基于末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶擴(kuò)增DNA銅納米簇?zé)晒鈧鞲袡z測(cè)L組氨酸

肖慧+何婧琳+肖昊+楊嬋+馮澤猛+印遇龍+曹忠

摘 要 利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）擴(kuò)增形成聚胸腺嘧啶（T）DNA模板，制備了聚T銅納米簇（TSCuNCs），構(gòu)建了一種用于L組氨酸（LHis）檢測(cè)的熒光傳感分析新方法。TdT酶在dTTP存在下合成聚T單鏈DNA核苷酸序列。由于胸腺嘧啶和Cu2+之間的親合力，聚T單鏈DNA作為合成銅納米簇（CuNCs）的模板，加入還原劑后形成CuNCs，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。在LHis存在下，L組氨酸的咪唑基與Cu2+螯合形成LHisCu2+配合物，因而進(jìn)入聚胸腺嘧啶序列中的Cu2+量減少，使得合成的CuNCs數(shù)量減少，導(dǎo)致熒光信號(hào)減弱。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，體系熒光響應(yīng)信號(hào)與LHis濃度的對(duì)數(shù)值在5.0×10mol/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，檢出限達(dá)到3.4×10 mol/L。本方法用于實(shí)際尿液樣品中L組氨酸檢測(cè)的回收率為97.4%～104.6%，在生物醫(yī)學(xué)及臨床診斷中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

1 引 言

L組氨酸（LHis）作為神經(jīng)調(diào)節(jié)劑或神經(jīng)遞質(zhì)控制金屬元素的運(yùn)輸，其持續(xù)性缺乏常伴隨著弗里德里希共濟(jì)失調(diào)、癲癇、帕金森病和紅細(xì)胞生成發(fā)育不正常[1]。LHis過(guò)量也會(huì)導(dǎo)致AIDS、慢性腎臟疾病[6]、阿爾茨海默病和癌癥等[2]。因此，構(gòu)建靈敏、高效檢測(cè)LHis的方法對(duì)臨床醫(yī)學(xué)有重要意義。

目前，檢測(cè)LHis的方法主要有比色法[3]、分光光度法[4]、液相色譜法[5]、毛細(xì)管電泳法[6]、質(zhì)譜法[7]、拉曼光譜法[8]等，這些方法大多存在干擾因素多、操作復(fù)雜、分析成本高等不足。近年來(lái)，LHis熒光傳感器由于高效、靈敏等優(yōu)點(diǎn)引起廣泛關(guān)注[3]，主要的測(cè)定原理： 一是核酶切割法，如Kong等[9]采用酶催化循環(huán)切割擴(kuò)增單分子DNA實(shí)現(xiàn)對(duì)LHis的檢測(cè)，樣品用量少； He等[10]構(gòu)建酶級(jí)聯(lián)指數(shù)擴(kuò)增傳感平臺(tái)檢測(cè)LHis，選擇性好； 二是量子點(diǎn)恢復(fù)法，Hou等[11]基于碳量子點(diǎn)Hg（II）體系熒光恢復(fù)策略，LHis檢出限為0.15 μmol/L； 三是金屬納米簇法，Gong等[12]提出銀納米簇（AgNCs）免標(biāo)記催化和分子信標(biāo)擴(kuò)增傳感策略，LHis檢出限為17 μmol/L，但所合成AgNCs成本較高，操作條件較苛刻。

2.2 L組氨酸與Cu2+的作用

用0.01 mol/L MOPS緩沖液（含0.05 mol/L NaCl，pH=7.8）配制5.0×10 mol/L LHis儲(chǔ)備液，逐級(jí)稀釋至5.0×10

2.3 TdT酶擴(kuò)增聚T單鏈DNA （TS）模板的制備

用0.01 mol/L MOPS配制1.0×10mol/L引物鏈P1儲(chǔ)備液，于4℃保存。在10 μL 1×TdT酶緩沖液中，依次加入5 μL 2 μmol/L P1，0.2 μL 100 mmol/L dTTP和4 U TdT酶， 37℃孵育2 h，然后加熱至75℃保持10 min，冷卻至室溫，形成混合溶液B。

2.4 TSCuNCs的制備與熒光檢測(cè)

取上述溶液B，加入3.0×10mol/L抗壞血酸鈉，充分反應(yīng)5 min后，置于F7000光譜儀中檢測(cè)熒光。激發(fā)波長(zhǎng)為340 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為600 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為10.0 nm。

2.5 L組氨酸的檢測(cè)

將上述CuSO4與一系列不同濃度LHis結(jié)合的溶液A與溶液B混合，加入2.0×103 mol/L抗壞血酸鈉，充分反應(yīng)5 min后檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

