多重PCR法同時(shí)檢測(cè)黃酒酒曲中多種生物胺產(chǎn)生菌

朱曉娟，趙 磊，徐瑞濤，王道安，陳 爍，金佳玉，張 健*

（天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

多重PCR法同時(shí)檢測(cè)黃酒酒曲中多種生物胺產(chǎn)生菌

朱曉娟，趙 磊，徐瑞濤，王道安，陳 爍，金佳玉，張 健*

（天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

該研究建立了檢測(cè)多種生物胺產(chǎn)生菌的多重聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）方法，首先檢測(cè)了已報(bào)道的針對(duì)酪胺、腐胺產(chǎn)生菌和革蘭氏陰性組胺產(chǎn)生菌的多對(duì)引物的特異性，針對(duì)革蘭氏陰性菌的組氨酸脫羧酶基因的引物特異性差，重新設(shè)計(jì)了該引物，在此基礎(chǔ)上，建立了可同時(shí)檢測(cè)酪胺、腐胺和組胺產(chǎn)生菌的多重PCR方法，并優(yōu)化了多重PCR反應(yīng)條件為退火溫度50℃，Mg2+濃度1.0 mmol/L，引物濃度配比為Tdc-F/R 0.2 μmol/L，Hdc1/2 0.4 μmol/L和Odc3/4 0.4 μmol/L。該方法特異性強(qiáng)，對(duì)酪胺、腐胺和組胺產(chǎn)生菌的靈敏度分別為1.2 ng/μL、1.5 ng/μL和1.5 ng/μL，可用于黃酒酒曲中生物胺產(chǎn)生菌的快速檢測(cè)。

多重聚合酶鏈反應(yīng)；檢測(cè)；黃酒酒曲；生物胺產(chǎn)生菌

生物胺是一類低分子質(zhì)量含氮的堿性有機(jī)化合物，其產(chǎn)生通常需要3個(gè)條件：有分泌氨基酸脫羧酶的微生物；前體物質(zhì)（氨基酸）的存在；具有適宜這些微生物生長(zhǎng)和分泌氨基酸脫羧酶的環(huán)境條件。生物胺普遍存在于多種食品中，尤其是黃酒、葡萄酒、啤酒、奶酪和發(fā)酵香腸等發(fā)酵食品中[1]。適量的生物胺在生物體內(nèi)具有重要的生理作用，但是，當(dāng)人體吸收過量的生物胺時(shí)，將產(chǎn)生一系列應(yīng)激反應(yīng)，可能引起頭痛、呼吸紊亂、心悸等不良癥狀，嚴(yán)重情況下，可以引起大腦出血，甚至死亡[2]。在眾多的生物胺中，組胺對(duì)人體的毒害作用最大，其次是酪胺[3]，腐胺、尸胺、精胺和亞精胺沒有明確的危害健康的作用[4]，但是它們與氮結(jié)合會(huì)產(chǎn)生致癌物質(zhì)亞硝酸鹽，它們的存在還會(huì)加強(qiáng)酪胺和組胺的毒性[5]。因?yàn)閭€(gè)體差異的影響，以及食品中其他胺類物質(zhì)的干擾，使得生物胺的毒理學(xué)評(píng)估非常困難，現(xiàn)有的限量標(biāo)準(zhǔn)主要是針對(duì)組胺和酪胺。美國(guó)食品及藥物管理局（food and drug administration，F(xiàn)DA）規(guī)定水產(chǎn)品中組胺的限量標(biāo)準(zhǔn)為50 mg/kg，酪胺的限量標(biāo)準(zhǔn)為100 mg/kg；歐盟規(guī)定在魚類食品中，組胺的限量標(biāo)準(zhǔn)為100 mg/kg[6]。在酒類飲料中尚無(wú)生物胺的限量標(biāo)準(zhǔn)，只有可能的引起中毒的含量，如組胺2～10 mg/L，酪胺10～80 mg/L，苯丙氨酸3 mg/L[7]。雖然各個(gè)國(guó)家針對(duì)生物胺的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估有一定差異，但共識(shí)是應(yīng)努力減少食品中生物胺含量，從而降低食品攝入風(fēng)險(xiǎn)[8]。黃酒中的生物胺含量在39.30～241 mg/L之間，其中組胺、酪胺和腐胺所占的比例最大[9]。生物胺一旦形成，很難去除[10]，因此在生物胺產(chǎn)生之前，對(duì)其形成風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行預(yù)警至關(guān)重要，而對(duì)生物胺產(chǎn)生菌的檢測(cè)則是風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警的核心問題。

