閆李俠，黃至澄，任應(yīng)鵬，李恪梅，陳保文，王國(guó)治

噬菌體治療泛耐藥鮑氏不動(dòng)桿菌重癥感染小鼠的研究

閆李俠1，黃至澄1，任應(yīng)鵬1，李恪梅2，陳保文2，王國(guó)治2

目的探討噬菌體治療泛耐藥鮑氏不動(dòng)桿菌重癥感染小鼠的療效。方法以SPF級(jí)昆明小鼠建立小鼠感染泛耐藥鮑氏不動(dòng)桿菌的模型，分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組使用噬菌體AB46治療，對(duì)照組給同等體積的肉湯治療，統(tǒng)計(jì)比較兩組小鼠的生存率，進(jìn)行脾菌數(shù)分析。結(jié)果泛耐藥鮑氏不動(dòng)桿菌1∶10稀釋實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組P=0.020<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；1∶2、1∶5稀釋組分別為P=0.650，P=0.170，均>0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；1∶50稀釋的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均無(wú)小鼠死亡，脾菌數(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果P=0.026，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論噬菌體治療泛耐藥鮑氏不動(dòng)桿菌重癥感染小鼠是一種有效的治療方法，可明顯提高小鼠的生存率，在感染較輕的情況下可以明顯降低小鼠的脾菌數(shù)。

噬菌體；治療；鮑曼不動(dòng)桿菌；感染

鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii)是一種條件致病菌[1]，所致的感染常見(jiàn)于重癥感染的患者[2-4]，但是近年來(lái)鮑曼不動(dòng)桿菌已經(jīng)導(dǎo)致各種情況的耐藥，并出現(xiàn)了全耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌[5-7]，一旦感染其后果相當(dāng)嚴(yán)重，而當(dāng)前的治療方法僅能采用多粘菌素進(jìn)行治療[8]，但是多粘菌素的腎毒性很大，治療效果不理想，目前已經(jīng)在多個(gè)國(guó)家禁止使用[9-10]。本文以昆明小鼠建立全耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的重癥感染模型，從醫(yī)院污水中獲得的噬菌體治療之。

1 材料與方法

1.1主要試劑及實(shí)驗(yàn)器材 普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(由中國(guó)藥品生物制品檢定所培養(yǎng)基室提供)。1 mL、5 mL、10 mL一次性使用無(wú)菌注射器，上海米沙瓦醫(yī)科工業(yè)有限公司；微型離心機(jī)，德國(guó)eppendorf公司；0.2 μm一次性使用無(wú)菌過(guò)濾器，美國(guó)Pall公司；微量移液器，德國(guó)BRAND公司；微量移液器槍頭，美國(guó)AXYGEN公司。

1.2實(shí)驗(yàn)材料 選用健康的6～8周齡(體重20 g左右)SPF級(jí)昆明小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，所有小鼠由中國(guó)藥品生物制品鑒定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。泛耐藥鮑氏不動(dòng)桿菌A46由中國(guó)藥品生物制品鑒定研究院抗生素室提供，鮑氏不動(dòng)桿菌裂性噬菌體AB46為本實(shí)驗(yàn)室自行分離獲得。

1.3重癥感染模型建立 將泛耐藥鮑氏不動(dòng)桿菌A46加入少量于大管肉湯培養(yǎng)基中，36 ℃培箱培養(yǎng)18 h，再將此菌液鋪于大管斜面營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，36 ℃培養(yǎng)16 h，用無(wú)菌生理鹽水將其洗下，稀釋至不同倍數(shù)，用比濁法確定濃度，并同時(shí)用菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定其活菌數(shù)。將不同稀釋倍數(shù)的泛耐藥鮑氏不動(dòng)桿菌A46各取0.5 mL注射于5組SPF級(jí)昆明小鼠的腹腔內(nèi)(每組10只，雌雄各半)，觀察7 d，選擇導(dǎo)致一組小鼠全部死亡的最小劑量[6]作為絕對(duì)致死量(LD100)。用此劑量(每只小鼠0.5 mL菌A46)建立重癥感染模型，發(fā)現(xiàn)重癥感染泛耐藥鮑氏不動(dòng)桿菌的小鼠往往在24 h內(nèi)全部死亡。為了同時(shí)了解感染程度較輕的情況下噬菌體的治療效果，同時(shí)采用了不同稀釋倍數(shù)的劑量作為另外幾組小鼠的感染劑量。

