喬木　程碧軍　武華玉

摘要：旨在研究反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子1基因（retrotransposon-like-1，RTL1）潛在的變異與豬胴體和肉質(zhì)性狀的相關(guān)性。測(cè)序發(fā)現(xiàn)在豬RTL1基因編碼區(qū)1 209 bp處存在G/A突變，利用PCR-Fnu4H I-RFLP方法在9個(gè)豬種中進(jìn)行了基因分型，并且在360頭大白豬×梅山豬F2代群體中進(jìn)行性狀關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明，該位點(diǎn)與皮率、內(nèi)脂率、6-7腰椎間膘厚、胸腰椎間膘厚、背最長(zhǎng)肌pH、股二頭肌肌肉色值呈顯著相關(guān)（P<0.05），與骨率、肩部膘厚、臀部膘厚、平均背膘厚、背最長(zhǎng)肌失水率、背最長(zhǎng)肌系水力、背最長(zhǎng)肌肌肉色值呈極顯著相關(guān)（P<0.01）。

關(guān)鍵詞：豬；RTL1基因；單核苷酸多態(tài)性；性狀關(guān)聯(lián)分析

中圖分類號(hào)：S828.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）20-3948-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.20.038

Abstract： This study was conducted to investigate the potential association of variation in the retrotransposon-like-1 （RTL1） gene with carcass and meat quality traits in pigs. Cloning and sequencing found that there was a G/A mutation at 1 209 bp in the porcine RLT1 gene coding region. Using PCR-RFLP， SNP of RTL1 gene was detected in nine different pig breeds and performed associations with carcass and meat quality traits in 360 Large White and Meishan F2 hybrids. The results showed this polymorphism is significant association with skin percentage，internal fat rate，6-7 rib fat thickness，thorax-waist fat thickness，Meat pH（m.longissimus Dorsi，LD） and meat color value（BF）（P<0.05），is higher significant association with bone percentage，shoulder fat thickness，buttock fat thickness，average backfat thickness，longissimus dorsi drip loss rate，longissimus dorsi water holding capacity and meat color value （LD）（P<0.01）.

Key words： pig； RTL1 gene； single nucleotide polymorphism （SNP）； association analysis

反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子1基因（Retrotransposon-like-1，RTL1），又名父本表達(dá)基因11（paternally expressed gene 11，Peg11）， 在人和小鼠中為父本表達(dá)的印記基因，不含內(nèi)含子序列[1，2]。RTL1基因在胚胎和胎盤組織中表達(dá)量很高，對(duì)母體胎盤與胎兒的營(yíng)養(yǎng)傳遞起著重要作用，敲除該基因的小鼠表現(xiàn)為胎兒死亡率升高、新生兒生長(zhǎng)停滯、胎盤尺寸偏小[3]； 與人的胎兒發(fā)育和新生兒的生長(zhǎng)也有密切關(guān)系[4，5]。該基因位于DLK1-DIO3印記區(qū)域，該區(qū)域基因?qū)∪獍l(fā)育和脂肪沉積有一定的影響[6，7]，在轉(zhuǎn)基因小鼠中異位表達(dá)RTL1基因，會(huì)導(dǎo)致肌肉肥大[8]；此外，該基因與callipyge綿羊的肌肉肥大相關(guān)，雙肌臀的綿羊中RTL1基因的表達(dá)量是正常綿羊中的12倍[9，10]。RTL1基因與動(dòng)物的生長(zhǎng)和肉質(zhì)性狀有著密切的關(guān)系。目前關(guān)于此基因在豬中的研究較少，本研究分離克隆了RTL1基因，對(duì)其遺傳多態(tài)性進(jìn)行了篩選，并與豬胴體和肉質(zhì)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，以期獲得豬生產(chǎn)性狀相關(guān)的新分子標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

采集大白豬和梅山豬（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)豬場(chǎng)）各4頭血樣，提取基因組DNA，用于基因克隆及多態(tài)性檢測(cè)；

大白豬×梅山豬F2代群體360頭（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)豬場(chǎng)），收集性狀記錄，用于關(guān)聯(lián)分析；采集9個(gè)品種豬的DNA樣品包括：大白豬、長(zhǎng)白豬、梅山豬、皮特蘭豬、杜洛克豬、陽(yáng)新豬、皖南豬、鄂西黑豬和監(jiān)利豬，用于基因型頻率分析。

