洪歡歡+趙鵬+寧錄勝+聞路紅+徐鐵峰

摘 要 本研究將單電極放電技術(shù)的DBDI與質(zhì)譜（MS）聯(lián)用，快速檢測(cè)了4種低極性的合成藥物，結(jié)果表明， 4種合成藥物主要生成[M+H]+分子離子。此外還利用DBDIMS對(duì)草烏、制草烏切片進(jìn)行快速分析，在草烏中檢測(cè)到烏頭堿、中烏頭堿、脫氧烏頭堿的[M+H]+離子，以及[M+H-60]+碎片離子； 在制草烏中只檢測(cè)到烏頭堿、中烏頭堿、脫氧烏頭堿的[M+H-60]+碎片離子。所測(cè)草烏中的標(biāo)志性藥效成分主要為雙酯類生物堿，制草烏中的標(biāo)志性藥效成分主要為單酯類生物堿。新型DBDI為藥物研究提供了一種新的、快速檢測(cè)方法，具有十分重要的理論和實(shí)際應(yīng)用意義，在藥物研究領(lǐng)域具有極大的應(yīng)用潛力。

1 引 言

敞開式質(zhì)譜離子源技術(shù)是一種新型的、敞開式的、直接對(duì)樣品或樣品表面進(jìn)行分析的質(zhì)譜分析技術(shù)，廣泛應(yīng)用于食品檢測(cè)、爆炸物分析、中草藥分析等多個(gè)領(lǐng)域[1～3]。經(jīng)過多年的發(fā)展，常壓敞開式離子化技術(shù)的種類已超過了40種，并建立了各具特色的質(zhì)譜分析方法。

介質(zhì)阻擋放電（Dielectric barrier discharge， DBD），又稱無聲放電，是一種新型敞開式離子化技術(shù)[4]。2007年，Na等[5，6]提出了基于介質(zhì)阻擋放電的離子源（Dielectric barrier discharge ionization， DBDI）。2008年，Harper等[7]在DBDI的基礎(chǔ)上，發(fā)展出低溫等離子體離子化方法（Lowtemperature plasma， LTP）。 2016年， 寧波大學(xué)聞路紅課題組提出一種穩(wěn)定、高效的DBDI單電極放電技術(shù)，并基于該技術(shù)成功研制出新型介質(zhì)阻擋放電離子源（DBDI）[8]，具有操作簡(jiǎn)單、快捷、無需復(fù)雜的樣品前處理、可以與各種質(zhì)譜儀器聯(lián)用等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)兼具傳統(tǒng)質(zhì)譜的高分析速度、高靈敏度等特點(diǎn)。

DBDI技術(shù)在食品安全[5]、爆炸物檢測(cè)[6]、環(huán)境污染物監(jiān)控[9，10]等諸多領(lǐng)域已展現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用前景。DBDI可以離子化極性范圍更大的化合物，對(duì)ESI難電離的物質(zhì)具有較高的靈敏度[11]，可用于合成藥物中極性范圍較大的主要藥效成分的檢測(cè)。 Liu等[12]將低溫等離子體（LTP）探針離子源和質(zhì)譜聯(lián)用，對(duì)激素，解熱止痛劑，心血管等11種商業(yè)藥物進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)藥物快速和高通量篩選； Hiraoka等[13]提出一種基于快速熱解析技術(shù)的DBDIMS方法，可有效實(shí)現(xiàn)氯雷他定、依替唑侖等多種難揮發(fā)和非揮發(fā)固態(tài)藥品檢測(cè)，檢測(cè)限可達(dá)ng級(jí)別； Zhang等[14]將毛細(xì)管電泳（CE）、表面等離子體共振（SPR）與DBDIMS在線組合，對(duì)含鹽溶液中的小分子藥物（醋氨酚、奎寧等）進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)DBDI對(duì)不揮發(fā)鹽表現(xiàn)出更高的耐受性，可應(yīng)用于一些特殊條件下的研究。DBDI技術(shù)也適用于中草藥研究，解決傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)存在用樣量大、樣品制備耗時(shí)等缺陷。如Smoluch等[15]基于熱輔助的DBDIMS分析技術(shù)對(duì)植物基質(zhì)中8種合成大麻素進(jìn)行分析，只需少量的樣品（約數(shù)百微克）即可實(shí)現(xiàn)“特制藥物”中大麻素類似物和衍生物的分析， 且無需樣品前處理和溶劑萃取。文獻(xiàn)[16，17]用LCMS方法檢測(cè)草烏與炮制品的主要藥效成分進(jìn)行區(qū)分辨別，但檢測(cè)方法需要耗時(shí)較長(zhǎng)的萃取和樣品制備過程。

