劉芳+譚榜憲+彭小東+杜國(guó)波+蔣琳

【摘要】 目的：旨在探討亞甲基四氫葉酸還原酶MTHFR基因C677T多態(tài)性與食管癌生存期的關(guān)系。方法：收集155例在川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院確診的食管鱗癌患者，調(diào)查患者的生活習(xí)慣并收集病理資料，采用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)檢測(cè)（PCR-RFLP）的方法檢驗(yàn)研究對(duì)象的MTHFR基因型，使用Pearon 字2檢驗(yàn)評(píng)估MTHFR基因C677T多態(tài)性與食管癌患者性別、年齡、吸煙、飲酒、食用水果習(xí)慣、病變長(zhǎng)度等臨床資料及病理特點(diǎn)之間的關(guān)系。用Kaplan-Meier方法和Cox回歸模型分析基因型與患者總生存時(shí)間之間的相關(guān)性。結(jié)果：攜帶MTHFR三個(gè)不同基因型（突變型、野生型、雜合型）的總生存時(shí)間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.462），而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性食管癌患者的總生存時(shí)間比較明顯短于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性者（P=0.000），TNM分期Ⅲ期食管癌患者的總生存時(shí)間明顯短于Ⅲ期以下者（P=0.002）。多變量Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期是影響食管癌生存時(shí)間的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素（P<0.05），而性別、年齡、吸煙、飲酒、水果習(xí)慣、UGIC史、病變長(zhǎng)度、首發(fā)癥狀、病變長(zhǎng)度、MTHFR基因C677T多態(tài)性與食管癌的預(yù)后無(wú)關(guān)。結(jié)論：MTHFR基因C677T單核苷酸多態(tài)性可能與食管癌患者的預(yù)后無(wú)關(guān)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期可以提示預(yù)后。

【關(guān)鍵詞】 食管癌； 多態(tài)性； MTHFR； 預(yù)后

【Abstract】 Objective：To discuss the relationship between methylenetetrahydrofolate reductase（MTHFR） C677T polymorphism and the prognosis of esophageal cancer.Method：A total of 155 patients with esophageal squamous cell carcinomas which were diagnosed in Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College.Survey patients' habits and collect their pathological data.MTHFR C677T polymorphism in these patients were determined by Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism（PCR-RFLP）methods.Pearon chi-square was used to discuss the relationship between MTHFR gene C677T polymorphisms and the clinical data and pathological characteristics，such as patients gender，age，smoking，drinking，eating fruit habits，length of lesion and so on.Kaplan Meier method and Cox regression model were used to analyze the correlation between genotypes and total survival time of patients.Result：Overall survival（OS） of patients with MTHFR gene C677T mutation type TT，OS of patients with wild type CC and MST of patients with hybrid type CT were not significant different（P=0.462）.OS of patients with lymph node metastasis was lower than that with negative lymph node metastasis（P=0.000）.OS of patients in stage Ⅲ was significantly was lower than that of below stageⅢ（P=0.002）.Cox multivariate analysis showed that lymph node metastasis and TNM stage were risk factors influencing survival（P<0.05）.However，gender，age，smoking，drinking，habits of fruit，UGIC history，length of lesion，original symptom and MTHFR C677T polymorphisms were not related to the prognosis of patients with esophageal cancer.Conclusion：Polymorphisms of MTHFR C677T may have nothing to do with the prognosis of patients with esophageal cancer.Lymph node metastasis and TNM stage may be potential prognostic factors to esophageal cancer patients.