1.4噬菌體的治療效果分析 設(shè)定5個(gè)大組，每大組20只，做為不同濃度泛耐藥鮑氏不動(dòng)桿菌感染小鼠的劑量組，每大組隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組10只。各大組分別采用不同濃度泛耐藥鮑氏不動(dòng)桿菌感染小鼠，泛耐藥鮑氏不動(dòng)桿菌A46以5×1010cfu/mL為最高濃度，按1∶2、1∶5、1∶10、1∶50稀釋為5個(gè)梯度，所有小鼠腹腔注射劑量均是0.5 mL。實(shí)驗(yàn)組每只小鼠腹腔注射泛耐藥鮑氏不動(dòng)桿菌A46之后，使用效價(jià)為5×108的噬菌體AB46 0.5 mL腹腔注射治療，對(duì)照組小鼠則不注射噬菌體，而注射等量營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液，觀察小鼠生存情況并記錄。于7 d后將未出現(xiàn)小鼠死亡大組的小鼠全部處死，然后取小鼠脾臟研磨，將實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組小鼠脾臟皆用10 mL無(wú)菌生理鹽水研磨溶解后取100 μL，再按1∶10稀釋后從中取100 μL鋪于瓊脂平皿中行菌落計(jì)數(shù)，由于所有小鼠均采用此方法稀釋，最后統(tǒng)計(jì)學(xué)處理時(shí)直接處理平皿中的菌落數(shù)量。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 小鼠的生存率數(shù)據(jù)采用Fisher確切概率法，小鼠脾菌數(shù)資料采用配對(duì)t檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件使用SPSS13.0。

2 結(jié) 果

2.1絕對(duì)致死量 經(jīng)過(guò)反復(fù)多次實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)梯度稀釋的菌液每只0.5 mL注射小鼠后，1010cfu/mL及更高濃度的菌液可導(dǎo)致一組小鼠24 h內(nèi)全部死亡，死亡時(shí)間大多數(shù)在12 h之內(nèi)，因此確定泛耐藥鮑氏不動(dòng)桿菌A46 1010cfu/mL，0.5 mL為小鼠致死劑量，此劑量感染的小鼠模型為重癥感染模型。

2.2小鼠生存分析 泛耐藥鮑氏不動(dòng)桿菌A46以5×1010cfu/mL為最高濃度，依次按1∶2、1∶5、1∶10、1∶50稀釋，噬菌體治療一次后觀察療效7d，發(fā)現(xiàn)并非所有小鼠可免于死亡。其中1∶2稀釋組的實(shí)驗(yàn)組10只，生存5只死亡5只；對(duì)照組10只，生存3只死亡7只，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.650>0.05)。1∶5稀釋組的實(shí)驗(yàn)組10只，生存6只死亡4只；對(duì)照組10只生存2只死亡8只，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.170>0.05)，說(shuō)明這兩組小鼠感染較重，噬菌體治療無(wú)明顯效果。但1∶10稀釋組的實(shí)驗(yàn)組10只生存9只死亡1只，對(duì)照組10只生存3只死亡7只，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析P=0.020<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組有區(qū)別，噬菌體治療效果顯著。1∶50稀釋組，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組各10只，均無(wú)小鼠死亡，說(shuō)明噬菌體感染較輕時(shí)，小鼠生存率不受影響。

2.3小鼠脾菌數(shù) 1∶100稀釋組脾臟落計(jì)數(shù)僅有1只實(shí)驗(yàn)組小鼠菌落計(jì)數(shù)為1，其余小鼠菌落計(jì)數(shù)為0，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由于1∶2、1∶5、1∶10稀釋組均有小鼠死亡，不進(jìn)行脾菌數(shù)計(jì)數(shù)。1∶50稀釋組無(wú)小鼠死亡，進(jìn)行脾菌落計(jì)數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表1，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析P=0.026<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，接受噬菌體治療組的小鼠脾臟菌落計(jì)數(shù)明顯少于未治療組，進(jìn)一步證實(shí)噬菌體治療效果顯著。

表1 小鼠脾菌數(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果
Tab.1 Count number of spleen count in mice