本研究將基于單電極放電技術(shù)的新型DBDI與質(zhì)譜（MS）聯(lián)用，對(duì)4種低極性的合成藥物和草烏、制草烏中標(biāo)志性藥效成分進(jìn)行快速分析，進(jìn)一步探索新型DBDI在藥物研究領(lǐng)域中的應(yīng)用價(jià)值。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

DBDI機(jī)箱、DBDI離子源（中國(guó)寧波華儀寧創(chuàng)智能科技有限公司）； 500質(zhì)譜儀（美國(guó)Varian公司）； LTQ質(zhì)譜儀（美國(guó)賽默飛公司）； 微電極玻璃毛細(xì)管（中國(guó)武漢微探科學(xué)儀器有限公司，Glass capillaries， B10024F，外徑1 mm，內(nèi)徑0.59 mm，長(zhǎng)度100 mm）。

甲醇（質(zhì)譜級(jí)99.99%，上海安普實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）； 氦氣（99.99%，寧波百方氣體有限公司）。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 樣品制備 MCT3IM2、MCT2PBD、MCTIME、MCTIMA由北京某藥廠合成，分別用甲醇溶解，配制成50 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液； 烏頭堿（Aconitine， AC）、中烏頭堿（Mesaconitine， MA）標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma Aldrich公司）分別用甲醇溶解，配制成20 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液； 生草烏、制草烏購(gòu)自寧波市中草藥市場(chǎng)。

2.2.2 實(shí)驗(yàn)平臺(tái)搭建

基于DBDIMS的液體樣品實(shí)驗(yàn)平臺(tái)搭建如圖1所示，具體如下：毛細(xì)管虹吸方式進(jìn)樣，將DBDI水平放置向LTQ質(zhì)譜噴射，毛細(xì)管樣品端距LTQ質(zhì)譜進(jìn)樣口0.5 cm，DBDI和MS進(jìn)樣口的距離為2.0 cm，等離子束對(duì)準(zhǔn)LTQ質(zhì)譜進(jìn)樣口中心偏下約2～3 mm處。氦氣氣瓶出氣口處接減壓閥，氣瓶通過外徑φ4氣管與DBDI機(jī)箱進(jìn)氣口連接。DBDI單極放電工作的原理見文獻(xiàn)[8]。

中草藥實(shí)驗(yàn)平臺(tái)搭建參照?qǐng)D1，具體如下： DBDI100 45°反射式進(jìn)樣，將生草烏、制草烏切片放于DBDI的輔助配件固體樣品夾上，上表面緊貼500質(zhì)譜進(jìn)樣口下方，DBDI距500 質(zhì)譜儀進(jìn)樣口2.0 cm，氦氣氣瓶出氣口處接減壓閥，氣瓶通過外徑φ4氣管與DBDI機(jī)箱進(jìn)氣口連接。

LTQ質(zhì)譜條件設(shè)置：毛細(xì)管溫度為275℃； 離子透鏡補(bǔ)償電壓為35 V； 毛細(xì)管電壓為7 V，LTQ質(zhì)譜檢測(cè)m/z 50～800。

2.2.3 合成藥物檢測(cè) 將濃度為50 mg/L的MCT3IM2、MCT2PBD、MCTIME、MCTIMA的甲醇溶液，通過毛細(xì)管虹吸進(jìn)樣，氦氣流速為3.0 L/min，DBDI控制氦氣溫度分別為100℃、200℃和150℃，譜圖采集時(shí)間為0.5 min。endprint

