīng)與SEC組合使用，可以使目標(biāo)肽得到精確分離，并且避免在隨后的質(zhì)譜分析中出現(xiàn)電離抑制現(xiàn)象。Shimonishi等[27]將質(zhì)譜和埃德曼降解結(jié)合，并針對該方法開發(fā)了計(jì)算程序，能夠?qū)﹄亩位旌衔镞M(jìn)行測序。Sentandreu等[28]通過凝膠過濾色譜法分離干腌火腿中的水溶性提取物，并通過RP-HPLC和陽離子交換色譜法分離最高濃度的肽級分，然后結(jié)合自動埃德曼降解法從N末端對包含2、3、4 個氨基酸的小肽進(jìn)行測序。Sforza等[29]通過RP-HPLC和質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）鑒定從帕爾馬干腌火腿中分離出低于500 D的寡肽，研究苦味和某些二肽（如Gly-Phe、Glu-Leu和Glu-Ile）之間的關(guān)系以及成熟風(fēng)味與Glu-Tyr的相關(guān)性。Hughes等[30]使用SDS-PAGE和RP-HPLC作為定性方法，通過自動埃德曼降解測序從半干發(fā)酵香腸產(chǎn)生的肌質(zhì)蛋白（肌紅蛋白和CK）和肌原纖維蛋白（肌鈣蛋白-I、肌鈣蛋白-T和肌球蛋白輕鏈-2）中分離出5 個包含151～381 個氨基酸的結(jié)構(gòu)肽。

3.2 肽類的測序方法

基于蛋白質(zhì)組學(xué)研究，肉和肉制品中最常用的研究方法為使用限定的蛋白水解酶（如胰蛋白酶）將蛋白質(zhì)消化成肽后，用基質(zhì)輔助激光解吸電離-串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight/time of flight-mass spectrometry，MALDI-TOF/TOF-MS）獲取肽質(zhì)量指紋圖譜[31]。?krlep等[32]根據(jù)基因型、食鹽含量和發(fā)黏程度，使用2-DGE比較來自干腌火腿股二頭肌的蛋白質(zhì)級分，并通過MALDI-TOF/TOF中的蛋白質(zhì)質(zhì)量指紋圖譜對蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定。di Luccia等[33]使用SDS-PAGE和MALDI-TOF-MS研究干腌火腿成熟期間肌動蛋白、原肌球蛋白和肌球蛋白輕鏈的變化規(guī)律，同時采用二維乙酸-尿素-Triton聚丙烯酰胺凝膠電泳（two dimensional acetic acid-urea-triton polyacrylamide gel electrophoresis，2D-AUT PAGE）和MALDI-TOF-MS作為主要分離技術(shù)，用肽質(zhì)量指紋圖譜鑒定從干腌火腿中分離的共13 種肌漿蛋白。結(jié)果表明，干腌火腿成熟過程中肌原纖維蛋白和肌質(zhì)蛋白逐漸消失。Théron等[34]研究了巴約納干腌火腿的股二頭肌和半膜肌肌肉的蛋白質(zhì)組學(xué)特征，成功分離了其中的蛋白質(zhì)和多肽，并使用endprint

SDS-PAGE精確確定其分子質(zhì)量和濃度。通過分析不同處理時間干腌火腿的蛋白質(zhì)質(zhì)量指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)半膜肌和股二頭肌中分別有43 個和30 個蛋白質(zhì)被確定為過度表達(dá)。

用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)獲得的數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫中包含的理論序列匹配可以更快、更可靠地鑒定肽的序列。RP-HPLC與級分收集器串聯(lián)可以分離和純化主色譜峰，實(shí)現(xiàn)肽混合物的分離和純化，用于隨后的LC-MS/MS分析[35]。干腌火腿成熟期間鑒定天然產(chǎn)生的肽最常見的方法之一是通過SEC和RP-HPLC進(jìn)行肽復(fù)雜混合物的分離，隨后通過MALDI-TOF測定感興趣級分中所含肽的分子質(zhì)量[36]。Mora等[37]使用具有反相毛細(xì)管柱的納米液相色譜法分離干腌火腿加工過程中產(chǎn)生的肽，并使用電噴霧四級桿飛行時間質(zhì)譜（electrospray ionization-qudropole/time-of-flight

mass spectrometry，ESI-Q/TOF MS）進(jìn)行分析，首次在干腌火腿中實(shí)現(xiàn)使用四極桿/離子阱質(zhì)譜儀對肌原纖維蛋白和肌球蛋白輕鏈特定肽序列的測序，鑒定出肌動蛋白的4 個蛋白質(zhì)片段。干腌火腿中的肌質(zhì)蛋白（如CK和糖酵解酶體）也可以使用ESI-Q/TOF MS進(jìn)行鑒定。

Mora等[38]用MALDI-TOF/TOF-MS對干腌火腿中肌鈣蛋白-T的蛋白片段進(jìn)行鑒定及測序，其研究結(jié)果能夠證實(shí)其他研究者在對豬后腿宰后及宰后成熟期間的蛋白質(zhì)進(jìn)行研究時所發(fā)現(xiàn)的位點(diǎn)是肌鈣蛋白-T的切割位點(diǎn)。

4 結(jié) 語

目前國內(nèi)外對干腌火腿的研究主要集中在以下三方面：1）改善火腿加工工藝，縮短火腿生產(chǎn)周期；2）調(diào)控蛋白質(zhì)水解程度，生產(chǎn)高品質(zhì)火腿；3）降低火腿中的食鹽含量[39]。對干腌火腿加工過程中的生物化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行研究有助于了解蛋白質(zhì)水解和肽類產(chǎn)生的機(jī)制，從而調(diào)控蛋白質(zhì)水解，提升火腿的風(fēng)味及品質(zhì)。對干腌火腿加工過程中所產(chǎn)生的肽類進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定和測序有助于了解肌肉蛋白水解酶的作用機(jī)制，闡明火腿中肽、含氮化合物及羰基化合物等組分的生成規(guī)律，鑒定火腿中的特殊風(fēng)味物質(zhì)。優(yōu)化蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法在關(guān)鍵肽的鑒定中具有重要作用，而關(guān)鍵肽可以作為生物標(biāo)志物控制和指導(dǎo)干腌火腿的工業(yè)化生產(chǎn)，將其應(yīng)用于酶反應(yīng)的優(yōu)化，可以使產(chǎn)物達(dá)到最佳質(zhì)量，從而提高干腌火腿產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)效益[40-42]。

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