?？e，張 然，趙春旭，馬暉玲(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

草地早熟禾種間原生質(zhì)體電融合條件的研究

?？e，張 然，趙春旭，馬暉玲
(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

為改良培育草地早熟禾(Poapratensis)新品種，擬建立草地早熟禾商用品種與具有優(yōu)良性狀的野生早地早熟禾種間原生質(zhì)體融合體系。采用電融合法，研究了電融合儀的電場條件和原生質(zhì)體密度對草地早熟禾種間原生質(zhì)體融合的影響。結(jié)果表明：在交流電場強(qiáng)度和頻率分別為20 V/cm和2000 kHz時(shí)，原生質(zhì)體可在較短的時(shí)間內(nèi)形成2～4個(gè)原生質(zhì)體串；最適于草地早熟禾種間原生質(zhì)體融合的直流脈沖強(qiáng)度為200 V/cm、DC幅寬為40 μs、直流脈沖次數(shù)為3次，原生質(zhì)體密度為3×105個(gè)/mL，在此條件下，草地早熟禾種間原生質(zhì)體總?cè)诤下屎鸵粚σ蝗诤下士煞謩e達(dá)到25.39%和12.27%。

草地早熟禾；原生質(zhì)體；電融合；種間體細(xì)胞雜交

早熟禾屬(Poa)隸屬于禾本科早熟禾亞科早熟禾族，是禾本科最大的屬，廣泛分布于寒帶和北溫帶冷涼濕潤地區(qū)[1-2]。目前全世界的早熟禾屬植物有500多種，我國包括變種在內(nèi)共有105種[3-4]。該屬的草地早熟禾(Poapratensis)不僅是優(yōu)良的牧草，同時(shí)由于具有質(zhì)地纖細(xì)、再生能力和耐修剪性強(qiáng)、綠期長、坪質(zhì)優(yōu)美以及較強(qiáng)的抗寒能力等優(yōu)良特性，被廣泛應(yīng)用于草坪建植，是寶貴的草坪植物種質(zhì)資源。在草地早熟禾育種的研究中，人們以往采用常規(guī)育種方法和手段，如父母本雜交法[5-6]、篩選自然突變體和理化誘導(dǎo)突變體[7-9]等手段來選育草地早熟禾優(yōu)良新品種。大量的研究表明，早熟禾屬植物生殖方式復(fù)雜多樣，草地早熟禾常以兼性無融合生殖方式進(jìn)行繁殖，有些品種的無融合生殖率高達(dá)98%以上[10-11]，而有性雜交率很低，很難獲得雜種優(yōu)勢品種，利用傳統(tǒng)育種方式改良品種特性存在著一定困難和局限性，自然雜交困難是制約早熟禾植物種質(zhì)創(chuàng)新的瓶頸。

植物原生質(zhì)體是脫去了細(xì)胞壁的裸露細(xì)胞，由于無細(xì)胞壁，在化學(xué)、物理或自發(fā)性作用下，原生質(zhì)體之間可以進(jìn)行細(xì)胞的融合而獲得體細(xì)胞雜種[12]。植物原生質(zhì)體融合技術(shù)給植物不同種、屬乃至科的遺傳物質(zhì)的交流提供了可行的途徑和方法，克服了雜交不親和而導(dǎo)致的生殖屏障[13]，通過此途徑可以轉(zhuǎn)移多基因控制的數(shù)量性狀和細(xì)胞質(zhì)基因控制的性狀等[14]。1993年，Kisten等[15]成功建立了草地早熟禾‘Geronimo’的細(xì)胞懸浮系原生質(zhì)體培養(yǎng)體系；國內(nèi)馬暉玲和趙小強(qiáng)等[16-17]以草地早熟禾Midnight Ⅱ和Nuglade的胚性愈傷組織為分離材料，獲得的原生質(zhì)體經(jīng)液體培養(yǎng)后成功地再生出植株。但到目前為止，未見有關(guān)早熟禾種間原生質(zhì)體融合的報(bào)道。與PEG法相比，電融合法可避免PEG高鈣高pH強(qiáng)加于原生質(zhì)體的生理?xiàng)l件，同時(shí)融合的條件更加數(shù)據(jù)化，便于控制和比較，且融合率相對較高[18]。