2.2.4 中草藥檢測(cè) 將濃度為20 mg/L的烏頭堿、中烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過毛細(xì)管虹吸進(jìn)樣，氦氣流速為4.0 L/min，DBDI的加熱溫度為200℃，譜圖采集時(shí)間為0.5 min。

將生草烏、制草烏切片，用鑷子夾住，放置在固體進(jìn)樣平臺(tái)上，氦氣流速為4.0 L/min，DBDI的加熱溫度為200℃，譜圖采集時(shí)間為1 min。

3 結(jié)果與討論

3.1 合成藥物的DBDIMS研究

用DBDIMS對(duì)4種合成藥物進(jìn)行檢測(cè)分析，在DBDI控溫100℃時(shí)，MCT3IM2離子化結(jié)果主要生成[M+H]+（m/z 287）離子，其噪聲較明顯。在DBDI控溫200 ℃時(shí)， MCT2PBD離子化結(jié)果主要生成[M+H]+（m/z 270）離子，其響應(yīng)信號(hào)和信噪比的效果好； MCTIME主要生成[M+H]+（m/z 547）離子，在結(jié)構(gòu)S氨基砜結(jié)構(gòu)位置發(fā)生了斷裂，生成[M+H-124]+（m/z 423）碎片離子。MCTIMA除生成[M+H]+（m/z 465）離子外，由于沒有S氨基砜結(jié)構(gòu)保護(hù)，不同位置的CO鍵在高能下容易發(fā)生斷裂，出現(xiàn)了2種斷裂形式（圖2D），在1位點(diǎn)斷裂生成特征碎片離子[M+H-173]+ （m/z 292），在2位點(diǎn)斷裂生成特征碎片離子[M+H-264]+（m/z 201）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， DBDI對(duì)4種低極性合成藥物具有較好的電離效果（見圖2）。

3.2 草烏生物堿的DBDIMS研究

草烏的主要標(biāo)志性有效成分為雙酯類生物堿，包括烏頭堿、中烏頭堿與次烏頭堿（Hypaconitine， HA）等。

烏頭堿、中烏頭堿、脫氧烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜結(jié)果如圖3所示。在正離子模式下檢測(cè)到烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)品[M+H]+（m/z 646）離子，還檢測(cè)到[M+H-60]+（m/z 586）碎片離子（圖3A1）。隨著離子化時(shí)間的延長(zhǎng)， [M+H]+（m/z 646）離子的相對(duì)豐度逐漸降低，[M+H-60]+（m/z 586）碎片離子的相對(duì)豐度逐漸增加，最后只檢測(cè)到[M+H-60]+（m/z 586）離子（圖3A2）； 中烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)品主要生成[M+H]+（m/z 632）離子，同時(shí)還生成[M+H-60]+（m/z 572）碎片離子（圖3B1）； [M+H]+（m/z 632）離子的相對(duì)豐度逐漸降低，[M+H-60]+（m/z 572）碎片離子的相對(duì)豐度逐漸增加，最后只檢測(cè)到[M+H-60]+（m/z 572）離子（圖3B2）； 脫氧烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)品除生成的[M+H]+（m/z 630）離子外，還生成[M+H-60]+（m/z 570）碎片離子（圖3C1）； 與烏頭堿、中烏頭堿相似，脫氧烏頭堿[M+H]+（m/z 630）離子的相對(duì)豐度逐漸降低，[M+H-60]+（m/z 570）的相對(duì)豐度逐漸升高，最后只檢測(cè)到[M+H-60]+（m/z 570）碎片離子（圖3C2）。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在DBDI離子化作用下，烏頭堿、中烏頭堿、脫氧烏頭堿除生成[M+H]+離子外，都失去一分子的乙酸， 生成[M+H-60]+碎片離子，此結(jié)果也符合文獻(xiàn)[18]對(duì)烏頭類生物堿第一活性基團(tuán)是C8位乙酰氧基的描述。隨著離子化時(shí)間延長(zhǎng)，[M+H]+離子的相對(duì)豐度逐漸降低，[M+H-60]+離子的相對(duì)豐度逐漸升高。在軟電離條件下會(huì)發(fā)生特征斷裂，生成單酯生物堿[M+H-60]+特征碎片[19，20]，與本研究結(jié)果一致。

