中藥川貝母對哮喘模型小鼠MMP2，MMP9和TIMP1的影響

李厚忠　高照渝　黃偉　任公平　徐紅納　張欣　付惠　張羽飛

[摘要]觀察中藥川貝母對哮喘模型小鼠氣道重塑及基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）與基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑1（TIMP1）的影響，探討其治療哮喘的作用機制。BALB/C小鼠，隨機分為正常組、模型組、高劑量組、低劑量組、陽性對照組。除正常組外，其他各組用卵蛋白（OVA）建立哮喘小鼠模型。造模成功后高劑量組和低劑量組分別按180，90 mg·kg-1劑量給予中藥川貝母灌胃；陽性對照組于腹腔注射05 mg·kg-1劑量地塞米松；正常組和模型組等量生理鹽水灌胃，每天1次，連續(xù)28 d。觀察各組小鼠氣道反應性的變化，支氣管肺泡灌洗液（BALF）中細胞總數(shù)和白細胞分類的變化以及支氣管管壁厚度和支氣管平滑肌厚度的變化；ELISA法檢測MMP2，MMP9，TIMP1水平；RTPCR檢測MMP2，MMP9，TIMP1 mRNA的表達。結(jié)果顯示，模型組氣道反應性、BALF中細胞總數(shù)以及中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞和嗜酸性粒細胞計數(shù)、支氣管管壁厚度和支氣管平滑肌厚度明顯高于正常組（P<001），高劑量組和低劑量組與陽性對照組則明顯低于模型組（P<005或P<001）；模型組MMP2，MMP9和TIMP1水平和mRNA表達明顯高于正常組（P<001），高劑量組和低劑量組與陽性對照組則明顯低于模型組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<001）。推斷中藥川貝母可改善哮喘模型小鼠氣道重塑狀態(tài)，其機制可能與其降低MMP2，MMP9和TIMP1有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]川貝母； 哮喘； 基質(zhì)金屬蛋白酶2； 基質(zhì)金屬蛋白酶9； 基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑1

[Abstract]To investigate the effects of Fritillariae Cirrhosae Bulbus on airway remodeling and matrix metalloproteinase2（MMP2）， matrix metalloproteinase9（MMP9）， tissue inhibitor1 of metalloproteinase（TIMP1） of a murine asthma model， and explore its mechanism in treatment of asthma BALB/C murines were randomly divided into the normal group， model group， high dose group， low dose group， and positive control group Except for the normal group， all the other groups received ovalbumin（OVA） to establish murine asthma model After successful modeling， the murines in high dose group and low dose group were orally administered with Fritillariae Cirrhosae Bulbus powder at the dose of 180 mg·kg-1 and 90 mg·kg-1， respectively； the murines in positive control group were injected intraperitoneally with dexamethasone at the dose of 05 mg·kg-1； while the murines in normal group and the model group were orally administered with the same volume of normal saline All the drugs were given to murines per day for 28 d The variations of airway responsiveness， variations of the total cell count and leukocyte differential count in bronchoalveolar lavage fluid（BALF）， and the variations of thicknesses of bronchial wall and airway smooth muscle of each group were observed The levels of MMP2， MMP9 and TIMP1 were measured by ELISA； and the expression levels of MMP2， MMP9 and TIMP1 mRNA were detected by RTPCR The results showed that as compared with the normal group， the airway responsiveness， the count of total cells， neutrophils， macrophage， lymphocytes， eosinophils in BALF， and the thicknesses of bronchial wall and airway smooth muscle were increased significantly in the model group（P<001）； as compared with the model group， the above indicators were decreased significantly in the high dose group， low dose group and positive control group （P<005 or P<001） As compared with the normal group， the levels and expressions of MMP2， MMP9 and TIMP1 mRNA were increased significantly in the model group（P<001）； while as compared with the model group， these levels were decreased significantly in the high dose group， low dose group and positive control group（P<001） In conclusion， Fritillariae Cirrhosae Bulbus can improve airway remodeling in a murine asthma model， and its mechanisms may be related to downregulating MMP2， MMP9 and TIMP1 levels.endprint

[Key words]Fritillariae Cirrhosae Bulbus； asthma； matrix metalloproteinase2； matrix metalloproteinase9； tissue inhibitor1 of metalloproteinase

