李文采+劉飛+田寒友+鄒昊+王輝+張振琪+李家鵬+喬曉玲

摘 要：為探討白肌肉（pale，soft and exudative meat，PSE肉）形成時(shí)肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)和功能的變化，以PSE豬肉為研究對(duì)象，從氧化還原體系失衡和鈣激活蛋白酶活性變化兩方面進(jìn)行研究。結(jié)果表明：與正常肉（red，firm and non-exudative meat，RFN肉）相比，PSE肉的超氧化物歧化酶抑制率顯著降低（P<0.05），谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性顯著增加（P<0.01），鈣激活蛋白酶活性顯著增加（P<0.05）；隨著氧化還原體系失衡和鈣激活蛋白酶活性的增加，PSE肉十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜的肌間線蛋白、肌動(dòng)蛋白和Ⅰ-肌鈣蛋白條帶變淡、變細(xì)；肌原纖維蛋白的表面疏水性顯著增大（P<0.05），溶解性顯著降低（P<0.01），結(jié)構(gòu)和功能特性發(fā)生改變。

關(guān)鍵詞：抗氧化酶；鈣激活蛋白酶；肌原纖維蛋白氧化；PSE肉

Oxidative Denaturation of Myofibril Protein in Pale， Soft and Exudative （PSE） Pork

LI Wencai， LIU Fei， TIAN Hanyou， ZOU Hao， WANG Hui， ZHANG Zhenqi， LI Jiapeng， QIAO Xiaoling*

（Beijing Key Laboratory of Meat Processing Technology， China Meat Research Center， Beijing 100068， China）

Abstract： The objective of this study was to discuss the structural and functional changes of myofibril protein during the formation of pale， soft and exudative （PSE） pork. The focus was on the correlations of these changes with redox imbalance and changes in calpain activity. The results were showed that compared with red， firm and non-exudative （RFN） meat， the activity of superoxide dismutase （SOD） was significantly lower （P < 0.05）， while the activities of glutathione peroxidase （GSH-Px） （P < 0.01） and calpain （P < 0.05） were significantly higher in PSE pork. As redox imbalance occurred and ccalpain activity increased， desmin， actin and troponin Ⅰ bands became lighter in color and thinner in the sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis （SDS-PAGE） pattern， the surface hydrophobicity of myofibril protein was significantly increased （P < 0.05） and solubility was decreased significantly （P < 0.01）， implying the structural and functional changes of myofibril protein in PSE pork.

Key words： antioxidant enzymes； calpain； myofibril protein oxidation； pale， soft and exudative meat

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201710002

中圖分類號(hào)：TS251.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2017）10-0006-06

白肌肉（pale，soft and exudative meat，PSE肉）與正常肉（red，firm and non-exudative meat，RFN肉）相比，其蒸煮損失較高，感官品質(zhì)特性，如硬度、彈性、黏聚性、咀嚼性和回彈力較低。PSE肉呈灰白色，表面有汁液滲出，具有持水力偏低、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)隨水分的流失而降低等特征，嚴(yán)重影響肉的品質(zhì)，同時(shí)也降低了肉本身能給人類帶來(lái)的益處[1]。近年來(lái)隨著世界范圍內(nèi)豬肉消費(fèi)量的不斷增長(zhǎng)，肉品質(zhì)缺陷帶來(lái)的問(wèn)題也隨之嚴(yán)重化。Oneill等[2]發(fā)現(xiàn)用PSE豬肉加工制得的火腿與正常豬肉相比，其經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)50%以上。

