丁小強(qiáng)，陳麗麗，白春清，袁美蘭，趙利

(江西科技師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，國(guó)家淡水魚加工技術(shù)研發(fā)分中心(南昌)，南昌 330013)

美拉德反應(yīng)對(duì)魚蛋白酶解物抗氧化活性的影響

丁小強(qiáng)，陳麗麗，白春清，袁美蘭，趙利*

(江西科技師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，國(guó)家淡水魚加工技術(shù)研發(fā)分中心(南昌)，南昌 330013)

文章以魚糜漂洗液回收蛋白酶解物為原料，分別與葡萄糖、D-果糖、蔗糖、乳糖反應(yīng)制備美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，探討美拉德反應(yīng)對(duì)酶解物抗氧化活性的影響。以DPPH自由基清除率為指標(biāo)，選出葡萄糖作為美拉德反應(yīng)的最適糖，通過響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)得出最佳反應(yīng)條件：加熱溫度為126.92 ℃、反應(yīng)初始pH為10.39、反應(yīng)時(shí)間為3.89 h、葡萄糖濃度為3 g/dL。在此條件下，羥基自由基清除能力從34.83%增加到61.82%，DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和還原力也有所提高。因此，美拉德反應(yīng)可以提高魚糜漂洗液回收蛋白酶解物的抗氧化能力。

美拉德反應(yīng)；魚蛋白酶解物；DPPH自由基清除率；抗氧化能力

魚糜是我國(guó)水產(chǎn)制品加工中重要的中間原料，在魚糜生產(chǎn)加工中會(huì)產(chǎn)生大量富含蛋白的廢水，蛋白質(zhì)的含量高達(dá)0.9%～2.8%，約占魚肉蛋白的30%～40%[1]。魚糜漂洗液回收蛋白中氨基酸種類齊全，比例均衡，符合 FAO/WHO 推薦的理想蛋白質(zhì)模式，是理想的優(yōu)質(zhì)蛋白[2]。目前，關(guān)于從魚糜漂洗液中回收蛋白的方法報(bào)道較多[3-5]，可是對(duì)回收蛋白進(jìn)行深加工的研究報(bào)道較少，因此有效開發(fā)利用其回收蛋白資源，是一項(xiàng)非常有意義的研究。

有研究表明，一些合成類抗氧化劑可能具有致癌性，很多國(guó)家較少添加到食品加工中[6]。而一些天然抗氧化性物質(zhì)又常因穩(wěn)定性差、成本高、風(fēng)味差等因素，不能廣泛使用在工業(yè)生產(chǎn)中[7]。自20世紀(jì)80年代以來，對(duì)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化性能方面的研究已經(jīng)比較廣泛，但對(duì)回收蛋白酶解物美拉德反應(yīng)的抗氧化性卻少有報(bào)道。

本文以回收蛋白酶解物和不同糖進(jìn)行美拉德反應(yīng)并制備其產(chǎn)物，以DPPH自由基清除率為指標(biāo)，在溫度、pH值、糖濃度、加熱時(shí)間4個(gè)單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)之上，運(yùn)用響應(yīng)面分析法對(duì)回收蛋白酶解物美拉德反應(yīng)工藝進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)比較反應(yīng)前后的抗氧化性質(zhì)，旨在為魚糜漂洗液回收蛋白的深加工利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

漂洗液回收蛋白 實(shí)驗(yàn)室自制；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2'-連氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS) 美國(guó)Sigma 公司；堿性蛋白酶(Alcalase) 北京諾維信生物技術(shù)有限責(zé)任公司；鐵氰化鉀 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三氯乙酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉等試劑 均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

12-H型絞肉機(jī) 上海標(biāo)本模型廠；水熱合成反應(yīng)釜 西安常儀儀器設(shè)備有限公司；85-1型磁力攪拌器 常州國(guó)華電器有限公司；TDL-5A型離心機(jī) 上海菲恰爾分析儀器有限公司；PHS-3C型pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；BSA224S-CW型電子分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 魚糜漂洗液中蛋白的回收