【Key words】 Esophageal cancer； Polymorphisms； MTHFR； Prognosis

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.20.001endprint

我國(guó)是世界上食管癌發(fā)病率和死亡率最高的國(guó)家，在中國(guó)十大惡性腫瘤死亡率中，食管癌死亡率居第四位，中國(guó)食管癌死亡人數(shù)占全球的51.7%[1]，我國(guó)90%以上為鱗狀細(xì)胞癌。2012年，全球大約有456 000例新發(fā)病例和400 000例死亡病例，其中約半數(shù)的病例發(fā)生在中國(guó)[2-3]。手術(shù)治療是食管癌的主要治療手段之一，但食管癌預(yù)后差，中晚期患者治療后5年生存率不足20%[4]。臨床中常常發(fā)現(xiàn)即便是相同的病理類(lèi)型和分期的患者接受相同的治療方案后，其治療后生存率仍存在巨大的差異，提示個(gè)體的遺傳因素可能在食管癌治療效果和預(yù)后等方面起著重要的作用。

MTHFR是葉酸代謝和DNA甲基化過(guò)程中的限速酶，MTHFR基因在人群中具有高的單核苷酸多態(tài)性（SNP），其中最常見(jiàn)的是677位點(diǎn)上C→T的改變。該突變導(dǎo)致丙氨酸轉(zhuǎn)化為纈氨酸，從而導(dǎo)致酶的活性改變[5]。SNP作為一種常見(jiàn)的遺傳變異，可導(dǎo)致個(gè)體表型的差異以及不同個(gè)體對(duì)疾病的易感性，以及對(duì)環(huán)境因素和藥物及治療反應(yīng)的差異。MTHFR677C-T多態(tài)性與患者的預(yù)后的關(guān)系在不同類(lèi)型的惡性腫瘤有不同的結(jié)果[6-8]。有研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌、乳腺癌、非霍奇金淋巴瘤、肺癌、胃癌、食管癌等腫瘤的預(yù)后可能與MTHFR基因多態(tài)性有關(guān)[9]。本研究擬通過(guò)分析MTHFR677多態(tài)性與食管癌手術(shù)治療患者預(yù)后生存的相關(guān)性，探討影響食管癌預(yù)后的因素，為食管癌治療效果的評(píng)估提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 從2012年8月開(kāi)始收集川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胸外科確診為食管鱗癌患者共155例。從手術(shù)之日開(kāi)始隨訪，隨訪截止時(shí)間為2015年9月。所有研究對(duì)象均自愿參加調(diào)查，并在確診后接受面對(duì)面的流行病學(xué)問(wèn)卷調(diào)查。吸煙定義為每天至少一支，持續(xù)6個(gè)月以上。飲酒定義為每周飲用至少一次并持續(xù)6個(gè)月以上[10]。食用水果習(xí)慣定義為每日攝入水果至少一次并持續(xù)1年以上。將有一名以上一級(jí)親屬和/或兩名以上二級(jí)親屬患食管癌/賁門(mén)癌/胃癌的患者定義為上消化道腫瘤（upper gastrointestinal cancer，UGIC）家族史陽(yáng)性[11]?；颊咴谑中g(shù)前采用真空抗凝采血管收集外周靜脈血5 mL，-80 ℃超低溫冰箱長(zhǎng)期保存用于基因組DNA提取。所有患者術(shù)前均未行過(guò)放療、化療等抗腫瘤治療，所有患者術(shù)前進(jìn)行全面檢查排除遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，手術(shù)方式為食管切除和區(qū)域淋巴結(jié)清掃，食管胃胸頂或頸部吻合，常規(guī)清掃的淋巴結(jié)：氣管隆突下淋巴結(jié)、食管旁淋巴結(jié)、左下肺靜脈淋巴結(jié)、左下肺韌帶淋巴結(jié)、左肺動(dòng)脈淋巴結(jié)、賁門(mén)旁淋巴結(jié)和胃周淋巴結(jié)。