PSE豬肉的形成受品種、飼養(yǎng)環(huán)境、屠宰前后處理方式、運(yùn)輸條件及胴體加工過(guò)程中的環(huán)境條件等一系列復(fù)雜內(nèi)外因素的影響[3-4]，目前還不能完全杜絕PSE豬肉的產(chǎn)生，其產(chǎn)生機(jī)理是目前的研究熱點(diǎn)。Bowker等[5]指出肌肉宰后pH值的快速下降和高溫加速了糖酵解過(guò)程，糖酵解是導(dǎo)致PSE肉形成的主要原因之一。陳茂[6]也認(rèn)為在低pH值和宰前高溫條件下，肌纖維膜變性，肌原纖維和肌漿蛋白凝固收縮，肌肉保水性下降，肌肉細(xì)胞內(nèi)的游離水滲出，使得肌肉色澤變淡、切面多汁等，從而導(dǎo)致PSE肉產(chǎn)生。Hammelman等[7]發(fā)現(xiàn)電擊致暈屠宰方法不當(dāng)時(shí)會(huì)加快肌肉宰后糖酵解的代謝速率，在一定程度上導(dǎo)致PSE肉的發(fā)生。Barbut等[8]從基因、生物化學(xué)及代謝方面指出宰前應(yīng)激和宰后早期胴體環(huán)境能夠引起蛋白質(zhì)變性，從而導(dǎo)致PSE豬肉的產(chǎn)生。鈣激活蛋白酶是一種鈣離子依賴性半胱氨酸蛋白水解酶，是調(diào)節(jié)細(xì)胞病理性死亡的半胱氨酸蛋白酶家族成員之一，它的表達(dá)與細(xì)胞凋亡也具有密切關(guān)系[9]。蛋白質(zhì)氧化是細(xì)胞凋亡的途徑之一，蛋白質(zhì)發(fā)生氧化損傷后將失去原有的生理功能。郭守立等[10]指出肌原纖維蛋白氧化變性是PSE豬肉形成的主要表現(xiàn)之一。目前針對(duì)機(jī)體內(nèi)氧化還原體系失衡和鈣激活蛋白酶活性增加導(dǎo)致PSE豬肉產(chǎn)生的機(jī)理研究鮮見(jiàn)報(bào)道，本研究從氧化還原體系失衡和鈣激活蛋白酶活性增加的角度探討PSE豬肉中肌原纖維蛋白的氧化變性，為降低PSE豬肉的發(fā)生率，提高宰后豬肉品質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬背最長(zhǎng)肌購(gòu)自北京中瑞食品有限公司，生豬品種為6 月齡的杜長(zhǎng)大三元雜交（杜洛克×長(zhǎng)白豬×大約克夏）去勢(shì)公豬，體質(zhì)量（100±10） kg，運(yùn)輸前以自由采食、飲水飼養(yǎng)為主，無(wú)明顯禁食、禁水時(shí)間，生豬運(yùn)輸時(shí)均有間隔，宰殺方式為三點(diǎn)式麻電擊暈。

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、

過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）測(cè)定試劑盒、乙二醇-雙-（2-氨基乙醚）四乙酸（ethylene glycol-bis-（2-aminoethyl）tetraacetic acid，EGTA）、溴酚藍(lán)、過(guò)硫酸銨、牛血清白蛋白、考馬斯亮藍(lán)G-250、甲叉雙丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷（tris（hydroxymethyl）aminomethane，Tris）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS） 美國(guó)Sigma公司；甘氨酸、甘油、考馬斯亮藍(lán)R-250、丙烯酰胺 美國(guó)Amersco公司；標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker 北京天根生化科技有限公司；其他試劑 國(guó)藥

集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SG8-ELK便攜式pH計(jì)、AL104電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DZKW-4電子恒溫水浴鍋 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；Synergy H4全功能酶標(biāo)儀 美國(guó)伯騰儀器有限公司；Sorvall LYNX4000高速落地離心機(jī) 美國(guó)Thermo公司；Bio-Rad凝膠成像儀

美國(guó)伯樂(lè)公司；DYCZ-24DN電泳儀 北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 PSE肉的制備及判定

宰后0.5 h從3 頭豬取背最長(zhǎng)肌3 份，將每份豬背最長(zhǎng)肌平均分為2 份，1 份為實(shí)驗(yàn)組，另1 份為對(duì)照組。PSE肉的制備參考Lesiów等[11]的方法。將實(shí)驗(yàn)組肌肉置于35 ℃水浴鍋中7 h，然后放置于4 ℃冰箱中17 h；對(duì)照組肌肉于4 ℃冰箱中放置24 h。在2 組實(shí)驗(yàn)開(kāi)始進(jìn)行0.5 h，即宰后1 h時(shí)，使用便攜式肉用pH計(jì)對(duì)背最長(zhǎng)肌的pH值進(jìn)行測(cè)定，每份肉樣測(cè)3 個(gè)位點(diǎn)，取平均值作為該時(shí)間點(diǎn)的pH值。

實(shí)驗(yàn)進(jìn)行24 h時(shí)，采用異質(zhì)肉判別裝置對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組肌肉進(jìn)行分級(jí)，參考劉文營(yíng)等[12]的方法，采用日本肉色分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)比色板進(jìn)行比對(duì)，滿足宰后1 h時(shí)pH值小于6且宰后24 h時(shí)肉色分值為1或2判定為PSE肉，宰后1 h時(shí)pH值小于6且宰后24 h時(shí)肉色分值為3或4判定為RFN肉。結(jié)合比色板比對(duì)分級(jí)和pH值判定PSE肉是否制作完成。