3 結(jié)果與討論

3.1 檢測(cè)原理

如圖1所示，LHis的咪唑基與Cu2+反應(yīng)，形成2∶1穩(wěn)定螯合物。TdT酶在dTTP存在下擴(kuò)增引物鏈P1形成聚T單鏈DNA核苷酸序列（TS），加入Cu2+時(shí)，由于T堿基和Cu2+之間存在親合力，以聚T序列作為合成CuNCs的模板，加入抗壞血酸鈉還原Cu2+，形成大量CuNCs，產(chǎn)生強(qiáng)熒光信號(hào)。加入LHis形成LHisCu2+配合物時(shí)，進(jìn)入聚T單鏈DNA結(jié)構(gòu)中的Cu2+量少，合成的CuNCs含量少，熒光信號(hào)弱。

3.2 TdT酶擴(kuò)增DNA模板CuNCs各組分熒光光譜

為考察上述競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，測(cè)定了體系P1、Cu2+/LHis混合物、P1/Cu2+/LHis混合物、TS、TS/Cu2+混合物、TSCuNCs存在和不存在LHis的熒光光譜圖。如圖2所示，前5種體系均無(wú)熒光報(bào)告基團(tuán)，不產(chǎn)生熒光信號(hào)（曲線a， b， c， d， e）； 曲線f有強(qiáng)熒光信號(hào)，因?yàn)樵诳瞻讓?shí)驗(yàn)中，Cu2+無(wú)消耗，形成大量CuNCs，得到強(qiáng)熒光信號(hào)。當(dāng)有LHis存在時(shí)，熒光信號(hào)顯著降低（曲線g），這是因?yàn)镃u2+先與LHis螯合，剩余的Cu2+再與聚T序列作用，還原成CuNCs的量少，所以熒光信號(hào)弱。因此， 基于競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)原理檢測(cè)LHis是可行的。

3.3 條件優(yōu)化

3.3.1 酶反應(yīng)引物序列的選擇 由于引物鏈（P1、P2、P3）序列不同，其二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)影響后續(xù)熒光信號(hào)輸出，為得到最佳引物序列，將P1、P2、P3作為T(mén)dT酶底物鏈合成CuNCs，并考察LHis對(duì)其熒光的影響程度，如圖3A所示。不存在LHis時(shí)，其熒光強(qiáng)度因DNA序列的不同而不同，P1最高， P3最低。其中，P1的3′GGACATA是多種堿基序列，加入TdT酶之后，在P1 3′端聚合形成聚T長(zhǎng)鏈，由于T堿基與Cu2+的親和作用合成CuNCs而發(fā)射較強(qiáng)熒光； 而P2的3′AAAAAAA是單一A堿基序列，能夠與TdT酶聚合產(chǎn)物中的聚T結(jié)構(gòu)互補(bǔ)配對(duì)，形成部分雙鏈結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致CuNCs合成減少，熒光強(qiáng)度下降； P3為P1+P2序列長(zhǎng)鏈，其5′TTTTTTT和3′AAAAAAA可以互相雜交而形成分子內(nèi)部分雙鏈結(jié)構(gòu)，二級(jí)結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，在溶液中很難以單鏈狀態(tài)存在，導(dǎo)致TdT酶聚合效率不高，CuNCs合成很少，熒光信號(hào)很弱。加入LHis之后，熒光信號(hào)均顯著降低，這是因?yàn)長(zhǎng)His與Cu2+發(fā)生配位反應(yīng)，難以合成CuNCs。因此，選擇信背比最佳的P1作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的引物鏈。endprint

同時(shí)，選擇化學(xué)合成的T5（5′（T）53′）、T10（5′（T）103′）、T20（5′（T）203′）、T30（5′（T）303′）和T40（5′（T）403′），考察T5、T10、T20、T30和T40直接合成CuNCs（圖3B虛線）和以它們作為引物經(jīng)過(guò)TdT酶擴(kuò)增后合成CuNCs（圖3B實(shí)線）得到的熒光發(fā)射光譜圖。結(jié)果表明， 采用TdT酶擴(kuò)增DNA引物產(chǎn)生含有polyT的DNA比直接使用化學(xué)合成polyT引物DNA合成銅簇的熒光更強(qiáng)，效果更好。

3.3.2 酶孵育時(shí)間優(yōu)化 由于TdT酶催化DNA擴(kuò)增是一個(gè)逐步增加T堿基的過(guò)程，延伸產(chǎn)物鏈長(zhǎng)依賴于擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間?？疾炝嗣阜跤龝r(shí)間對(duì)延伸長(zhǎng)度的影響。引物鏈P1加入TdT酶孵育0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 h，在2.0 h前，P1在TdT酶作用下迅速聚合，熒光強(qiáng)度逐步增加； 2.0 h后，熒光信號(hào)趨于穩(wěn)定，TdT酶效率顯著下降。因此，選擇最佳酶孵育時(shí)間為2.0 h。

3.3.3 Cu2+濃度優(yōu)化 為了高效檢測(cè)LHis，找到最佳信號(hào)輸出時(shí)的Cu2+濃度，考察了Cu2+濃度對(duì)傳感體系熒光信號(hào)的影響。無(wú)LHis存在時(shí)，Cu2+濃度在1.5×10mol/L范圍內(nèi)， 體系熒光強(qiáng)度呈上升趨勢(shì)，之后趨于穩(wěn)定。加入LHis （5.0×10