檢測(cè)生物胺產(chǎn)生菌的方法有三種：微生物學(xué)方法、化學(xué)方法和分子生物學(xué)方法。微生物學(xué)方法的基本原理是根據(jù)產(chǎn)生生物胺菌株的生理特征及其生長(zhǎng)過程中的生化變化，采用特異性選擇培養(yǎng)基來(lái)進(jìn)行篩選、鑒別，此方法誤差大，只適合于初篩[11]；化學(xué)方法即利用各種測(cè)定生物胺的化學(xué)手段測(cè)定細(xì)菌培養(yǎng)液中生物胺的含量，從而對(duì)微生物菌株做出判定。目前應(yīng)用最為普遍的化學(xué)方法是高效液相色譜（highperformance liquidchromatography，HPLC）法?；瘜W(xué)方法不僅可以定性判定產(chǎn)生物胺的微生物菌株，而且還可以定量評(píng)價(jià)其生物胺的產(chǎn)生能力，從而對(duì)其安全性做出評(píng)價(jià)。但該類方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且只有生成生物胺才能檢測(cè)，達(dá)不到預(yù)警的效果[12]；分子生物學(xué)方法是根據(jù)已鑒定的氨基酸脫羧酶的氨基酸序列保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，通過聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)電泳分析和序列比對(duì)來(lái)判定其是否具有氨基酸脫羧酶，從而確定該菌株是否具有產(chǎn)生物胺的能力，此類方法操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、靈敏度高，且可在生物胺未產(chǎn)生前檢測(cè)到生物胺產(chǎn)生菌，可用于菌株風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和發(fā)酵預(yù)警[13]。引物、反應(yīng)體系和條件是PCR檢測(cè)方法的關(guān)鍵。當(dāng)前PCR分子檢測(cè)技術(shù)已成功應(yīng)用于細(xì)菌的氨基酸脫羧酶基因檢測(cè)，如酪胺產(chǎn)生菌，腐胺產(chǎn)生菌和組胺產(chǎn)生菌[14]，然而對(duì)某些革蘭氏陰性的組胺產(chǎn)生菌不能得到有效擴(kuò)增[15]，因此進(jìn)行全新的引物設(shè)計(jì)精確檢測(cè)革蘭氏陰性組胺產(chǎn)生菌顯得尤為重要。另外，多重PCR作為一種在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上改進(jìn)發(fā)展起來(lái)的新型PCR擴(kuò)增技術(shù)，可同時(shí)檢測(cè)多種樣品，具有高效、高產(chǎn)、低成本等優(yōu)點(diǎn)，目前已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，并成為樣品快速檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展方向[16]。多重PCR的引物選擇是較為關(guān)鍵的步驟，盡量使各引物的退火溫度一致，避免同對(duì)引物或多對(duì)引物之間形成引物二聚體，避免引物之間的同源性及堿基互補(bǔ)性。除此之外，反應(yīng)體系的組成，如緩存液的成分、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate，dNTP）的濃度和反應(yīng)條件都會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果[17]。

黃酒中所含生物胺的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他發(fā)酵酒類，這主要是釀造黃酒原料中富含較多氨基酸，為生物胺的形成提供了豐富的前體物質(zhì)[8]，同時(shí)在釀造過程中添加含有大量微生物的酒曲進(jìn)行開放式發(fā)酵，引入了大量產(chǎn)生氨基酸脫羧酶的微生物[18]，從而導(dǎo)致了生物胺的大量產(chǎn)生。針對(duì)上述問題，本研究設(shè)計(jì)了針對(duì)革蘭氏陰性組胺產(chǎn)生菌的全新的引物，通過優(yōu)化多重PCR的反應(yīng)條件，建立了可同時(shí)檢測(cè)酪胺、腐胺和革蘭氏陰性組胺產(chǎn)生菌的多重PCR檢測(cè)方法。目的是用于黃酒釀造之初的安全預(yù)警，提升相關(guān)行業(yè)的安全生產(chǎn)能力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