1.3.2 抗氧化酶活力測(cè)定

采用SOD試劑盒法和GSH-Px試劑盒法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 鈣離子濃度和鈣激活蛋白酶系活性測(cè)定

鈣離子濃度測(cè)定：參照GB/T 5009.92—2003《食品中鈣的測(cè)定》[13]中的滴定法。

鈣激活蛋白酶系粗酶液的提取及活性測(cè)定參照楊巧能等[14]的方法。一個(gè)單位的鈣激活蛋白酶系活性定義為25 ℃反應(yīng)60 min，在278 nm波長(zhǎng)處增加1.0吸光度單位催化反應(yīng)所需要的酶量。

1.3.4 肌原纖維蛋白的制備

參照Wu Mangang等[15]的方法。

1.3.5 肌原纖維蛋白的結(jié)構(gòu)特性測(cè)定

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）：參照李艷青[16]的方法，并稍作修改。本研究中的凝膠由12.5%分離膠和4.5%濃縮膠組成；電泳結(jié)束后，將電泳膠片置于凝膠成像儀中，結(jié)合軟件進(jìn)行分析和處理。

表面疏水性測(cè)定：參照李艷青[16]的方法。將提純的肌原纖維蛋白溶于磷酸鹽緩沖液（20 mmol/L，pH 6.0）中，使蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度為5 mg/mL；取上述肌原纖維蛋白溶液1 mL，加入200 μL溴酚藍(lán)溶液

（1 mg/mL），混勻，室溫條件下攪拌10 min后離心（7 000 r/min、15 min），取上清液，在595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A）。用磷酸鹽緩沖液（20 mmol/L，pH 6.0）代替肌原纖維蛋白溶液，作為空白樣。以溴酚藍(lán)為指示劑，通過(guò)測(cè)定溴酚藍(lán)與肌原纖維蛋白表面疏水性氨基酸的結(jié)合量來(lái)表征肌原纖維蛋白表面疏水性的大小。表面疏水性按照公式（1）計(jì)算。

式中：A1為空白樣上清液的吸光度；A2為樣品上清液的吸光度。

1.3.6 肌原纖維蛋白溶解性測(cè)定

參照Benjakul等[17]的方法，并稍作修改。稱取一定量的肌原纖維蛋白，置于50 mmol/L的NaH2PO4緩沖溶液（pH 6.0，包含0.6 mol/L NaCl）中，使其最終質(zhì)量濃度達(dá)5 mg/mL；吸取8 mL上述肌原纖維蛋白溶液，置于15 mL離心管中，5 000×g、4 ℃條件下離心15 min?？捡R斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，肌原纖維蛋白的溶解性用溶解度表示，按照公式（2）計(jì)算。

式中：ρ1為上清液中的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/（g/mL）；ρ2為樣品中的總蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/（g/mL）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和繪圖，采用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PSE肉判定

由表1可知，宰后1 h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組肌肉樣品的pH值均小于6。采用異質(zhì)肉判別裝置對(duì)肉進(jìn)行肉色分級(jí)，圖1為肉色判定圖片分析界面。由表2可知，實(shí)驗(yàn)組肌肉樣品宰后24 h時(shí)的級(jí)別為1或2 級(jí)，對(duì)照組為3或4 級(jí)，結(jié)合宰后1 h時(shí)的pH值和宰后24 h時(shí)的肉色分值得出實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組肌肉樣品分別為PSE肉和RFN肉。

2.2 肌原纖維蛋白的結(jié)構(gòu)特性

2.2.1 SDS-PAGE分析

由圖2可知，與RFN肉相比，PSE肉的肌間線蛋白、肌動(dòng)蛋白和Ⅰ-肌鈣蛋白條帶變淡、變細(xì)，而Ⅰ-肌球蛋白重鏈、7-肌球蛋白重鏈、C-蛋白、α-輔肌動(dòng)蛋白、ATPase-1、Ⅰ-肌集鈣蛋白、T-肌鈣蛋白、原肌球蛋白和