1.2 PCR擴(kuò)增、測(cè)序及SNP篩選

基因組DNA的提取采用QIAGEN公司的DNA提取試劑盒（QlAamp DNA Mini Kit50），按照說(shuō)明書進(jìn)行提取。

根據(jù)豬RTL1基因的基因組序列（GenBank登錄號(hào)：ACF47571），采用Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物。上游引物：5′-AGGGCCACCCCAGCCTCGA-3′，下游引物：5′-GGCTTCTCGAAGAGCTGGAC-3′，由北京奧科生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體積為20 μL：DNA 模板1 μL、2×Taq PCR Mix 10 μL、ddH2O 8 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各0.5 μL。PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性40 s，66.8 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物于1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，以3 μL DNA Marker DL 2000作為參照。電泳結(jié)束后，用凝膠成像系統(tǒng)觀察擴(kuò)增結(jié)果。將目的條帶用百泰克試劑盒回收純化，回收后的PCR產(chǎn)物與pMD-18T 載體連接并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞， 克隆子送至北京奧科生物技術(shù)有限公司測(cè)序，序列比對(duì)篩選SNP。endprint

1.3 SNP驗(yàn)證

采用PCR-Fnu4H Ⅰ-RFLP方法對(duì)SNP位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。酶切體系為10 μL，其中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL，10×Buffer 1 μL，限制性內(nèi)切酶0.5 μL（10 U/μL），ddH2O 3.5 μL，37 ℃酶切反應(yīng)4 h，后經(jīng)2.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SAS 8.0軟件的GLM程序進(jìn)行標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析，采用REG程序計(jì)算基因的加性效應(yīng)和顯性效應(yīng)，所用模型[11]為Yijkl=μ+Gi+Fj+Sk+Yl（+bijklXijkl）+eijkl。Yijkl為性狀表型值，μ為群體均值，Gi為基因型效應(yīng)，Sk為性別效應(yīng)，Yl是年份效應(yīng)，F(xiàn)j和Yl分別為家系和年度效應(yīng)，bijk為屠宰體重的回歸系數(shù)，Xijk是協(xié)變量屠宰體重，eijk為殘差效應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬RTL1基因多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果

豬RTL1基因外顯子1 209 bp處的G/A突變能夠引起外切酶Fnu4H Ⅰ酶切位點(diǎn)的改變，當(dāng)該位點(diǎn)為G時(shí)，可以被內(nèi)切酶Fnu4H Ⅰ切為兩個(gè)片段126 bp和40 bp（GG型），當(dāng)該位點(diǎn)為A時(shí)不能被酶切，片段大小為166 bp（AA型），當(dāng)G和A都存在時(shí)，有3條帶，即126、40和166 bp（AG型）， 酶切分型結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2 豬RTL1基因SNP位點(diǎn)在不同豬種中的分布規(guī)律

在9個(gè)中外豬種中進(jìn)行多態(tài)性分布檢測(cè)，其中5個(gè)國(guó)內(nèi)豬種（梅山豬、陽(yáng)新豬、皖南豬、監(jiān)利豬和鄂西黑豬）和4個(gè)外來(lái)品種（大白豬、長(zhǎng)白豬、杜洛克豬和皮特蘭豬），結(jié)果如表1所示。G等位基因頻率在國(guó)外豬中占優(yōu)勢(shì)，在國(guó)內(nèi)豬種中A等位基因占優(yōu)勢(shì)。

2.3 關(guān)聯(lián)分析

在360頭大白豬×梅山豬F2代群體中分析了豬RTL1基因SNP位點(diǎn)基因型與胴體性狀和肉質(zhì)性狀的相關(guān)性。如表2和表3所示，與皮率、內(nèi)脂率、6-7腰椎間膘厚、胸腰椎間膘厚、背最長(zhǎng)肌pH、股二頭肌肌肉色值呈顯著相關(guān)（P<0.05），與骨率、肩部膘厚、臀部膘厚、平均背膘厚、背最長(zhǎng)肌失水率、背最長(zhǎng)肌系水力、背最長(zhǎng)肌肌肉色值呈極顯著相關(guān)（P<0.01）。