筆者所在課題組前期的初步研究表明，采集于甘肅安定區(qū)的野生草地早熟禾具有較強(qiáng)的抗旱性，可作為優(yōu)良的育種材料[19-21]，且已建立起了安定野生草地早熟禾的分離和培養(yǎng)體系[22]。因此，筆者以草地早熟禾商用品種Midnight Ⅱ和采集于甘肅省安定區(qū)的野生草地早熟禾的原生質(zhì)體為材料，采用電融合法探索了草地早熟禾種間原生質(zhì)體融合條件，以期確定適宜的電融合參數(shù)，為利用植物原生質(zhì)體融合技術(shù)對草地早熟禾種質(zhì)創(chuàng)新和品種改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)采用草地早熟禾Midnight Ⅱ(W-2)和采集于甘肅省安定區(qū)的野生草地早熟禾(AD)的原生質(zhì)體，原生質(zhì)體的獲得分別參考馬暉玲等[17]和牛奎舉等[22]的研究；電融合儀選用CRY-3型細(xì)胞融合儀，融合電極小室為1.5 mm。

1.2融合參數(shù)的確定

原始融合參數(shù)的設(shè)定和基本操作參照CRY-3型細(xì)胞融合儀操作說明書和文獻(xiàn)[23]的方法進(jìn)行。

1.2.1 成串(交流，AC)電場參數(shù) 將獲得的原生質(zhì)體用電融合液純化一次后再次懸浮，調(diào)整兩親本原生質(zhì)體的密度，使其最終密度為1×105個(gè)/mL，并按1∶1的比例混合備用。融合液含有0.55 mol/L甘露醇和0.4 mmol/L的CaCl2·2H2O的雙蒸水溶液，pH 5.8，過濾滅菌。

試驗(yàn)采用單因素設(shè)計(jì)，前次試驗(yàn)結(jié)果為后次試驗(yàn)的基本條件，每處理重復(fù)3次，倒置顯微鏡下觀察原生質(zhì)體接觸情況、統(tǒng)計(jì)成串時(shí)間、成串率和串珠長度。成串脈沖電壓和成串脈沖頻率參數(shù)分別設(shè)置為：(1)電壓：10、15、20、25、30、35 V/cm；(2)頻率：1 000、1 500、2 000、2 500、3 000 kHz。

1.2.2 融合(直流，DC)脈沖參數(shù) 融合脈沖參數(shù)涉及融合脈沖電壓、脈沖幅寬和脈沖次數(shù)3個(gè)因素，試驗(yàn)采用單因素設(shè)計(jì)，前次試驗(yàn)結(jié)果為后次試驗(yàn)的基本條件，每處理重復(fù)3次，倒置顯微鏡下觀察原生質(zhì)體融合情況、統(tǒng)計(jì)總?cè)诤下?、一對一融合率。融合脈沖電壓、脈沖幅寬和脈沖個(gè)數(shù)分別設(shè)置為：(1)直流脈沖電壓：50、100、150、200、250、300 V/cm；(2)直流脈沖幅寬：5、10、20、40、80、100 μs；直流脈沖次數(shù)：1、2、3、4次。

1.2.3 原生質(zhì)體密度對融合頻率的影響 在最適的成串參數(shù)與融合參數(shù)的基礎(chǔ)上，對不同的原生質(zhì)體密度(1×105、2×105、3×105、4×105、和5×105個(gè)/mL)對融合率的影響進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)的處理和統(tǒng)計(jì)分析采用Microsoft Excel 2013。采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)單因素方差分析(ANOVA)，使用 Duncan 法在0.05顯著性水平進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1交流電場強(qiáng)度對原生質(zhì)體成串的影響