12株生物胺產(chǎn)生菌株，3株不產(chǎn)生物胺的菌株：篩選自黃酒酒曲，為天津科技大學(xué)生化過程與技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存菌株，其編號(hào)、革蘭氏染色結(jié)果和產(chǎn)生物胺種類詳見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)所用菌株名稱及性質(zhì)Table 1 Name and nature of experimental strains

1.1.2 主要試劑

100 bp ladder Marker、DL 5kbp Marker、rTaqDNA聚合酶、dNTP、MgCl2、10×PCR buffer（Mg2+free）、10×PCR buffer（Mg2+plus）、細(xì)菌DNA提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒：大連寶生物有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy broth，TSB）培養(yǎng)基：胰蛋白胨17 g/L，大豆蛋白胨3 g/L，葡萄糖2.5 g/L，氯化鈉5 g/L，磷酸氫二鉀2.5 g/L，調(diào)節(jié)pH為7.3～7.5，121℃高壓滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

5334 PCR擴(kuò)增儀、微量移液器、5418R離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；DU640核酸蛋白分析儀：美國(guó)Backman公司；DYY-6C型電泳儀：北京六一生物科技公司；ChampGel5000凝膠成像儀：北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司；UV-1800PC分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 模板DNA的制備及質(zhì)量測(cè)定

將-80℃凍存的菌株接于TSB液體培養(yǎng)基上，37℃活化12h，于相應(yīng)固體平板上進(jìn)行劃線分離，37℃培養(yǎng)24h后，挑取單菌落于TSB液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)10 h左右。分別測(cè)量菌體的OD600nm值（革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的OD600nm＜1.0，革蘭氏陰性細(xì)菌的OD600nm＞1.0時(shí)，符合基因組試劑盒的要求），按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒操作說(shuō)明制備模板DNA。并利用核酸蛋白分析儀測(cè)量DNA的濃度。將制備好的模板DNA進(jìn)行分裝，-20℃凍存。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)

組氨酸脫羧酶可使組氨酸脫羧形成組胺，酪氨酸脫羧酶可使酪氨酸脫羧形成酪胺，而鳥氨酸脫羧酶催化鳥氨酸脫羧形成腐胺。組氨酸脫羧酶包括兩種類型：源于革蘭氏陽(yáng)性菌的丙酮酰依賴型和源于革蘭氏陰性菌的磷酸吡哆醛依賴型。酪氨酸脫羧酶和鳥氨酸脫羧酶通常不按革蘭氏染色分類[19]。本研究選取已報(bào)道的針對(duì)磷酸吡哆醛依賴型組氨酸脫羧酶基因的引物Hdc-2F/Hdc-2R、KPF2/KPR4、Hdc-f/Hdc-r、106/107、HIS2-F/HIS2-R，針對(duì)酪氨酸脫羧酶基因的引物（Tdc-F/R）和針對(duì)鳥氨酸脫羧酶的引物（Odc3/4）來(lái)驗(yàn)證引物的特異性。根據(jù)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）最新收錄的源于菌株Enterobactersp.的組氨酸脫羧酶序列及與之高度相似（99%）并且同屬磷酸吡哆醛依賴型天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶超家族的源于Enterobacter cloacae，Enterobacter asburiae的2,4-二氨基丁酸脫羧酶序列進(jìn)行比對(duì)，利用PrimerPremier 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，合成新的引物組氨酸脫羧酶的引物Hdc1/Hdc2（GGYTNAARCARCCNGARATG/GCRTCNACRTGNACCCADAT）。所有引物均由北京華大基因有限公司合成，序列詳細(xì)信息見表2。