3 討論

本研究通過(guò)PCR-Fnu4H Ⅰ-RFLP方法在360頭大白豬×梅山豬F2 代群體中檢測(cè)了RTL1基因外顯子1 209 bp處G/A突變位點(diǎn)，關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示RTL1基因與胴體性狀和肉質(zhì)性狀呈顯著相關(guān)。AA基因型個(gè)體的內(nèi)脂率、肩部膘厚、6-7腰椎間膘厚、胸腰椎間膘厚、臀部膘厚、平均背膘厚顯著高于GG基因型，這與不同品種中基因型分布規(guī)律相吻合，國(guó)內(nèi)豬種中A等位基因占優(yōu)勢(shì)，而國(guó)內(nèi)豬種比國(guó)外豬種具有較高的肥肉率，說(shuō)明A等位基因有促進(jìn)脂肪沉積的效應(yīng)。在肉質(zhì)性狀方面，AA基因型個(gè)體與比GG基因型個(gè)體相比，具有較高的背最長(zhǎng)肌肌肉色值和股二頭肌肌肉色值，較低的背最長(zhǎng)肌pH和背最長(zhǎng)肌系水力，說(shuō)明該位點(diǎn)可以作為改善豬肉質(zhì)性狀的分子標(biāo)記。

在基因效應(yīng)方面，皮率、板油重、內(nèi)脂率、6-7腰椎間膘厚、胸腰椎間膘厚、背最長(zhǎng)肌pH等性狀加性效應(yīng)顯著（P<0.05），骨率、肩部膘厚、臀部膘厚等性狀加行效應(yīng)極顯著（P<0.01）。加性效應(yīng)是可以遺傳的，因此可以采用分子標(biāo)記輔助選擇和常規(guī)選擇項(xiàng)結(jié)合的方法對(duì)豬皮率、板油重、內(nèi)脂率等性狀進(jìn)行固定[12]。RTL1基因可以作為改善豬脂肪沉積和肉質(zhì)性狀的候選基因。

參考文獻(xiàn)：

[1] KAGAMI M，SEKITA Y，NISHIMURA G，et al. Deletions and epimutations affecting the human 14q32.2 imprinted region in individuals with paternal and maternal upd（14）-like phenotypes[J].Nature Genet，2008，40：237-242.

[2] SEKITA Y，WAGATSUMA H，NAKAMURA K，et al. Role of retrotransposon-derived imprinted gene，Rtl1，in the feto-maternal interface of mouse placenta[J].Nature Genet，2008，40：243-248.

[3] KITAZAWA M，TAMURA M，KANEKO-ISHINO T，et al. Severe damage to the placental fetal capillary network causes mid-to late fetal lethality and reduction in placental size in Peg11/Rtl1 KO mice[J].Genes to Cells，2017，22（2）：174-188.

[4] KOTZOT D. Maternal uniparental disomy 14 dissection of the phenotype with respect to rare autosomal recessively inherited traits，trisomy mosaicism，and genomic imprinting[J].Ann Genet，2004，47（3）：251-260.

[5] PRATS-PUIG A，CARRERAS-BADOSA G，BASSOLS J，et al. The placental imprinted DLK1-DIO3 domain：A new link to prenatal and postnatal growth in human beings[J].American Journal of Obstetrics and Gynecology.DOI：http：//dx.doi.org/10.1016/j.ajog.2017.05.002endprint

[6] KIM K S，KIM J J，DEKKERS J C，et al. Polar overdominant inheritance of a DLK1 polymorphism is associated with growth and fatness in pigs[J].Mammalian Genome，2004，15（7）：552-559.

[7] LI X，DO K，KIM J J，et al. Molecular characteristics of the porcine DLK1 and MEG3 genes[J].Animal Genetics，2008，39：189-192.

[8] XU X W，ECTORS F，DAVIS E E，et al. Ectopic expression of retrotransposon-derived PEG11/RTL1 contributes to the callipyge muscular hypertrophy[J].PloS One，2015，10（10）：e0140594.

[9] BIDWELL C A，KRAMER L N，PERKINS A C，et al. Expression of PEG11 and PEG11AS transcripts in normal and callipyge sheep [J].BMC Biology，2004，2：17-27.

[10] FLEMING-WADDELL J N，OLBRICHT G R，TAXIS T M，et al. Effect of DLK1 and RTL1 but not MEG3 or MEG8 on muscle gene expression in Callipyge lambs[J].PLoS One，2009， 4（10）：1-15.

[11] WU H Y，QIAO M，PENG X W，et al. Molecular characterization，expression patterns，and association analysis with carcass traits of porcine USF1 gene[J].Applied Biochemistry & Biotechnology，2013，170（6）：1310-1319.

[12] 武華玉，程碧軍，喬 木，等.豬MBF1基因的克隆與序列分析[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，54（22）：5748-5751.endprint