3.3.4 抗壞血酸鈉濃度優(yōu)化 考察了系列抗壞血酸鈉濃度對(duì)傳感體系熒光響應(yīng)信號(hào)的影響。結(jié)果表明，無(wú)論LHis是否存在，抗壞血酸鈉濃度在5.0×10mol/L范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度均隨抗壞血酸鈉濃度的增加而迅速上升，這是因?yàn)殡S著抗壞血酸鈉濃度增加，被還原的Cu0增加，合成的CuNCs增加，導(dǎo)致熒光增強(qiáng)； 抗壞血酸鈉濃度達(dá)到1.0×10 mol/L后，反應(yīng)達(dá)到平衡，熒光信號(hào)趨于穩(wěn)定。因此，抗壞血酸鈉的最佳濃度為1.0×10

3.4 分析性能測(cè)試

考察了TdT酶擴(kuò)增TSCuNCs傳感體系在系列LHis濃度下的熒光發(fā)射光譜。如圖4A所示，傳感體系的熒光強(qiáng)度隨LHis濃度的上升而依次遞減，在5.0×10mol/L； （B） Calibration curve of fluorescence intensity of the proposed sensors vs. the logarithm value of LHis concentration

3.5 方法的選擇性

為了考察此傳感體系對(duì)LHis的特異性識(shí)別性能，對(duì)生物體中普遍存在的多種氨基酸進(jìn)行測(cè)試，如： L絲氨酸、L酪氨酸、L脯氨酸、L天門(mén)冬氨酸、L亮氨酸、L異亮氨酸、L賴氨酸。LHis的濃度為4.0×100.07之間?？梢?jiàn)，當(dāng)其它氨基酸的濃度為L(zhǎng)His濃度的5倍時(shí)，不會(huì)影響該傳感體系性能。這表明其它氨基酸存在時(shí)，對(duì)體系熒光強(qiáng)度的干擾很小，即傳感體系對(duì)LHis有特異性識(shí)別能力。

3.6 回收率

為了驗(yàn)證TdT酶擴(kuò)增TSCuNCs傳感體系檢測(cè)LHis的實(shí)用性，對(duì)未經(jīng)處理的成人晨尿樣進(jìn)行分析研究。在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，用0.01 mol/L MOPS緩沖液（含0.05 mol/L NaCl，pH=7.8）將尿樣稀釋200倍，采用加標(biāo)回收法測(cè)定樣品，回收率為97.4%～104.6%（見(jiàn)表2）。另取2個(gè)尿樣進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)呈陽(yáng)性，測(cè)得LHis濃度分別為1.13 和2.29 μmol/L， 表明此傳感方法對(duì)實(shí)際樣品中L組氨酸的檢測(cè)具有實(shí)用性。

與貴金屬納米簇相比，以雙鏈DNA為模板合成銅納米簇（CuNCs）的熒光方法已用于LHis的檢測(cè)[13]，聚T單鏈DNA也可作為合成CuNCs的模板[14]，用于檢測(cè)堿性磷酸酶[15]、三聚氰胺[16]和Cu2+等[17]。然而，以上DNA模板均由化學(xué)合成而來(lái)。Peng等[18]利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）生物合成聚T單鏈DNA，以此為模板合成CuNCs，用于檢測(cè)相關(guān)酶活性，與化學(xué)合成CuNCs的方法相比，該方法具有更高的熒光響應(yīng)信號(hào)。文獻(xiàn)[19，20]構(gòu)建了一系列基于TdT酶擴(kuò)增的熒光方法檢測(cè)不同目標(biāo)物，但以聚T單鏈DNA為模板合成CuNCs用于LHis的檢測(cè)鮮有報(bào)道。因此，本研究基于DNA中胸腺嘧啶和LHis對(duì)Cu2+的競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，構(gòu)建一種基于TdT酶擴(kuò)增聚T單鏈DNA銅納米簇?zé)晒夥椒?，?shí)現(xiàn)了對(duì)LHis無(wú)標(biāo)記高靈敏檢測(cè)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

F7000熒光分光光度計(jì)（日本日立公司）； PHSJ3F電位計(jì)（上海雷磁儀器廠）； BXM30R立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）； 恒溫金屬?。ê贾莶┤湛萍加邢薰荆?； KQ3200B超聲波清洗器（昆山超聲儀器公司）。

DNA和dTTP（上海生工生物工程股份有限公司）； P1 5′端聚T，P2 3′端聚A，P3含有P1和P2序列（見(jiàn)表1）； TdT酶 （20 U/μL）、5×TdT酶緩沖液（美國(guó)Fermentas公司）； 3（N嗎啉基）丙磺酸（MOPS）、L組氨酸、抗壞血酸鈉 （美國(guó)SigmaAldrich公司）； CuSO4、NaOH、NaCl（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）； L絲氨酸、L酪氨酸、L脯氨酸、L天門(mén)冬氨酸、L亮氨酸、L異亮氨酸、L賴氨酸（阿拉丁試劑有限公司）。所用試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水均為超純水（電阻率≥18.25 MΩ·cm）。endprint