C-肌鈣蛋白條帶均無(wú)差異。張冬怡等[18]指出肌間線蛋白連接肌原纖維和Z盤(pán)以及細(xì)胞膜骨架，起到固定肌原纖維的作用，肌間線蛋白完整度越低，降解越多，汁液流失越多。Chen等[19]指出與RFN肉相比，肌間纖維蛋白有明顯降解時(shí)，PSE肉的持水性也較低。王志峰[20]發(fā)現(xiàn)在高壓作用下，牛骨骼肌G-肌動(dòng)蛋白的SDS-PAGE電泳條帶顏色變淡、變細(xì)，同時(shí)蛋白穩(wěn)定性降低，發(fā)生降解。本研究中，PSE豬肉肌原纖維蛋白的肌間線蛋白、肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白輕鏈條帶變淡、變細(xì)，表明肌原纖維蛋白發(fā)生變性，從而造成損失。

2.2.2 表面疏水性的變化

由圖3可知，PSE肉和RFN肉肌原纖維蛋白與溴酚藍(lán)的結(jié)合量分別為（116.06±0.64）、（111.82±0.69） μg，PSE肉顯著高于RFN肉（P<0.05）。

曹姬倩蕊[21]認(rèn)為與RFN豬肉相比，PSE豬肉肌原纖維蛋白的聚集程度低、具有較高的表面疏水性、結(jié)構(gòu)松散。呂彤等[22]也證實(shí)肌原纖維蛋白的疏水性隨著蛋白質(zhì)的氧化變性而增強(qiáng)，與本研究結(jié)果一致。

2.2.3 肌原纖維蛋白的功能特性

SDS-PAGE和表面疏水性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果已證實(shí)PSE肉形成過(guò)程中肌原纖維蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，而結(jié)構(gòu)的改變必然引起蛋白溶解度的變化[23-24]。由圖4可知，PSE肉形成過(guò)程中，其肌原纖維蛋白的溶解性顯著降低

（P<0.01），PSE肉和RFN肉肌原纖維蛋白的溶解度分別為（49.20±0.81）%和（80.65±1.18）%。蛋白溶解性是反映蛋白變性程度的重要指標(biāo)，PSE肉中肌原纖維蛋白溶解性的降低說(shuō)明其已經(jīng)發(fā)生了一定程度的變性。

Molette等[25]對(duì)宰后高溫（40 ℃）所致PSE肉的研究發(fā)現(xiàn)，類PSE肉的肌原纖維蛋白溶解度降低了46.4%；

Joo等[26]對(duì)PSE豬肉的研究也表明，RFN肉的蛋白溶解度可達(dá)169 mg/mL，而PSE肉僅為111 mg/mL。Sosnicki等[27]研究證實(shí)宰后初期豬肉的pH值較低，胴體溫度較高的條件下，粗絲與細(xì)絲間距減小，肌球蛋白發(fā)生不可逆變性，改變了其溶解性；在被氧化的過(guò)程中，肌原纖維蛋白的蛋白質(zhì)大分子斷裂成小片段，氧化后期纖維蛋白趨向于聚集和共價(jià)連接，溶解性降低。

2.3 引起肌原纖維蛋白變性的因素

2.3.1 體內(nèi)氧化還原體系失衡

當(dāng)生豬處于正常生理狀態(tài)時(shí)，體內(nèi)的氧化還原體系處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，能有效地清除活性氧（reactive oxygen species，ROS）；而當(dāng)生豬發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，體內(nèi)的生化構(gòu)成發(fā)生變化，再加上pH值的下降使得細(xì)胞組成發(fā)生改變，此時(shí)機(jī)體內(nèi)ROS清除體系失去平衡，ROS會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行一定程度的攻擊[28-31]。

由表3可知，與RFN肉相比，PSE肉的SOD抑制率顯著降低（P<0.05），抑制率越低，說(shuō)明PSE肉中SOD的活性越低；PSE肉的GSH-Px活性增加極顯著