當(dāng)融合親本原生質(zhì)體處于交流電場的作用時(shí)，彼此之間會(huì)相互靠近并逐漸相連排列成串。隨著交流電場強(qiáng)度的增大，原生質(zhì)體成串所需時(shí)間逐漸縮短，成串率逐漸增高，串珠長度也隨之增大。然而，原生質(zhì)體融合所期望的是雙親細(xì)胞融合，串珠長度過長則會(huì)引起多細(xì)胞的融合，所以串珠長度以2～3個(gè)細(xì)胞為最佳。因此，交流電場強(qiáng)度應(yīng)小于25 V/cm。試驗(yàn)表明，交流電場強(qiáng)度以20 V/cm為最適，此條件下成串時(shí)間較短，串珠長度也較短，為2～4個(gè)，但成串率較高，為78.1%(表1)。

表1 交流電場強(qiáng)度處理下原生質(zhì)體成串的指標(biāo)

注：表中同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

2.2交流電場頻率處理下原生質(zhì)體成串的指標(biāo)

交流電場頻率對原生質(zhì)體的成串時(shí)間、成串率和串珠長度有著顯著地影響(表2)。當(dāng)交流頻率為1 000 kHz時(shí)，顯微鏡下可觀察到原生質(zhì)體只是自身旋轉(zhuǎn)，并未能成串，交流頻率的逐漸增高，原生質(zhì)體成串時(shí)間逐漸縮短，成串率也逐漸增高，但當(dāng)交流頻率達(dá)到2 500 kHz時(shí)，可觀察到部分串珠長度超過5個(gè)。因此，適宜于草地早熟禾原生質(zhì)體成串的交流電場頻率為2 000 kHz。

表2 交流電場頻率處理下原生質(zhì)體成串的指標(biāo)

2.3直流電場強(qiáng)度對原生質(zhì)體融合的影響

在交流電場強(qiáng)度為20 V/cm，交流頻率為2 000 kHz，持續(xù)時(shí)間為3 min的情況下，研究了不同直流脈沖強(qiáng)度，直流脈沖幅寬和脈沖個(gè)數(shù)對原生質(zhì)體融合頻率的影響(表3)。當(dāng)直流脈沖電壓強(qiáng)度為50 V/cm時(shí)，原生質(zhì)體的總?cè)诤项l率和一對一融合率均較低，分別為9.01% 和1.31%，隨著直流電壓的繼續(xù)增高，總?cè)诤下屎鸵粚σ蝗诤下手饾u開始增高，當(dāng)直流電壓達(dá)到200 V/cm時(shí)，總?cè)诤下屎鸵粚σ蝗诤下蔬_(dá)到最大值，分別為22.26% 和11.04%。當(dāng)直流電壓超過250 V/cm時(shí)，原生質(zhì)體開始變形和破碎，總?cè)诤下屎鸵粚σ蝗诤下示_始下降，尤其是一對一融合率開始急劇下降。因此，草地早熟禾原生質(zhì)體融合的最適直流電壓為200 V/cm。

表3 直流電場強(qiáng)度處理下原生質(zhì)體的融合

2.4直流脈沖幅寬對原生質(zhì)體融合的影響

在直流脈沖強(qiáng)度為200 V/cm條件下，隨著脈沖幅寬的延長，細(xì)胞的總?cè)诤下屎鸵粚σ蝗诤下示尸F(xiàn)出先增高后降低的趨勢(表4)。在80 μs的脈沖幅寬下，總?cè)诤下蔬_(dá)到最高，為22.81%，但是顯微鏡下可明顯觀察到有破碎的細(xì)胞出現(xiàn)，可能導(dǎo)致了其一對一融合率較40 μs顯著地降低。當(dāng)脈沖幅寬為40 μs時(shí)，雖然總?cè)诤下氏鄬^低，但是其一對一融合率顯著高于其他處理，因此，最適于草地早熟禾原生質(zhì)體融合的脈沖幅寬為40 μs。

表4 直流脈沖幅寬處理下原生質(zhì)體的融合

2.5直流脈沖次數(shù)對原生質(zhì)體融合的影響

在直流脈沖強(qiáng)度為200 V/cm，幅寬為40 μs條件下，脈沖次數(shù)過少，則融合率較低；而脈沖次數(shù)超過4次時(shí)，導(dǎo)致細(xì)胞膜不能承受過強(qiáng)的脈沖刺激，從而降低融合率，尤其是一對一融合率開始顯著降低(表5)。當(dāng)脈沖次數(shù)為3時(shí)，其總?cè)诤下屎鸵粚σ蝗诤下曙@著高于其他處理，因此，最適于草地早熟禾原生質(zhì)體融合的直流脈沖次數(shù)為3次。