新鮮魚肉絞碎→加水?dāng)嚢?0 min→四層紗布過濾→調(diào)節(jié)漂洗液pH為5.5→5000 r/min離心5 min→回收蛋白。

1.3.2 美拉德反應(yīng)中糖種類的選擇

在酶解物濃度為3 g/dL、糖濃度為1 g/dL、加熱溫度為90 ℃、反應(yīng)時(shí)間為3 h、反應(yīng)初始pH值為8時(shí)，分別選用果糖、葡萄糖、乳糖以及蔗糖與酶解物進(jìn)行美拉德反應(yīng)。

1.3.3 美拉德反應(yīng)的單因素試驗(yàn)

1.3.3.1 初始pH的選擇

選擇葡萄糖進(jìn)行進(jìn)一步美拉德反應(yīng)試驗(yàn)。在酶解物濃度為3 g/dL、糖濃度為1 g/dL、加熱溫度為90 ℃的反應(yīng)條件下，分別調(diào)整反應(yīng)初始pH值為8，9，10，11，12，反應(yīng)3 h后測(cè)定DPPH自由基清除率，確定最適初始pH值。

1.3.3.2 反應(yīng)時(shí)間的選擇

在酶解物濃度為3 g/dL、糖濃度為1 g/dL、加熱溫度為90 ℃、反應(yīng)初始pH值為11的反應(yīng)條件下，分別調(diào)整反應(yīng)時(shí)間為1，2，3，4，5 h，反應(yīng)后測(cè)定DPPH自由基清除率，確定最適反應(yīng)時(shí)間。

1.3.3.3 糖濃度的選擇

在酶解物濃度為3 g/dL、加熱溫度為90 ℃、反應(yīng)初始pH值為11的反應(yīng)條件下，分別調(diào)整糖濃度為1，2，3，4，5 g/dL，反應(yīng)3 h后測(cè)定DPPH自由基清除率，確定最適糖濃度。

1.3.3.4 加熱溫度的選擇

在酶解物濃度為3 g/dL、反應(yīng)初始pH值為11、糖濃度為3 g/dL的反應(yīng)條件下，分別調(diào)整加熱溫度為80，90，100，110，120，130，140 ℃，反應(yīng)3 h后測(cè)定DPPH自由基清除率，確定最適加熱溫度。

1.3.4 響應(yīng)面分析試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用 Box-Behnken 的中心組合[8]，以DPPH自由基清除率為響應(yīng)值，選用時(shí)間、溫度和pH 3個(gè)要素進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平及編碼見表1。

表1 響應(yīng)面分析因子及水平表Table 1 Factors and levels of response surface analysis

1.3.5 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

DPPH自由基清除能力的測(cè)定參照 Tang Chuanhe等[9]的方法，并稍作修改。將適當(dāng)稀釋的樣品2.0 mL及4.0 mL 0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液加入同一試管中均勻混合，室溫避光條件下靜置30 min后于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值(At)?？瞻孜舛戎?Ac)以蒸餾水代替樣品，對(duì)照空白吸光度值(Ab)以乙醇代替DPPH乙醇溶液。DPPH自由基清除率計(jì)算公式如下：

DPPH自由基清除率(%)=[1-(At-Ab)/Ac]×100。

1.3.6 還原力的測(cè)定

還原力的測(cè)定參照 Gu Fenglin等[10]的方法。取適當(dāng)稀釋的樣品2 mL，依次加入2 mL 0.2 mol/LpH 6.6的磷酸鹽緩沖液和及2 mL 1%(W/V)的鐵氰化鉀溶液，混合均勻后于50 ℃下保溫20 min，快速冷卻，加入2 mL 10%(W/V)三氯乙酸溶液混勻，于3000 r/min離心10 min，取上清液2 mL，依次加入2 mL蒸餾水和0.4 mL 0.1%三氯化鐵混勻，靜置10 min后于波長(zhǎng)700 nm處測(cè)定其吸光度值。以吸光度值表示樣品的還原能力，吸光度越大，樣品的還原能力越強(qiáng)。

1.3.7 羥基自由基清除能力的測(cè)定

羥基自由基清除能力的測(cè)定參照沈晗等[11]的方法，并稍作修改。取1 mL 0.75 mmol/L鄰二氮菲乙醇溶液于具塞試管中，依次加入2 mL 0.15 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.40)和1 mL蒸餾水，充分混勻后，加入1 mL 0.75 mmol/L FeSO4·7H2O溶液，混勻后加入1 mL 0.01%的H2O2，37 ℃水浴保溫60 min，于波長(zhǎng)536 nm處測(cè)定吸光值(A損)，樣品管及未損傷管分別以樣品溶液、蒸餾水代替損傷管中的H2O2，同等操作下分別測(cè)得吸光值(A樣)、(A未)。羥基自由基清除率計(jì)算公式如下：