1.2 MTHFR基因C677T多態(tài)性分析 采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度（PCR-RFLP）的方法進(jìn)行基因多態(tài)分析，MTHFR基因C677T位點(diǎn)的PCR引物序列，上游引物‘TGAAGGAGAAGGTGT CTG CGG GA，下游引物‘AGGACGGTGCGGTGAGAGTG[12]，25 μL擴(kuò)增反應(yīng)體系中包含12.5 μL Go Taq Green Master Mix 2×，2.5 mL DNA模板，8 μL Nuclease-Free Water和引物各1 μL，反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)34次，最終72 ℃延伸7 min，產(chǎn)物為194 bp。然后取5 μL PCR產(chǎn)物，加入9 mL Nuclease-Free Water，1 μL 10×Buffer Tango，1 μL限制性內(nèi)切酶Hinf I限制性內(nèi)切酶，建立16 μL的反應(yīng)體積，混勻后離心9 s，置于37 ℃水浴箱中水浴孵育12 h。酶切反應(yīng)結(jié)束后，取8 μL酶切產(chǎn)物，加樣于已混有Goldview染色劑3%瓊脂糖凝膠中電泳（100 V電壓，1×TAE電泳緩沖液）40 min，待電泳結(jié)束后，以凝膠成像分析儀觀察分析電泳結(jié)果。突變基因型TT有兩個(gè)條帶（175 bp and 23 bp），雜合基因型CT有三個(gè)條帶（198 bp，175 bp and 23 bp），野生型CC有一個(gè)條帶198 bp，由于23 bp條帶太小無(wú)法顯示，見(jiàn)圖1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用Pearon 字2檢驗(yàn)評(píng)估3個(gè)位點(diǎn)基因型分布同食管癌患者性別、年齡、城市農(nóng)村、UGIC家族史、首發(fā)癥狀等臨床資料及病理特點(diǎn)（腫瘤病變長(zhǎng)度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否、TNM分期）的關(guān)系。使用Kaplan-Meier法進(jìn)行單因素生存分析，通過(guò)log-rank檢驗(yàn)比較不同生存率間的差異。使用Cox回歸模型校正年齡、性別、吸煙、飲酒、分化程度等因素進(jìn)行多因素生存分析。本次研究的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 20.0軟件包完成，所有統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)均是雙側(cè)的，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象基本特征 155例食管鱗癌患者，男95例（61.3%），女60例（38.7%），年齡38～82歲，平均（61.79±7.35）歲，中位年齡62歲。所有研究對(duì)象均行手術(shù)治療，且有明確的術(shù)后病理報(bào)告記錄。到生存隨訪截止時(shí)間為止，63例死亡，2例失訪，中位生存期為35.11個(gè)月。

2.2 MTHFR基因型與食管癌的關(guān)系 本研究將患者分為男性組和女性組，比較MTHFR三個(gè)基因型在兩組間的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MTHFR突變基因型（TT）和雜合基因型（CT）在男性組的比例略高于女性組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.299）。進(jìn)一步將TT和CT兩個(gè)基因型合并后分析，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.102）。155例患者中，年齡大于60歲者85例，60歲及以下者共70例，三個(gè)基因型在兩組間分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.361）。農(nóng)村患者占本研究的83.9%，但是城市食管癌患者和農(nóng)村食管癌患者在MTHFR基因型的分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.228）。155例患者中，55.5%的患者有吸煙史，飲酒者占46.5%，未發(fā)現(xiàn)吸煙、飲酒組的MTHFR基因型比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。還調(diào)查了患者食用水果的習(xí)慣，研究發(fā)現(xiàn)有食用水果習(xí)慣的患者占了大多數(shù)（66.5%），MTHFR三個(gè)基因型在兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。但是，將TT和CT兩個(gè)基因型合并后分析，發(fā)現(xiàn)含突變基因的基因型在無(wú)食用水果習(xí)慣組的比例更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[P=0.04，95%CI（1.052，4.071）]。根據(jù)食管癌患者術(shù)后病例報(bào)告，發(fā)現(xiàn)155例患者中，67例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性患者，88例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性者。根據(jù)有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，將食管癌分為兩組來(lái)比較MTHFR基因型的差異，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.657）。本研究數(shù)據(jù)顯示，食管癌病變長(zhǎng)度從1～9 cm不等，分為≤4 cm和>4 cm，研究發(fā)現(xiàn)MTHFR基因型在兩者間分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.322）。根據(jù)2009年UICC的TNM分期，155例患者中，0期4例，Ⅰ期27例，Ⅱ期30例，Ⅲ期94例，Ⅳ期0例。將其分為Ⅲ期以前61例，Ⅲ期94例，兩者M(jìn)THFR基因型分布上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.714）。見(jiàn)表1～2。endprint