3.3 草烏與制草烏的DBDIMS研究

草烏中含有雙酯類和單酯類生物堿，而炮制過的烏頭塊根中含有單酯類生物堿[16，17]。 雙酯類生物堿在炮制過程中會(huì)發(fā)生酯鍵水解反應(yīng)，先失去骨架上的C8位乙?；蓡熙ヮ惿飰A，再繼續(xù)水解失去苯甲?；蔀躅^原堿[21]。本實(shí)驗(yàn)用DBDIMS方法比較草烏與制草烏中標(biāo)志性烏頭類生物堿的譜圖差異（圖4）。根據(jù)荷質(zhì)比可分為m/z 500～600與m/z 610～650 兩個(gè)區(qū)域，分別對(duì)應(yīng)單酯類生物堿和雙酯類生物堿。在草烏中檢測(cè)到相對(duì)豐度較低的次烏頭堿[M+H]+（m/z 616）離子、中烏頭堿[M+H]+（m/z 632）離子與烏頭堿[M+H]+（m/z 646）離子。還檢測(cè)到烏頭堿[M+H-60]+（m/z 586）碎片離子、中烏頭堿[M+H-60]+（m/z 572）碎片離子、脫氧烏頭堿[M+H-60]+（m/z 570）碎片離子以及次烏頭堿[M+H-60]+（m/z 556）碎片離子，其中烏頭堿[M+H-60]+碎片離子的相對(duì)豐度最高（圖4A）。在制草烏中只檢測(cè)到相對(duì)豐度較高的次烏頭堿[M+H-60]+（m/z 556）碎片離子、中烏頭堿[M+H-60]+（m/z 572）碎片離子、烏頭堿[M+H-60]+（m/z 586）碎片離子，未檢測(cè)到次烏頭堿、中烏頭堿和烏頭堿的[M+H]+離子及脫氧烏頭堿的[M+H-60]+碎片離子（圖4B）。

本研究將DBDIMS聯(lián)用，檢測(cè)從當(dāng)?shù)刂兴幨袌?chǎng)購(gòu)買的草烏、制草烏，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 草烏中的化學(xué)成分主要為雙酯類生物堿和單酯類生物堿，制草烏中的化學(xué)成分主要為單酯類生物堿。依據(jù)文獻(xiàn)[21]對(duì)草烏炮制程度的描述，表明本次檢測(cè)中購(gòu)買的制草烏炮制程度處于第一階段。雙酯類生物堿失去骨架上的C8位乙?；蓡熙ヮ惿飰A。 本方法可以在無需樣品前處理的條件下對(duì)草烏、制草烏的標(biāo)志性化合物進(jìn)行快速鑒定，能夠快速、靈敏地區(qū)分其炮制程度的不同，對(duì)草烏、制草烏的品質(zhì)鑒別及正確使用具有重要的意義。

4 結(jié) 論

本研究將新型DBDI與MS聯(lián)用，對(duì)4種低極性的合成藥物進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 4種合成藥物主要生成[M+H]+分子離子峰，同時(shí)MCTIMA發(fā)生結(jié)構(gòu)斷裂，產(chǎn)生特有的碎片離子，有利于該物質(zhì)的鑒定與結(jié)構(gòu)分析，表明新型DBDI對(duì)4種藥物具有較好的電離效果。同時(shí)， 對(duì)草烏、制草烏切片進(jìn)行快速分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， DBDIMS方法在無樣品前處理的條件下成功檢測(cè)到草烏、制草烏的烏頭堿、次烏頭堿、中烏頭堿等標(biāo)志性藥效成分，其中草烏中含有雙酯類和單酯類生物堿，制草烏中主要為單酯類生物堿，表明DBDIMS方法能夠快速、靈敏地鑒定草烏和制草烏的真?zhèn)?、質(zhì)量和炮制程度。本研究結(jié)果表明， 新型DBDI技術(shù)為藥物研究提供了一種新的、快速檢測(cè)方法，具有十分重要的理論和實(shí)際應(yīng)用意義，在藥物研究領(lǐng)域具有極大的應(yīng)用潛力。endprint