1.3.8 ABTS自由基清除能力的測(cè)定

ABTS自由基清除能力的測(cè)定參照Roberta Re等[12]的方法。將20 mL 7 mmol/L的ABTS水溶液與352 μL 140 mmol/L的過硫酸鉀水溶液混合，室溫避光放置12～16 h,使用前用無水乙醇稀釋該混合液，使其在30 ℃時(shí)734 nm處的吸光值為0.7±0.02，取5 mL該溶液與50 μL樣品液混合，30 ℃水浴6 min后測(cè)定吸光度值(A)，同等條件下測(cè)得空白樣品吸光度值(A0)，ABTS自由基清除率計(jì)算公式如下：

2 結(jié)果與討論

2.1 糖種類的選擇

4種糖與酶解物進(jìn)行美拉德反應(yīng)后的抗氧化效果見圖1。

圖1 不同糖種類對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化活性的影響Fig.1 Effect of different types of sugar on antioxidant activity of reaction product

由圖1可知，葡萄糖與酶解物發(fā)生反應(yīng)后，其對(duì)DPPH自由基的清除能力及還原力均為最強(qiáng)，因此本實(shí)驗(yàn)選用最佳效果的葡萄糖與回收蛋白酶解物進(jìn)行美拉德反應(yīng)條件優(yōu)化。

2.2 美拉德反應(yīng)的單因素試驗(yàn)

2.2.1 初始pH的影響

圖2 不同初始反應(yīng)pH對(duì)DPPH自由基清除率的影響Fig.2 Effect of different initial reaction pH on DPPH radical scavenging activity

由圖2可知，美拉德產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除率隨初始pH值的增大呈先升后降的趨勢(shì)。在pH值為11時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)到最大值。這主要是因?yàn)樵诟遬H值環(huán)境下有利于羰氨縮合，使吡嗪類及糠醛類產(chǎn)物增加；同時(shí)高pH值有助于糠醛類物質(zhì)重排成還原酮類產(chǎn)物，引起褐變，而美拉德產(chǎn)物的抗氧化性與其褐變程度密切相關(guān)[13]。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇最佳反應(yīng)pH為11。

2.2.2 反應(yīng)時(shí)間的影響

反應(yīng)時(shí)間對(duì)DPPH自由基清除率的影響見圖3。

圖3 不同加熱時(shí)間對(duì)DPPH自由基清除率的影響Fig.3 Effect of different heating time on DPPH radical scavenging activity

由圖3可知，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間從1 h延長(zhǎng)到3 h時(shí)，美拉德產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基清除率增加幅度較大，而3～5 h內(nèi)，對(duì)DPPH自由基清除率趨于平緩。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇最佳反應(yīng)時(shí)間為3 h。

2.2.3 糖濃度的影響

DPPH自由基清除率與葡萄糖濃度的關(guān)系見圖4。

圖4 不同葡萄糖濃度對(duì)DPPH自由基清除率的影響Fig.4 Effect of different glucose concentration on DPPH radical scavenging activity

由圖4可知，美拉德產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除率隨著葡萄糖濃度的增加呈現(xiàn)出先上升后平緩的趨勢(shì)。當(dāng)葡萄糖濃度從1 g/dL增加到3 g/dL時(shí)，美拉德產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基清除率增加幅度較大；當(dāng)葡萄糖濃度超過3 g/dL時(shí)，美拉德產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基清除率趨于平緩。這可能是酶解物提供氨基的數(shù)量有限造成的，為了節(jié)約葡萄糖，本實(shí)驗(yàn)選擇最佳葡萄糖濃度為3 g/dL。

2.2.4 溫度的影響

加熱溫度對(duì)DPPH自由基清除率的影響見圖5。

圖5 不同加熱溫度對(duì) DPPH自由基清除率的影響Fig.5 Effect of different heating temperatures on DPPH radical scavenging activity