表5 直流脈沖次數(shù)處理下原生質(zhì)體的融合

2.6原生質(zhì)體密度對融合效率的影響

原生質(zhì)體密度對融合頻率同樣具有顯著的影響，隨著原生質(zhì)體密度的逐漸增大，融合頻率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(表6)。當(dāng)原生質(zhì)體的密度為3×105個(gè)/mL時(shí)，草地早熟禾原生質(zhì)體融合率和一對一融合率均達(dá)到最大值，分別為25.39% 和12.27%。

表6 原生質(zhì)體密度處理下的融合效率

2.7草地早熟禾原生質(zhì)體電融合過程

將W-2和AD的原生質(zhì)體密度均調(diào)至3×105個(gè)/mL，1∶1混合。取0.4 mL加入1.5 mm平行電極，靜置3～5 min，待原生質(zhì)體沉淀后連接電極與融合儀輸出接頭，施加適當(dāng)?shù)慕涣麟妷?電壓強(qiáng)度為20 V/cm，交流頻率為2 000 kHz)，2～3 min可觀察到約80%的原生質(zhì)體會(huì)形成2～4個(gè)原生質(zhì)體串(圖1-A)，成串后，給予適當(dāng)?shù)闹绷髅}沖(脈沖強(qiáng)度為200 V/cm，幅寬為40 μs，脈沖次數(shù)為3次)，部分相互接觸的原生質(zhì)體則會(huì)發(fā)生融合(圖1-B～1-D)。其總?cè)诤下屎鸵粚σ蝗诤下史謩e可達(dá)到25.39% 和12.27%。

圖1 原生質(zhì)體電融合的過程Fig.1 The process of protoplast electrofusion

3 討論

3.1電融合法在草地早熟禾體細(xì)胞雜交中的應(yīng)用

1979年，Sencia等[24]建立了電融合法。與PEG融合法相比，電融合法避免了高Ca2+高pH強(qiáng)加于原生質(zhì)體的生理?xiàng)l件對融合原生質(zhì)體的傷害，同時(shí)，其便于融合過程中精準(zhǔn)化的控制和比較，且可提高原生質(zhì)體的融合率[25]。目前，國內(nèi)外均已建立了草地早熟禾的原生質(zhì)體培養(yǎng)體系[15-17]，然而，有關(guān)草地早熟禾原生質(zhì)體融合的研究報(bào)道卻很少。因此，筆者首次對電融合法在草地早熟禾原生質(zhì)體融合中的應(yīng)用條件進(jìn)行了一定的探索。

前人的研究表明，電融合法在高羊茅(Festucaarundinacea)與多花黑麥草(Loliummultiflorum)[26]、多花黑麥草與小麥(Triticumaestivum)[27]等禾本科植物中均取得了較好的結(jié)果。研究表明，在AC電壓為20 V/cm、AC頻率為2 000 kHz、DC脈沖強(qiáng)度為200 V/cm、DC幅寬為40 μs、DC脈沖次數(shù)為3次和原生質(zhì)體密度為3×105個(gè)/mL的條件下，草地早熟禾種間原生質(zhì)體融合率可達(dá)到25.39%，而趙小強(qiáng)等[28]采用PEG法在草地早熟禾種內(nèi)原生質(zhì)體融合的研究中所得到的融合率僅為9.8%，試驗(yàn)采用電融合法所得到的融合率是其采用PEG法的2.6倍。

3.2草地早熟禾原生質(zhì)體電融合參數(shù)

電融合過程可分解為兩步，首先是交流電場使得原生質(zhì)體2～3個(gè)串在一起，最后是給予直流脈沖使得串在一起的原生質(zhì)體發(fā)生融合，因此，影響電融合的參數(shù)就是交流電場和直流脈沖相關(guān)參數(shù)。