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是全球范圍內(nèi)威脅公眾健康的最常見慢性呼吸道疾病，發(fā)病機制復雜，至今尚未完全明確，近年發(fā)病率呈上升趨勢，尤其在兒童[1]。目前臨床上常用的藥物，如糖皮質(zhì)激素、白三烯受體拮抗藥等，能迅速控住氣道炎癥，效果良好，但是仍然存在一些弊端，如停藥后的復發(fā)，長期用藥導致全身或局部的不良反應等[23]，而中醫(yī)藥在哮喘的治療方面歷來有其獨特的優(yōu)勢。川貝母是具有代表性的川產(chǎn)道地名貴藥材，為臨床常用中藥，其性苦、甘，微寒，有化痰止咳、清熱散結(jié)、潤肺之功效，多用于熱痰、燥痰、肺虛勞嗽、久嗽、痰少咽燥、痰中帶血等[4]。前期實驗表明，川貝母可有效降低哮喘模型小鼠一氧化氮（NO）、腫瘤壞死因子α（TNFα）、丙二醛（MDA）、白細胞介素1（IL1）、白細胞介素6（IL6）水平，升高超氧化物歧化酶（SOD）活力等，同時也降低哮喘模型小鼠血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和缺氧誘導因子1α（HIF1α）的表達，且呈一定的量效關(guān)系[57]。本研究旨在前期研究基礎上，繼續(xù)探討觀察中藥川貝母對哮喘模型小鼠氣道反應性、氣道炎癥及氣道重塑的影響，為闡明可能作用機制，本研究還觀察了其對基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）與基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑1（TIMP1）的影響。

1材料

11動物雌性BALB/C小鼠60只，6～8周齡，由哈爾濱醫(yī)科大學動物實驗中心提供，實驗動物合格證號SCXK（黑）2015001，實驗動物使用許可證號SYXK（黑）2015007。空調(diào)恒溫室內(nèi)22 ℃，相對濕度50%，自由飲水飲食，通風換氣20次/h，適應性飼養(yǎng)1周。

12儀器與試劑微量加樣器（3112）由德國eppendorf生產(chǎn)；自動平衡離心機（LDZ52）由北京京立離心機有限公司生產(chǎn)；電子天平（UW820S）由日本島津生產(chǎn)；超聲霧化器（402A）由江蘇魚躍醫(yī)療設備股份有限公司生產(chǎn)；光學顯微鏡（BH2）由日本Olympus 公司生產(chǎn)；粉碎機組（Fz400）由天津市茂源制藥機械有限公司生產(chǎn)；卵蛋白（OVA）由美國Sigma 公司生產(chǎn)（貨號ZY10652）；地塞米松磷酸鈉注射液由白云山天星制藥股份有限公司生產(chǎn)（批號160503）；MMP2，MMP9和TIMP1測試盒由美國ADL公司生產(chǎn)（貨號分別為27631，25511和21091）。其他試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

13中藥川貝母粉的制備選取整齊、粉性足者川貝母（由牡丹江醫(yī)學院附屬紅旗醫(yī)院中藥房提供，經(jīng)牡丹江醫(yī)學院醫(yī)藥研究中心初彥輝教授鑒定均符合2015年版《中國藥典》要求）。用潔凈的紗布擦拭藥材表面以去除藥材表面的灰塵。凈選后的川貝母通過滅菌消毒窗消毒15 min后直接轉(zhuǎn)至粉碎車間，用Fz400型粉碎機組加工成100目細粉，收得的細粉裝入潔凈的容器中，封口。全部加工完后的細粉用潔凈的塑料袋分裝成每袋1 kg備用。臨用時，參照唐德才等主編的《中藥學》所載成人所用劑量為3～6 g·d-1，根據(jù)動物體表面積等效劑量計算方法，計算小鼠給藥劑量180 mg·kg-1為高劑量組，90 mg·kg-1為低劑量組。分別稱取川貝母粉18，9 mg各溶于生理鹽水5 mL制成混懸液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2方法