表2 多重PCR引物設(shè)計(jì)Table 2 Design for premiers of multiplex PCR

1.3.3 單一PCR擴(kuò)增條件

采用已報(bào)道的引物，擴(kuò)增時(shí)的反應(yīng)體系和條件均參見表2。采用Hdc1/Hdc2引物PCR擴(kuò)增時(shí)的反應(yīng)體系（25 μL）：10×Buffer：2.5 μL，rTaq聚合酶0.25 μL（5 U/μL），dNTPs：2.0 μL（各2.5 mmol/L），DNA模板1.0 μL（10 ng/μL），引物1.0μL（初始濃度10μmol/L），其余用雙蒸水補(bǔ)足。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸2min，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，取4μL PCR產(chǎn)物，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。取50 μL擴(kuò)增體系的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行切膠回收，采用大連寶生物的純化回收試劑盒回收片段，交給北京華大基因有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3.4 多重PCR條件優(yōu)化

按照L16（45）正交設(shè)計(jì)，優(yōu)化多重PCR的退火溫度、Mg2+濃度以及各引物的濃度，其他反應(yīng)條件和反應(yīng)體系同1.3.3。因?yàn)闆]有菌株同時(shí)產(chǎn)酪胺、腐胺和組胺，所以分別選取菌株Mc4（產(chǎn)組胺和腐胺）和菌株La8（產(chǎn)酪胺）為目標(biāo)菌，進(jìn)行正交試驗(yàn)。綜合考慮菌株Mc4擴(kuò)增時(shí)組氨酸脫羧酶和鳥氨酸脫羧酶基因片段擴(kuò)增后的條帶的明亮程度，以及菌株La8擴(kuò)增時(shí)酪氨酸脫羧酶基因片段擴(kuò)增后的條帶的明亮程度選擇最優(yōu)的因素水平組合，確定多重PCR的最佳反應(yīng)體系和條件。

1.3.5 多重PCR特異性實(shí)驗(yàn)

選取菌株Mc4、La8的DNA進(jìn)行混合，根據(jù)其DNA含量1.0∶0.5（10 ng∶5 ng）組合，陰性菌株Ma7、Qa1及Qa2做模板。按照1.3.4優(yōu)化的條件進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)3對(duì)引物Hdc1/Hdc2、Tdc-F/Tdc-R、Odc3/Odc4的特異性。

1.3.6 多重PCR的靈敏度測(cè)試

分別將菌株Mc4和La8的DNA按照測(cè)定濃度進(jìn)行10倍比梯度稀釋，使兩株菌株的DNA質(zhì)量濃度分別為150ng/μL、15 ng/μL、1.5 ng/μL、0.15 ng/μL和120 ng/μL、12 ng/μL、1.2ng/μL、0.12ng/μL。分別按照1.3.4優(yōu)化的條件進(jìn)行擴(kuò)增，分析多重PCR對(duì)檢測(cè)酪胺、腐胺和革蘭氏陰性組胺產(chǎn)生菌的靈敏度。

1.3.7 多重PCR方法對(duì)黃酒酒曲篩選菌株的檢測(cè)應(yīng)用

按照1.3.4優(yōu)化好的多重PCR方法對(duì)黃酒酒曲中篩選出來(lái)的菌株進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證該方法對(duì)黃酒酒曲中生物胺產(chǎn)生菌檢測(cè)的有效性。