交流電場能促進(jìn)原生質(zhì)體的偶極化，進(jìn)而使相鄰的原生質(zhì)體排列成串。交流電壓過低時(shí)，原生質(zhì)體無法成串或成串需要耗費(fèi)比較長的時(shí)間，不利于后期直流脈沖誘發(fā)原生質(zhì)體融合，而交流電場強(qiáng)度過高時(shí)，會(huì)使原生質(zhì)體短時(shí)間內(nèi)形成很長的串珠，則導(dǎo)致后期原生質(zhì)體融合時(shí)形成多細(xì)胞融合體[29]。研究表明，在交流電場強(qiáng)度為20 V/cm和交流電場頻率為2 000 kHz，草地早熟禾原生質(zhì)體可在較短時(shí)間內(nèi)形成2～3個(gè)原生質(zhì)體的串珠，該結(jié)果與張凌云等[23]在苜蓿(Medicagosativa)原生質(zhì)體電融合研究中所得到的結(jié)果相似。然而，魏彩霞等[29]研究表明，馬鈴薯(Solanumtuberosum)原生質(zhì)體電融合的最佳交流電場強(qiáng)度為110 V/cm，這種差異可能是電融合儀的型號(hào)不同導(dǎo)致，不同的植物種之間原生質(zhì)體電融合的條件也會(huì)存在一定的差異[23,30]。

直流脈沖通過脈沖電壓，脈沖幅寬和脈沖次數(shù)3個(gè)參數(shù)影響著原生質(zhì)體融合頻率[23,30]。脈沖電壓強(qiáng)度的大小預(yù)示著細(xì)胞膜能否被擊穿及是否或?qū)е录?xì)胞膜的不可逆性損傷，在原生質(zhì)體融合時(shí)，找到適宜的直流脈沖電場強(qiáng)度、脈沖幅寬和脈沖次數(shù)的相應(yīng)閾值，可避免直流脈沖強(qiáng)度過高引發(fā)的原生質(zhì)體細(xì)胞膜的破碎，使得細(xì)胞質(zhì)膜產(chǎn)生可逆性的擊穿恢復(fù)，從而提高原生質(zhì)體的融合頻率[29]。研究表明，直流脈沖強(qiáng)度為200 V/cm、直流幅寬為40 μs和直流脈沖次數(shù)為3次時(shí)，草地早熟禾原生質(zhì)體的融合率最高，且原生質(zhì)體狀態(tài)完好，而當(dāng)直流脈沖強(qiáng)度為250 V/cm、直流幅寬為80 μs和直流脈沖次數(shù)為4次時(shí)，原生質(zhì)體出現(xiàn)變形，破碎嚴(yán)重的情況，其融合率也隨著降低。

4 結(jié)論

草地早熟禾種間原生質(zhì)體電融合的最佳參數(shù)為： AC電壓為20 V/cm、AC頻率2 000 kHz、DC脈沖強(qiáng)度200 V/cm、DC幅寬40 μs、DC脈沖3次和原生質(zhì)體密度為3×105個(gè)/mL。

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StudyontheconditionsforelectrofusionofinterspecificprotoplastsinPoapratensis

NIU Kui-ju,ZHANG Ran,ZHAO Chun-xu,MA Hui-ling

(CollegeoPrataculturalScience,GansuAgriculturalUniversity,KeylaboratoryofGrasslandEcosystem,MinistryofEducation,Sino-U.S.CentersforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China)

The conditions for electrofusion of interspecific protoplasts in genus ofPoapratensiswere studied.The results showed that the optimum AC (alternating current) electric field intensity and frequency were 20 V/cm and 2 000 kHz,and the bunch could be obtained in a relatively short time.The optimum DC (direct current) electric field intensity was 200 V/cm with 40 μs pulse width and 3 pulse frequency.The optimal protoplast density was 3×105number/mL.Under these conditions,the highest total fusion frequency and binary fusion frequency reached 25.39% and 12.27%,respectively.

Poapratensis;protoplast;electrofusion;interspecific somatic hybridization

S 543；Q 813.2

A

1009-5500(2017)05-0030-06

2017-02-28；

2017-03-22

國家自然科學(xué)基金“草地早熟禾種間體細(xì)胞雜交的研究”項(xiàng)目(31160482)資助

?？e(1991-)，男，甘肅通渭人，在讀博士。

E-mail：niukuiju@163.com

馬暉玲為通訊作者。