2.3 生存分析結(jié)果 155例入組患者的中位生存時(shí)間為35.11個(gè)月，男性、女性總生存時(shí)間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.985），年齡≤60歲和>60歲總生存時(shí)間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.392），城市、農(nóng)村患者總生存時(shí)間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.200）。由表3可知，吸煙、飲酒患者的總生存時(shí)間分別短于不吸煙、不飲酒，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。有無(wú)水果習(xí)慣總生存時(shí)間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.559）。研究有無(wú)UGIC史生存期發(fā)現(xiàn)，有UGIC史患者總生存時(shí)間短于無(wú)UGIC史患者，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.395）。吞咽困難者與其他表現(xiàn)者生存狀況比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.196）。病變長(zhǎng)度≤4 cm和>4 cm總生存時(shí)間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.617）。本研究發(fā)現(xiàn)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移食管癌患者的中位生存時(shí)間為33個(gè)月，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者中位生存時(shí)間為35個(gè)月。無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的生存期明顯長(zhǎng)于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000），生存曲線見(jiàn)圖2。而TNM分期在Ⅲ期以前的食管癌患者總生存時(shí)間短于Ⅲ期食管癌患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002），生存曲線見(jiàn)圖3。最后研究MTHFR三個(gè)基因型TT、CT、CC總生存時(shí)間均為35個(gè)月，三組的總生存期比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.462）。進(jìn)一步采用Cox回歸模型校正年齡、性別、吸煙、飲酒、分化程度等因素進(jìn)行多因素生存分析，因?yàn)榱馨徒Y(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期存在相互影響，因此，將其分開(kāi)納入方程，結(jié)果發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期均是影響食管癌生存時(shí)間的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素（P<0.05）。