隨著加熱溫度的不斷升高，美拉德產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除率先增大后趨于平緩；當(dāng)加熱溫度從80 ℃升至120 ℃時(shí)，對(duì)DPPH自由基清除率快速上升；當(dāng)加熱溫度大于120 ℃時(shí)，DPPH自由基清除率趨于平緩。這可能是由于高溫有利于具有抗氧化作用的類黑精、還原酮及含N，S的雜環(huán)化合物的生成。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇最佳加熱溫度為120 ℃。

2.3 美拉德反應(yīng)條件的響應(yīng)面優(yōu)化

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)及方差分析

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇pH值、時(shí)間、溫度為變量，以DPPH自由基清除率為指標(biāo)，使用 Box-Benhnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)的基本思路，實(shí)施三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，見表2。

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

使用Design-Expert 7.0 軟件處理，得出各項(xiàng)回歸系數(shù)，形成DPPH自由基清除率及三因素的數(shù)學(xué)回歸模型：DPPH自由基清除率=79.93+11.50X1+7.50X2-7.97X3+0.81X1X2-3.54X1X3+1.23X2X3-8.02X12-5.39X22-8.40X32。

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Variance analysis of regression equation

注：P<0.05，表示差異顯著；P<0.01，表示差異極顯著。

由表3可知，DPPH自由基清除率的回歸模型具有高度顯著性；且失擬項(xiàng)P=0.6312>0.05，不顯著，由于失擬項(xiàng)用來表現(xiàn)預(yù)測(cè)值與真實(shí)值不相符的概率[14]，因此此模型合理；RAdj2為0.973，表明此模型能反映約97.3%實(shí)際值，所以此模型可以用來分析和預(yù)測(cè)回收蛋白酶解物與葡萄糖美拉德反應(yīng)中各要素對(duì)DPPH自由基清除率的影響。分析均方可知，三要素對(duì)DPPH自由基清除率的影響次序是加熱時(shí)間>初始pH值>加熱溫度。

2.3.2 最佳工藝條件及驗(yàn)證

經(jīng)響應(yīng)面分析得出美拉德反應(yīng)最佳工藝條件，即溫度126.92 ℃、pH值10.39、時(shí)間3.89 h、糖添加量3 g/dL，此時(shí)DPPH自由基清除率為90.0716%。為了檢驗(yàn)此模型的正確性，選用堿性蛋白酶酶解溫度為127 ℃、酶解pH值為10.4、糖添加量為3 g/dL、加熱時(shí)間為3.9 h的前提下進(jìn)行反應(yīng)，得出實(shí)際DPPH自由基清除率為88.56%。模型預(yù)測(cè)值與真實(shí)值基本相同，表明模型可靠有用。

2.4 酶解物美拉德反應(yīng)前后抗氧化性的比較

2.4.1 還原力的比較

圖6 美拉德反應(yīng)前后酶解物的還原力對(duì)照Fig.6 Reducing power of hydrolysates before and after Maillard reaction

由圖6可知，酶解物在1～10 mg/mL范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，吸光值逐漸增加；而美拉德產(chǎn)物在濃度1～4 mg/mL范圍內(nèi)，吸光值顯著增加，當(dāng)濃度達(dá)到4 mg/mL時(shí)，吸光值達(dá)到較高值，之后隨著濃度繼續(xù)增加而趨于平緩。相同濃度下，美拉德產(chǎn)物的吸光值顯著性高于相應(yīng)的酶解物，表明酶解物經(jīng)過美拉德反應(yīng)之后，還原力顯著提高。這是因?yàn)槊览庐a(chǎn)物可以作為一個(gè)較強(qiáng)的供電子體，表現(xiàn)強(qiáng)還原力[15]。

2.4.2 DPPH自由基清除能力的比較

圖7 美拉德反應(yīng)前后酶解物的DPPH自由基清除能力對(duì)比Fig.7 DPPH radical scavenging activity of hydrolysates before and after Maillard reaction

由圖7可知，酶解物在0.2～1.4 mg/mL范圍內(nèi)，具有一定的DPPH清除能力，但比較弱，且隨濃度的增加，變化不明顯；而美拉德產(chǎn)物在濃度0.2～0.6 mg/mL范圍內(nèi)，DPPH清除能力顯著增加，在濃度為0.6 mg/mL時(shí)達(dá)到較高水平，之后隨著濃度繼續(xù)增大趨于平緩，且顯著性高于相應(yīng)酶解物的清除率，這表明酶解物經(jīng)過美拉德反應(yīng)之后DPPH清除能力顯著提高。