21模型建立健康清潔級BALB/C小鼠50只，腹腔內(nèi)注射02 mg OVA+1 mg 氫氧化鋁粉末制成的混懸液02 mL作為首次致敏，第15天將小鼠依次置于超聲霧化器中，用1%OVA生理鹽水噴霧激發(fā)小鼠哮喘發(fā)作，隔日1次，每次20 min，共激發(fā)10 d。以小鼠出現(xiàn)口唇發(fā)紺、腹肌痙攣、呼吸加快、點頭呼吸或站立不穩(wěn)等表現(xiàn)表示成功激發(fā)。共制備成功40只。

22分組及給藥將成功制備的哮喘模型小鼠隨機分為：模型組、高劑量組、低劑量組、陽性對照組，每組10只；另設正常組（10只以生理鹽水代替OVA進行腹腔注射及霧化吸入）。正常組和模型組給予等量生理鹽水灌胃；高、低劑量組分別按照180，90 mg·kg-1劑量給予川貝母粉混懸液06 mL灌胃；陽性對照組于腹腔注射05 mg·kg-1劑量地塞米松。每天1次，連續(xù)28 d。

23氣道反應性測定最后1次給藥2 h后，采用美國Buxco公司的無創(chuàng)肺功能儀檢測各組小鼠增強呼氣間歇（Penh）。將小鼠置于體描箱內(nèi)，適應5 min。使用不同質(zhì)量濃度（依次為000，3125，625，1250，2500，5000 g·L-1）的乙酰甲膽堿（Mch）進行支氣管激發(fā)，觀察不同濃度的Mch激發(fā)下Penh的變化情況，比較各組小鼠氣道反應性的改變。Penh=[（呼氣時間/松弛時間）-1]×（最大呼吸流量/最大吸氣量）。

24支氣管肺泡灌洗液（BALF）總細胞及白細胞分類計數(shù)氣道反應性測定結(jié)束24 h后，各組小鼠用1%巴比妥鈉麻醉，剪掉頸部毛發(fā)后剪開皮膚，分離氣管周圍的組織，氣管作一橫行切口，插入氣管插管。結(jié)扎右主支氣管，經(jīng)氣管插管以10 mL生理鹽水分3次灌洗左肺后，回收的BALF經(jīng)2 000 r·min-1離心15 min，棄上清液，取沉渣經(jīng)生理鹽水重懸，吸取少量細胞懸液置血細胞計數(shù)板下計數(shù)細胞總數(shù)。DiffQuik染色液染色BALF細胞涂片后，作細胞分類計數(shù)。切取右支氣管平滑肌固定于10%的中性福爾馬林中，用于支氣管管壁厚度和支氣管平滑肌厚度測量。切取右肺門部位組織用于ELISA和RTPCR分析。

25支氣管管壁厚度和支氣管平滑肌厚度測量將右支氣管平滑肌組織10%中性福爾馬林固定后，常規(guī)乙醇脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察。采用ImagePro Plus 60圖像分析軟件分別測量肺內(nèi)支氣管基底膜周徑（Pbm）、支氣管總面積（Wat），支氣管平滑肌面積（Wam），以Pbm標準化。支氣管管壁厚度=Wat/Pbm，支氣管平滑肌厚度=Wam/Pbm。endprint

26肺組織MMP2，MMP9和TIMP1水平測定取約1/2右肺勻漿，采用ELISA測定肺組織MMP2，MMP9和TIMP1水平，嚴格按照ELISA試劑盒的操作說明進行操作。

27RTPCR分析肺組織MMP2，MMP9和TIMP1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平Trizol試劑提取剩余右肺組織總RNA，檢測RNA純度，按照RTPCR試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄反應，合成單鏈的cDNA。cDNA 產(chǎn)物保存在-20 ℃。利用Pubmed查找相關(guān)基因序列，并利用引物合成軟件Primer Premier 50設計引物。RTPCR 反應體系：體積為25 μL；反應程序為95 ℃變性45 s，60 ℃復性60 s，72 ℃延伸45 s，共30個循環(huán)，72 ℃再延伸7 min。每個樣本以內(nèi)參基因βactin調(diào)整。擴增產(chǎn)物在15%瓊脂糖凝膠電泳后通過凝膠成像分析系統(tǒng)觀察并保存圖像。每份樣品檢測3次。引物序列見表1。