3 討論

目前認(rèn)為影響食管鱗癌患者預(yù)后的因素眾多，但還沒(méi)有一致的結(jié)論，主要包括TNM分期和患者一般狀況，如性別、年齡、家族史、體重指數(shù)、活動(dòng)狀態(tài)（PS）評(píng)分和病變長(zhǎng)度等。有研究發(fā)現(xiàn)高低發(fā)區(qū)、城市農(nóng)村、腫瘤家族史、腫瘤部位、大體類(lèi)型、分化程度對(duì)食管癌患者的預(yù)后影響，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但是性別、診斷年齡與食管癌患者的預(yù)后有關(guān)。女性食管癌患者的中位生存期要大于男性（P<0.05），≤50歲的食管癌患者中位生存期大于50歲以上的患者（P<0.05）[14]。魏棟[15]學(xué)者研宄結(jié)果顯示年齡是食管癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素，但是該研究發(fā)現(xiàn)青年組食管癌生存率低于老年組。有研究認(rèn)為食管原發(fā)灶長(zhǎng)度是食管癌預(yù)后重要指標(biāo)[16]。Griffiths等[17]的研究顯示長(zhǎng)度超過(guò)3.5cm的食管癌病變預(yù)后較差。Wang等[18]的研宄表明腫瘤長(zhǎng)度是預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)，腫瘤長(zhǎng)度>4cm的食管癌患者總生存期縮短 。有一部分學(xué)者認(rèn)為腫瘤的位置與食管癌的預(yù)后有關(guān)[19-21]。不過(guò)，也有研究持不同意見(jiàn)，一項(xiàng)大樣本研究結(jié)論認(rèn)為性別、腫瘤部位與食管癌的預(yù)后無(wú)關(guān)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、T分期與食管癌的預(yù)后有關(guān)[22]。一項(xiàng)針對(duì)中國(guó)的食管鱗癌研究認(rèn)為，臨床因素如性別、年齡、吸煙、飲酒與食管鱗癌的預(yù)后無(wú)關(guān)。進(jìn)一步研究認(rèn)為食管鱗癌的部位（上段、中段、下段）與食管癌的預(yù)后無(wú)關(guān)，但是食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否、有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期與食管癌的預(yù)后有關(guān)。臨床分期3～4期的死亡率38%，明顯高于1～2期的死亡率20%（P<0.001）[23]。這與本研究的結(jié)論一致。本研究認(rèn)為性別、年齡、吸煙、飲酒、水果習(xí)慣、UGIC史、首發(fā)癥狀、病變長(zhǎng)度與食管癌的預(yù)后無(wú)關(guān)，而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期與食管癌的預(yù)后有關(guān)?？梢?jiàn)，影響食管癌的因素很多，且不同的研究結(jié)果差異很大，這可能與樣本量的多少，食管癌的地域分布差異有關(guān)。而且，大多數(shù)臨床資料的收集都屬于回顧性收集，當(dāng)患者確診后可能存在生活習(xí)慣的改變，最終導(dǎo)致研究結(jié)果的差異。但是，絕大多數(shù)研究都認(rèn)為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否，TNM分期與食管預(yù)后有關(guān)。TNM分期是一個(gè)綜合分期，既考慮了原發(fā)灶的因素，也考慮到淋巴結(jié)侵犯和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的情況，TNM分期是判斷預(yù)后的最重要的因素，在臨床上有十分重要的意義。因此，臨床工作中，準(zhǔn)確的分期能夠?yàn)橹委煼桨傅膬?yōu)化、判斷預(yù)后提供標(biāo)準(zhǔn)。

目前有大量的研究討論MTHFR677位點(diǎn)的基因多態(tài)性與食管癌的易感性的關(guān)系。然而，MTHFR677位點(diǎn)的基因多態(tài)性與食管癌的預(yù)后的研究卻很少，且存在爭(zhēng)論[24-26]。 Sarbia 等[24]和Wu等[25]研究認(rèn)為MTHFR677C-T多態(tài)性與食管鱗癌的預(yù)后有關(guān)。也有研究針對(duì)以5-Fu為基礎(chǔ)化療的食管癌患者認(rèn)為，突變基因型TT存在生存獲益[27-28]。但是，一項(xiàng)在中國(guó)開(kāi)展的食管鱗癌研究認(rèn)為MTHFR677位點(diǎn)的基因多態(tài)性與食管癌的預(yù)后無(wú)關(guān)。本研究也未發(fā)現(xiàn)MTHFR677位點(diǎn)的基因多態(tài)性與食管癌的預(yù)后有關(guān)。有學(xué)者對(duì)印度北部人群的研究也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)MTHFR677C-T多態(tài)性與食管鱗癌的預(yù)后有關(guān)[29]。一項(xiàng)對(duì)英國(guó)人群的分析同樣認(rèn)為MTHFR基因型對(duì)食管癌的生存期沒(méi)有影響[30]。研究發(fā)現(xiàn)，MTHFR677C-T多態(tài)性在不同的人群中有很大程度的差異[31]。因此，不同種族，不同地區(qū)研究結(jié)果的不同，很大程度上是因?yàn)榛蚨鄳B(tài)性的人群分布差異。

因此，期待更多大樣本、多中心的前瞻性研究來(lái)進(jìn)一步探討影響食管癌的預(yù)后因素，同時(shí)開(kāi)展更多MTHFR677C-T多態(tài)性與食管癌預(yù)后的研究，為食管癌的個(gè)體化精準(zhǔn)治療提供參考。

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