2.4.3 ABTS自由基清除能力的比較

不同濃度的酶解物和美拉德產(chǎn)物對(duì)ABTS自由基清除能力效果見圖8。

圖8 美拉德反應(yīng)前后酶解物的ABTS清除能力對(duì)比Fig.8 ABTS scavenging activity of hydrolysates before and after Maillard reaction

由圖8可知，隨著樣品濃度的增加，兩者對(duì)ABTS清除能力都隨之增大，且增長(zhǎng)趨勢(shì)相似。相同濃度下，美拉德產(chǎn)物的 ABTS 自由基清除率高于酶解物。這可能是由于美拉德產(chǎn)物中具有芳香特性的雜環(huán)化合物電子過剩，有利于自由基親電加成，從而起到清除自由基作用[16]。

2.4.4 羥基自由基清除能力的比較

物質(zhì)對(duì)羥基自由基清除能力大小可以作為反映其抗氧化作用的重要指標(biāo)，見圖9。

圖9 美拉德反應(yīng)前后酶解物的羥基自由基清除能力對(duì)比Fig.9 Hydroxyl radical scavenging activity of hydrolysates before and after Maillard reaction

酶解物清除羥自由基能力較低，經(jīng)過美拉德反應(yīng)后，羥基自由基清除能力顯著提高，約為反應(yīng)前的2倍。這表明酶解物經(jīng)過美拉德反應(yīng)，提高了酶解物的抗氧化能力。

3 結(jié)論

選用4種糖與魚糜漂洗液回收蛋白酶解物進(jìn)行美拉德反應(yīng)，以還原力及DPPH自由基清除率為指標(biāo)，得出葡萄糖為最適糖。

葡萄糖與回收蛋白酶解物美拉德反應(yīng)的最適條件為：溫度126.92 ℃、pH值10.39、時(shí)間3.89 h、糖濃度3 g/dL。

回收蛋白酶解物美拉德反應(yīng)后還原力、DPPH自由基清除能力、羥基自由基清除能力增加較為明顯，這表明回收蛋白酶解物美拉德產(chǎn)物可以作為一種具備優(yōu)良抗氧化性的食品添加劑，為回收蛋白開發(fā)使用開拓了新路徑。

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EffectofMaillardReactiononAntioxidantActivityofFishProteinHydrolysates

DING Xiao-qiang, CHEN Li-li, BAI Chun-qing, YUAN Mei-lan, ZHAO Li*

(College of Life Science，Jiangxi Science and Technology Normal University，National Freshwater Fish Processing Technology Research and Development Branch，Nanchang 330013,China)

Enzymatic hydrolyzates of proteins are recovered from surimi washings as raw materials, Maillard reaction products (MRPs) are prepared by the reaction with four different varieties of sugar (glucose,D-fructose, sucrose and lactose), the impacts of Maillard reaction on antioxidant activity are studied in this research. Glucose is identified as the most suitable sugar based on DPPH radical scavenging activity, according to response surface, the optimal Maillard reaction conditions are obtained as follows: heating temperature is 126.92 ℃, initial reaction pH is 10.39, reaction time is 3.89 h and glucose concentration is 3 g/dL.Under the optimal reaction conditions, hydroxyl radical scavenging activity is increased from 34.83% to 61.82%, DPPH radical scavenging activity, ABTS scavenging activity and reducing power are enhanced.It indicates that the antioxidant activities of recovered fish protein hydrolysates from surimi washings are improved by Maillard reaction.

Maillard reaction;fish protein hydrolysates;DPPH radical scavenging activity;antioxidant activity

TS254.2

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.11.006

1000-9973(2017)11-0029-06

2017-05-15 *通訊作者

江西省高等學(xué)校科技落地計(jì)劃項(xiàng)目(KJLD12009)；江西省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金資助(贛財(cái)教指2013-258)；國(guó)家農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目(國(guó)科辦農(nóng)[2014]42號(hào))

丁小強(qiáng)(1989-)，男，江西新余人，碩士，研究方向：食品化學(xué)；

趙利(1967-)，女，教授，博士，研究方向：食品化學(xué)。