28統(tǒng)計學方法采用SPSS 170軟件進行描述性統(tǒng)計。計量資料用±s表示。多組間均數(shù)比較，采用Oneway ANOWA分析，組間兩兩比較，采用SNK法，當P<005為差異有統(tǒng)計學意義。

3結(jié)果

31川貝母對哮喘模型小鼠氣道反應性的影響與正常組比較，模型組小鼠在吸入各濃度Mch時Penh均顯著升高（P<001），并且此差異具有濃度依賴性；與模型組比較，高、低劑量組與陽性對照組小鼠各濃度Mch時Penh均顯著降低（P<005或P<001），見表2。

32川貝母對哮喘模型小鼠BALF總細胞及分類細胞計數(shù)的影響與正常組比較，模型組小鼠BALF總細胞數(shù)及中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞和嗜酸性粒細胞計數(shù)均顯著升高（P<001）；與模型組比較，高、低劑量組與陽性對照組小鼠BALF總細胞數(shù)及中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞和嗜酸性粒細胞計數(shù)均顯著降低（P<005或P<001），見表3。

33川貝母對哮喘模型小鼠支氣管管壁厚度和支氣管平滑肌厚度的影響HE染色結(jié)果顯示，正常組小鼠支氣管壁完整，平滑肌呈正常厚度，支氣管黏膜平整，細胞排列整齊；模型組小鼠基層細胞增生，排列紊亂，平滑肌增厚，支氣管黏膜上皮脫落，水腫；高、低劑量組、陽性對照組小鼠支氣管氣管壁和平滑肌厚度降低，幾乎接近正常對照組，見圖1。與正常組比較，模型組小鼠支氣管管壁厚度和支氣管平滑肌厚度均顯著增高（P<001）；與模型組比較，高、低劑量組與陽性對照組小鼠支氣管管壁厚度和支氣管平滑肌厚度均顯著降低（P<005或P<001），見表4。

34川貝母對哮喘模型小鼠MMP2，MMP9和TIMP1水平的影響與正常組比較，模型組小鼠MMP2，MMP9和TIMP1水平均顯著升高（P<001）；與模型組比較，高、低劑量組與陽性對照組小鼠MMP2，MMP9和TIMP1水平均顯著降低

A正常組；B模型組；C高劑量組；D低劑量組；E陽性對照組（圖2同）。

35川貝母對哮喘模型小鼠MMP2，MMP9和TIMP1 mRNA的影響與正常組比較，模型組小鼠MMP2，MMP9和TIMP1 mRNA均顯著升高（P<001）；與模型組比較，高、低劑量組與陽性對照組小鼠MMP2，MMP9和TIMP1 mRNA顯著降低（P<001），見圖2和表6。

4討論

哮喘是一種呼吸系統(tǒng)的常見的慢性炎癥性疾病，其病理特點表現(xiàn)為氣道炎癥導致持續(xù)性氣道高反應性及可逆性氣流阻塞。而氣道重塑是哮喘的重要特征，是引起氣道發(fā)生氣道高反應性及氣流阻塞的重要機制之一，與哮喘的反復發(fā)作和遷延不愈密切相關(guān)。

氣道的炎癥是哮喘的特征性病理改變，包括多種炎性細胞參與，如中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞和嗜酸性粒細胞等[8]。動物實驗研究表明，BALF

中存在大量的中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞和嗜酸性粒細胞是哮喘的典型特征[910]。當哮喘發(fā)作時，誘發(fā)了機體的免疫反應，引起中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞和嗜酸性粒細胞活化、向炎癥部位趨化、聚集，從而釋放炎性介質(zhì)（如內(nèi)皮素、血小板活化因子、白三烯、組胺等）間接或者直接損傷氣道上皮細胞，引發(fā)氣道炎癥或氣道高反應性[11]。故此，中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞和嗜酸性粒細胞也

稱為哮喘的主要炎癥效應細胞，與哮喘的嚴重程度呈正相關(guān)，是哮喘臨床診斷最為重要的指標。本研究顯示，模型組小鼠BALF中存在大量的中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞和嗜酸性粒細胞，與以往研究相一致，正常組小鼠BALF中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞和嗜酸性粒細胞較少；而高、低劑量組及陽性對照組小鼠BALF中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞和嗜酸性粒細胞均較模型組降低。以上結(jié)果提示，川貝母可有效抑制哮喘模型小鼠氣道炎癥反應，改善哮喘癥狀。