2 結(jié)果與分析

2.1 單重PCR檢測(cè)結(jié)果

按照文獻(xiàn)[20-26]中報(bào)道的7對(duì)引物，將12株產(chǎn)生物胺陽(yáng)性菌株和3株不產(chǎn)生物胺的陰性菌株（見表2）進(jìn)行擴(kuò)增，其中2株陽(yáng)性菌株的擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，腐胺產(chǎn)生菌擴(kuò)增片段為1056bp，酪胺產(chǎn)生菌擴(kuò)增片段為825bp，且符合預(yù)期結(jié)果大?。欢M胺產(chǎn)生菌均未得到有效擴(kuò)增；對(duì)3株陰性菌株，所有引物均無(wú)法擴(kuò)增出條帶。從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)搜索可知，這些針對(duì)組氨酸脫羧酶的引物，靶標(biāo)均為含有378個(gè)氨基酸的組氨酸脫羧酶的基因序列。2014年NCBI近新收錄的腸桿菌屬的組氨酸脫羧酶含有488個(gè)氨基酸，該酶與含有378個(gè)氨基酸的組氨酸脫羧酶的序列差別很大，相似度僅為15%，而與2,4-二氨基丁酸脫羧酶序列高度相似，相似度為99%。目前雖然沒有2,4-二氨基丁酸脫羧酶可以催化組氨酸脫羧合成組胺的報(bào)道，但已有其能轉(zhuǎn)化酪氨酸生成酪胺的報(bào)道[27]，考慮到2,4-二氨基丁酸脫羧酶與組氨酸脫羧酶同屬磷酸吡哆醛依賴型天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶超家族，且該酶和腸桿菌屬的含有488個(gè)氨基酸的組氨酸脫羧酶的高度相似性，推測(cè)該酶很可能具有與組氨酸脫羧酶同樣的功能。因此，本研究比較了腸桿菌屬的組氨酸脫羧酶和本研究所用菌株中的2,4-二氨基丁酸脫羧酶序列，設(shè)計(jì)了全新的引物Hdc1/Hdc2。按照1.3.3的擴(kuò)增條件，對(duì)所有9株產(chǎn)組胺的菌株，采用該引物均可擴(kuò)增出大小為735 bp的條帶，而對(duì)3株陰性對(duì)照菌株均沒有擴(kuò)增出條帶。這說(shuō)明新設(shè)計(jì)的組胺酸脫羧酶引物可以有效檢測(cè)組胺產(chǎn)生菌。

圖1 單重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.1 Gel electrophoresis of monoplex PCR amplification products

2.2 多重PCR條件優(yōu)化

由于單重PCR在進(jìn)行操作時(shí)需要逐一加入單對(duì)引物和模板，為使操作更加簡(jiǎn)便，本實(shí)驗(yàn)建立了多重PCR的方法。單一PCR分別檢測(cè)酪胺，腐胺和革蘭氏陰性組胺產(chǎn)生菌時(shí)，所用的引物具有不同Tm值，則進(jìn)行PCR時(shí)退火溫度會(huì)有明顯不同，各引物與模板結(jié)合的偏好性不同，則各引物的終濃度會(huì)不同。因此要建立同時(shí)檢測(cè)酪胺，腐胺和革蘭氏陰性組胺產(chǎn)生菌的多重PCR方法，必需要對(duì)反應(yīng)體系和退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。本研究采用L16（45）正交設(shè)計(jì)對(duì)3對(duì)引物的濃度，退火溫度和Mg2+濃度進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見表3。由表3可知，6號(hào)試驗(yàn)效果較好，即退火溫度為50℃，Mg2+濃度為1.0 mmol/L，引物濃度配比為：Tdc-F/R 0.2 μmol/L，Hdc1/2 0.4 μmol/L和Odc3/4 0.4 μmol/L。在最佳的結(jié)果下，多重PCR的凝膠電泳圖見圖2所示，三對(duì)引物均能得到較亮的擴(kuò)增條帶，說(shuō)明該組正交試驗(yàn)結(jié)果較好。

表3 多重PCR條件優(yōu)化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 3 Design of orthogonal experiments for PCR conditions optimization

圖2 多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.2 Gel electrophoresis of multiplex PCR amplification products

2.3 多重PCR特異性檢驗(yàn)

為了進(jìn)一步對(duì)多重PCR的引物進(jìn)行特異性檢驗(yàn)，驗(yàn)證不同引物和模板之間是否會(huì)形成錯(cuò)配，將菌株Mc4和La8的DNA模板按照DNA含量1.0∶0.5（10 ng∶5 ng）比例進(jìn)行預(yù)混作為模板，擴(kuò)增條件按照2.2優(yōu)化的結(jié)果。多重PCR特異性檢驗(yàn)結(jié)果見圖3。由圖3可知，多重PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果表明這三種引物能夠很好的擴(kuò)增生物胺產(chǎn)生菌的氨基酸脫羧酶序列，特異性條帶較亮，任意一株陰性對(duì)照組都沒有出現(xiàn)擴(kuò)增，沒有出現(xiàn)非特異性條帶，可得到這三對(duì)引物特異性良好。表明建立的多重PCR方法對(duì)檢測(cè)腐胺和酪胺產(chǎn)生菌以及革蘭氏陰性組胺產(chǎn)生菌，具有較好的特異性。