（P<0.01），PSE肉和RFN肉中分別為（1.40±0.10）、（0.73±0.03） U/g，表明與正常生理?xiàng)l件下的RFN肉相比，PSE肉中的還原體系失去平衡。Chen Tao等[32]測(cè)定PSE豬肉中抗氧化酶的活性時(shí)發(fā)現(xiàn)，PSE肉中SOD和GSH-Px的活性均低于RFN肉；而Sárraga等[33]的研究結(jié)果表明，與RFN肉相比，PSE肉的GSH-Px活性較高；而肌肉的結(jié)構(gòu)組織越好，GSH-Px活性就越低。一般情況下，生豬發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生的抗氧化酶濃度和活性較高，以作為防御性體系，但是內(nèi)源性抗氧化酶在機(jī)體內(nèi)的作用是相互獨(dú)立的，且其酶活與肉的品種和類型有很大關(guān)系，抗氧化酶的濃度和活性也有可能會(huì)降低。有研究表明，在羥自由基模擬體系中，魚(yú)肉肌原纖維蛋白發(fā)生顯著氧化，其結(jié)構(gòu)和生化指標(biāo)均發(fā)生改變[34-36]。本研究中，與RFN肉相比，PSE肉的肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生明顯改變，這可能與PSE肉中還原體系失衡有密切關(guān)聯(lián)。

2.3.2 鈣激活蛋白酶活性變化

當(dāng)生豬處于正常生理狀態(tài)下時(shí)，肌肉中三磷酸腺苷充足，鈣離子在肌質(zhì)網(wǎng)和線粒體中以結(jié)合狀態(tài)存在，肌漿中無(wú)游離鈣離子存在[37]。當(dāng)生豬發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，肌纖維萎縮，肌質(zhì)網(wǎng)膜和線粒體膜功能失常，發(fā)生破裂，肌漿網(wǎng)中的鈣泵作用消失，Ca2+外泄。鈣離子濃度較低時(shí)，鈣激活蛋白的酶活性中心被封閉，酶無(wú)活性，隨著肌漿中Ca2+濃度不斷上升，酶的活性中心暴露，表現(xiàn)出活性[38]。

由圖5可知，PSE肉和RFN肉肌漿中Ca2+含量分別為（0.40±0.008）、（0.11±0.003） mg/100 g，其中PSE肉顯著高于RFN肉。Guo等[39]的研究表明，基于心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)Ca2+通道的蛋白表達(dá)水平，PSE肉與RFN肉相比具有較高的Ca2+濃度，這與本研究中PSE肉Ca2+濃度較高的結(jié)論一致。

由圖6可知，與RFN肉相比，PSE肉的鈣激活蛋白酶活性顯著增加（P<0.05），PSE肉和RFN肉肌漿中鈣激活蛋白酶系的活性分別為（0.10±0.002）和（0.04±0.002）。張冬怡等[40]發(fā)現(xiàn)PSE肉的鈣激活酶活性較RFN肉高；Pomponio等[41]發(fā)現(xiàn)在高溫條件下，豬通脊肉的μ-鈣激活酶和m-鈣激活酶的活性均被激活。機(jī)體正常機(jī)能遭到破壞，溫度和早期pH值的快速下降都會(huì)造成鈣激活蛋白酶系酶活性的下降[42]，但是隨著肌漿網(wǎng)破裂，Ca2+外泄，Ca2+濃度的升高又會(huì)大大激活鈣激活蛋白酶系的活性。從酶活性的作用機(jī)理可知，Ca2+激活是鈣激活蛋白酶系表現(xiàn)活力的途徑之一[43]。RFN肉中鈣激活蛋白酶活性較低的原因可能是肌漿中的Ca2+濃度太低，只能激活μ-鈣激活酶，而難以激活m-鈣激活酶[44]。張英君等[45]發(fā)現(xiàn)并證實(shí)鈣激活蛋白酶是降解肌原纖維骨架蛋白的主要因子。本研究中PSE豬肉的Ca2+濃度較大，鈣激活蛋白酶活性較高，理論上細(xì)胞發(fā)生凋亡，肌原纖維蛋白將發(fā)生氧化變性，這與本研究中測(cè)得的PSE豬肉的肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生明顯改變相符。

3 結(jié) 論

與RFN肉相比，PSE肉的SOD活性較低，GSH-Px活性較高，還原體系失衡；Ca2+外泄，大大激活了鈣激活蛋白酶的活性，鈣激活蛋白酶控制著肌原纖維蛋白的降解，PSE肉SDS-PAGE圖譜中肌間線蛋白、肌動(dòng)蛋白和Ⅰ-肌鈣蛋白條帶變淡、變細(xì)，肌原纖維蛋白表面疏水性增大，蛋白溶解性降低，PSE肉的肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)和功能特性發(fā)生改變。本研究從內(nèi)源性氧化還原體系失衡和鈣激活蛋白酶活性增加兩方面闡述了PSE肉中肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)和功能特性發(fā)生的變化，為PSE肉的形成機(jī)理研究提供一定的參考。

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