氣道高反應性是發(fā)生發(fā)展過程中的重要因素，也是哮喘的重要特征之一，炎癥細胞的激活及炎癥介質(zhì)的釋放可以使氣道反應性明顯增高[12]。本研究采用肺功能儀檢測各組小鼠Penh以反映氣道高反應的程度，即Penh越高，氣道反應性越高。本研究顯示，模型組小鼠Penh均較正常組顯著升高，提示模型組小鼠氣道呈高反應狀態(tài)；而高、低劑量組及陽性對照組小鼠Penh均較模型組降低。以上結(jié)果說明，川貝母可有效抑制哮喘模型小鼠氣道高反應性，改善哮喘癥狀。

長期以來，有關(guān)于哮喘的發(fā)生機制，人們一直把重點放在氣道炎癥上，然而氣道重塑在哮喘的發(fā)病過程中具有同樣的重要作用。氣道重塑以氣道慢性炎癥為發(fā)生基礎，為炎癥慢性發(fā)展的必然結(jié)果，被認為是哮喘防治的新靶點[13]。本研究顯示，模型組小鼠氣管管壁厚度和支氣管平滑肌厚度較正常組明顯增加，提示模型組小鼠存在氣道重塑；而高、低劑量組及陽性對照組小鼠氣管管壁厚度和支氣管平滑肌厚度均較模型組減小。以上結(jié)果說明，川貝母可有效抑制哮喘模型小鼠氣道重塑，改善哮喘癥狀。為探討川貝母抑制哮喘模型小鼠氣道重塑的可能機制，本研究對MMP2，MMP9和TIMP1進行了相關(guān)檢測。endprint

能夠引起哮喘氣道重塑的介質(zhì)種類較多，如血小板生長因子（PDGF），轉(zhuǎn)移生長因子β家族（TGFβ）等，但是目前研究較多的是基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）及其抑制劑（TIMPs）。MMPs是調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)代謝的主要限速酶，因需要Ca2+，Zn2+等金屬離子作為輔助因子而得名，為一個大家族。MMPs家族中與哮喘關(guān)系最密切相關(guān)的有MMP2和MMP9，TIMP1是MMP2和MMP9的生理性抑制劑。MMP2和MMP9與TIMP1系統(tǒng)的失衡是引起細胞外基質(zhì)降解和氣道重塑的重要原因[1415]。MMP2和MMP9可有效降解IV型膠原，從而降解基底膜，促使嗜酸性粒細胞等炎癥細胞氣道內(nèi)浸潤，使氣道平滑肌和周圍組織改變發(fā)生氣道重塑[16]。TIMP1通過與MMP2，MMP9的催化位點結(jié)合或與酶原的某些位點結(jié)合而抑制MMP2，MMP9活性，使細胞外基質(zhì)降解減少，并使其降解產(chǎn)物在黏膜下層聚集，引起氣道壁增厚，促使氣道重塑的發(fā)生及進展，被認為是氣道重塑的標志[17]。故此，調(diào)節(jié)MMP2，MMP9及TIMP1水平可能是抑制哮喘氣道重塑的有效方法。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠MMP2和MMP9水平及基因表達較正常組均升高，提示MMP2和MMP9可能參與哮喘氣道重塑的形成過程，同時，模型組小鼠TIMP1水平及基因表達較正常組也升高，提示可能由于MMP2，MMP9的增高刺激TIMP1反應性增高，與以往研究結(jié)果相一致[18]。而高、低劑量組及陽性對照組小鼠MMP2，MMP9和TIMP1水平及基因表達均較模型組減小。以上結(jié)果說明，川貝母可能通過抑制MMP2，MMP9和TIMP1而抑制哮喘模型小鼠氣道重塑。

綜上所述，中藥川貝母可有效降低哮喘模型小鼠的氣道炎癥反應和氣道高反應性，同時也具有抑制氣道重塑的作用，其機制可能與其抑制MMP2，MMP9和TIMP1有關(guān)。至于是否存在其他機制，如是否與轉(zhuǎn)移生長因子β1（TGFβ1）有關(guān)，將繼續(xù)探討。

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[責任編輯張寧寧]endprint