圖3 多重PCR特異性擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.3 Gel electrophoresis of multiplex PCR specificity amplification products

2.4 多重PCR靈敏度檢驗(yàn)

菌株Mc4和La8的DNA質(zhì)量濃度分別是150.200ng/μL、120.850 ng/μL，將其進(jìn)行十倍梯度稀釋，以該DNA稀釋液做模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，從而確定DNA最低檢測(cè)限，結(jié)果見圖4。由圖4可知，當(dāng)模板質(zhì)量濃度為1.5ng/μL為檢測(cè)到組胺條帶最低濃度，1.5 ng/μL為檢測(cè)到腐胺條帶的最低濃度，1.2 ng/μL為檢測(cè)酪胺條帶的最低濃度。瓊脂糖凝膠電泳表明三種引物，Hdc1/2、Odc3/4、Tdc-F/R引物所對(duì)應(yīng)的各自DNA模板檢出限分別為1.5 ng/μL、1.5 ng/μL及1.2 ng/μL。

圖4 多重PCR靈敏度擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.4 Gel electrophoresis of multiplex PCR sensitivity amplification products

2.5 多重PCR方法對(duì)黃酒酒曲生物胺產(chǎn)生菌株的檢測(cè)應(yīng)用

通過篩選出的兩株菌建立了酪胺，腐胺和革蘭氏陰性組胺產(chǎn)生菌的多重PCR方法，為了進(jìn)一步驗(yàn)證及應(yīng)用該方法，按照多重PCR的優(yōu)化條件，對(duì)酒曲中篩選出的在不同培養(yǎng)基富集的全部菌株進(jìn)行應(yīng)用，結(jié)果見圖5。由圖5可知，三對(duì)引物都能夠在對(duì)應(yīng)的位置得到相應(yīng)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果表明，建立的多重PCR方法在檢測(cè)黃酒酒曲中生物胺產(chǎn)生菌時(shí)，與這12株菌的HPLC的結(jié)果具有一致性。其中菌株Mc4在735 bp處和1 056 bp處有條帶，說(shuō)明該菌株能夠產(chǎn)生組胺和腐胺，由圖6可知，菌株Mc4發(fā)酵液（培養(yǎng)4 d）高效液相色譜檢測(cè)結(jié)果中出現(xiàn)組胺和腐胺色譜峰，表明該多重PCR的方法可以用于酒曲中生物胺產(chǎn)生菌的快速檢測(cè)。

圖5 多重PCR檢測(cè)黃酒酒曲生物胺產(chǎn)生菌擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.5 Gel electrophoresis of multiplex PCR amplification products of biogenic amines-producing bacteria in Chinese rice wineJiuqu

圖6 生物胺標(biāo)準(zhǔn)品及菌株Mc4產(chǎn)生物胺的高效液相色譜圖Fig.6 HPLC chromatogram of biological amine standard and biogenic amines-produced by strain Mc4

3 結(jié)論

本研究建立了一種可同時(shí)檢測(cè)三種生物胺產(chǎn)生菌的多重PCR的方法。在進(jìn)行PCR的過程中，選取了文獻(xiàn)中報(bào)道的兩對(duì)特異性引物[20-22]。另外根據(jù)某些生物胺產(chǎn)生菌的種屬，進(jìn)行了全新的引物設(shè)計(jì)，得到了一對(duì)能夠擴(kuò)增革蘭氏陰性組胺產(chǎn)生菌的引物。對(duì)多重PCR的過程進(jìn)行了優(yōu)化，最后的優(yōu)化結(jié)果為退火溫度50℃，Mg2+濃度1.0 mmol/L，引物Tdc-F/R濃度0.2 μmol/L，Odc3/4濃度0.4 μmol/L，Hdc1/2濃度0.4 μmol/L，該方法特異性強(qiáng)，對(duì)酪胺、腐胺和組胺產(chǎn)生菌的靈敏度分別為1.2ng/μL、1.5ng/μL和1.5 ng/μL，該方法可有效應(yīng)用于黃酒酒曲中生物胺產(chǎn)生菌的檢測(cè)，對(duì)黃酒的安全生產(chǎn)有重要意義。

[1]王 瑞，陳新軍，吳新月，等.新疆赤霞珠葡萄酒發(fā)酵過程中生物胺含量的變化[J].中國(guó)釀造，2017，36（1）：131-134.

[2]李志軍，欒同青，鐘其頂，等.發(fā)酵型飲料酒中生物胺研究進(jìn)展[J].食品研究與開發(fā)，2013，34（12）：111-115.

[3]MAIJALA R,EEROLA S.Contaminant lactic acid bacteria of dry sausages produce histamine and tyramine[J].Meat Sci,1993,35(3):387-395.

[4]HERNANDEZ J T,IZQUIERDO P M,VECIANA-NOGUES T,et al.Biogenic amines and polyamine contents in meat and meat products[J].J Agr Food Chem,1997,45(6):2098-2102.

[5]SHALABY A R.Significance of biogenic amines to food safety and human health[J].Food Res Int,1996,29(7):675-690.

[6]ZHU H,YANG S,ZHANG Y,et al.Simultaneous detection of fifteen biogenic amines in animal derived products by HPLC-FLD with solidphaseextractionafterderivatizationwithdansylchloride[J].Anal Method,2016,8(18):3747-3755.

[7]SOUFLEROS E H,BOULOUMPASI E,ZO A,et al.Determination of biogenic amines in Greek wines by HPLC and ultraviolet detection after dansylation and examination of factors affecting their presence and concentration[J].Food Chem,2007,101(2):704-716.

[8]LADERO V,FERNANDEZ M,ALVAREZ M A.Effect of post-ripening processing on the histamine and histamine-producing bacteria contents of different cheeses[J].Int Dairy J,2009,19(12):759-762.

[9]LU Y,LU X,CHEN X,et al.A survey of biogenic amines in Chinese rice wines[J].Food Chem,2007,100(4):1424-1428.

[10]CARDOZO M,LIMA K D S C,FRANCA T C C,et al.Biogenic amines:A public health problem[Aminas Biogênicas:Um Problema de Saúde Pública][J].Rev Virt Química,2013,5(2):149-168.

[11]ROIG-SAGUES A X,HERNANDEZ-HERRERO M M,LOPEZSABATER E I,et al.Evaluation of three decarboxylating agar media to detect histamine and tyramine-producing bacteria in ripened sausages[J].Lett Appl Microbiol,1997,25(5):309-312.

[12]LOUKOU Z,ZOTOU A.Determination of biogenic amines as dansyl derivatives in alcoholic beverages by high-performance liquid chromatography with fluorimetric detection and characterization of the dansylated amines by liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ioniz[J].J Chromatogr A,2003,996(1-2):103-113.

[13]FADHLAOUI-ZID K,CURIEL J A,LANDETA G,et al.Biogenic amine production by bacteria isolated from ice-preserved sardine and mackerel[J].Food Control,2012,25(1):89-95.

[14]LANDETE J M,FERRER S,POLO L,et al.Biogenic amines in wines from three Spanish regions[J].J Agr Food Chem,2005,53(4):1119-1124.

[15]TAKAHASHI H,KIMURA B,YOSHIKAWA M,et al.Cloning and sequencing of the histidine decarboxylase genes of gram-negative,histamine-producing bacteria and their application in detection and identification of these organisms in fish[J].Appl Environ Microbiol,2003,69(5):2568-2579.

[16]張玉霞，黃 鳴.食品檢驗(yàn)中多重PCR技術(shù)的應(yīng)用[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2008，18（5）：958-960.

[17]HENEGARIU O,HEEREMA N A,DLOUHY S R,et al.Multiplex PCR:critical parameters and step-by-step protocol[J].Biotechniques,1997,23(3):504-511.

[18]毛青鐘，俞關(guān)松.黃酒浸米漿水中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的不同對(duì)發(fā)酵的影響[J].釀酒，2010，37（5）：76-80.

[19]趙艷卓，劉樹文.酒酒球菌中生物胺相關(guān)基因的檢測(cè)[J].中國(guó)釀造，2011，30（12）：40-42.

[20]DE l R B,MARCOBAL A,CARRASCOSA A V,et al.PCR detection of foodborne bacteria producing the biogenic amines histamine,tyramine,putrescine,and cadaverine[J].J Food Prot,2006,69(10):2509-2514.[21]DE l R B,MARCOBAL A,MUNOZ R.Gene organization of the ornithine decarboxylase-encoding region inMorganella morganii[J].J Appl Microbiol,2007,102(6):1551-1560.

[22]MARCOBAL A,DE l R B,MORENO-ARRIBAS M V,et al.Multiplex PCR method for the simultaneous detection of histamine-,tyramine-,and putrescine-producing lactic acid bacteria in foods[J].J Food Prot,2005,68(4):874-878.

[23]WONGSARIYAK,BUNYAPRAPHATSARAN,YASAWONGM,etal.Development of molecular approach based on PCR assay for detection of histamine producing bacteria[J].J Food Sci Technol,2016,53(1):640-648.

[24]KANKI M,YODA T,TSUKAMOTO T,et al.Klebsiella pneumoniae producesnohistamine:RaoultellaplanticolaandRaoultella ornithinolytica strains are histamine producers[J].Appl Environ Microbiol,2002,68(7):3462-6.

[25]LANDETE J M,DE L R B,MARCOBAL A,et al.Molecular methods for the detection of biogenic amine-producing bacteria on foods[J].Int J Food Microbiol,2007,117(3):258-269.

[26]RIVASBDL,áNGELAMARCOBAL,MUNOZR.Improvedmultiplex-PCR method for the simultaneous detection of food bacteria producing biogenic amines[J].Fems Microbiol Lett,2005,244(2):367-372.

[27]BURRELL M,HANFREY C C,KINCH L N,et al.Evolution of a novel lysinedecarboxylaseinsiderophorebiosynthesis[J].Molecul Microbiol,2012,86(2):485-499.

Multiplex polymerase chain reaction for simultaneous detection of biogenic amines-producing bacteria in Chinese rice wineJiuqu

ZHU Xiaojuan,ZHAO Lei,XU Ruitao,WANG Daoan,CHEN Shuo,JIN Jiayu,ZHANG Jian*
(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology,Ministry of Education,College of Biotechnology,Tianjin University of Science＆Technology,Tianjin 300457,China)

A multiplex polymerase chain reaction (mPCR)method for the detection of biogenic amines-producing bacteria established in this research.Firstly,the specificity of some reported primers against tyramine,putrescine and gram-negative histamine-producing bacteria was detected,and the poor primer-specificity against gram-negative histamine-producing bacteria was observed.To solve this problem,the primers for gram-negative histamine producing bacteria were redesigned.A mPCR method for simultaneous detection of tyramine,putrescine and histamine-producing bacteria was established.After that,the annealing temperature was 50℃,the concentration of Mg2+was 1.0 mmol/L and the concentration ratio of the Tdc-F/R,Hdc1/2,Odc3/4 primers were 0.2 μmol/L,0.4 μmol/L,and 0.4 μmol/L,respectively.This method was specific for amplification of the biogenic amine-producing bacteria.The detect sensitivity of tyramine,putrescine and histamine were 1.2 ng/μl,1.5 ng/μl,and 1.5 ng/μl,respectively.The method can be applied in the rapid detection biogenic amines-producing bacteria in Chinese rice wineJiuqu.

multiplex polymerase chain reaction;detection;Chinese rice wineJiuqu;biogenic amines-producing bacteria

TS207.3

0254-5071（2017）10-0036-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.10.009

2017-07-16

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31471725）；天津科技大學(xué)大學(xué)生實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)新基金（1604A103）

朱曉娟（1992-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)檩p工技術(shù)與工程。

*通訊作者：張 健（1978-），男，副研究員，博士，研究方向?yàn)榘l(fā)酵食品安全。