小鼠mice12345678910實(shí)驗(yàn)組Experiencegroup1311111113對(duì)照組Controlgroup133537535934922541

注：1∶50稀釋組，P=0.026<0.05

Note：1∶50 dilution group,P=0.026<0.05

3 討 論

鮑氏不動(dòng)桿菌感染常見(jiàn)于重癥感染患者，雖然本身是條件致病菌，但是目前耐藥現(xiàn)象非常嚴(yán)重，并且已經(jīng)出現(xiàn)泛耐藥的鮑氏不動(dòng)桿菌。因而，噬菌體治療的研究重新受到重視。

本研究以不同劑量的泛耐藥鮑氏不動(dòng)桿菌感染小鼠，采用統(tǒng)一效價(jià)的噬菌體治療，在一定的感染程度下，療效是值得肯定的。但是噬菌體并不能保證所有被感染的小鼠存活，這與感染嚴(yán)重程度密切相關(guān)，當(dāng)感染非常嚴(yán)重時(shí)，治療與不治療已經(jīng)沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與人類疾病發(fā)展的自然規(guī)律極為相似，臨床上嚴(yán)重的感染，再有效的藥也不可能使100%的病人免于死亡。再者，泛耐藥鮑氏不動(dòng)桿菌，雖是條件致病菌，但感染劑量大時(shí)很容易導(dǎo)致無(wú)基礎(chǔ)疾病的小鼠很快死亡，死亡速度非常快，通常在12h內(nèi)。當(dāng)感染的菌量太小時(shí)，無(wú)論治療與否，小鼠的生存都不會(huì)受到影響。此外，在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)鮑氏不動(dòng)桿菌一旦導(dǎo)致小鼠的重癥感染，噬菌體治療后，存活而且脾菌數(shù)顯示有菌的小鼠其生存狀況都比較好，人為觀察下看不出有菌和無(wú)菌小鼠的區(qū)別，這也許與觀察時(shí)間不夠長(zhǎng)有關(guān)，在以后的研究中將會(huì)延長(zhǎng)觀察時(shí)間。

鮑曼不動(dòng)桿菌感染有其自身的特點(diǎn)，噬菌體在一定條件下的確有保護(hù)宿主不受感染的能力，但是目前主要問(wèn)題是裂解譜窄，提高效價(jià)比較困難，一方面需要更大量地尋找寬噬噬菌體，另一方面可以通過(guò)改造噬菌體的基因來(lái)解決。但同時(shí)噬菌體由于其生物學(xué)特性的特殊性，與抗生素相比無(wú)半衰期的限制，可能只需使用一次，只要宿主菌存在，它在體內(nèi)可以自動(dòng)增殖，不斷裂解宿主菌。并且噬菌體高度專一，只破壞相對(duì)應(yīng)的一種宿主菌，對(duì)人體內(nèi)正常菌群無(wú)影響，這些絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)，是它又被重新重視的重要原因。此外，噬菌體用作藥物還需要長(zhǎng)期毒性、異毒性及致畸作用等方面的全面更深入的研究。

[1] Peleg AY, Seifert H, Paterson DL,Aeinetobaeterbaumannii; emergenec of a successful pathogen[J].Clin Microbiol Rev,2008,21(3):538-582.

[2] Dijkshoorn L, Nemec A, Selferr H. An increasing threat in hospitals: multidrug-resistantAeinetobaeterbaumannii[J].Nat Rev-Microbiol,2007,5(12):939-951.

[3] Gong Y, Chen J, Liu C, et al.Comparison of pathogens anti antibiotic resistance of burn patients in the burn ICU or in the common burn ward[J]. Burns,2014, 40(3)：402-407．

[4] Hu FP, Zhu DM, Wang F, et al. Surveillance of bacterial resistance in CHINET China 2014[J]. J Chin Infect Chemother, 2015, 15 (15): 401-410. (in Chinese)

胡付品，朱德妹，汪復(fù)等．2014年CHINET中國(guó)細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)[J].中國(guó)感染與化療雜志, 2015，15(15): 401-410.

[5] Karaiskos I, Giamarellou H. Muhidrug-resistant and extensively drug-resistant Gram-negative pathogens: current and emerging therapeutic approaches[J].Expert Opin Pharmacother, 2014,15(10): 1351-1370.

[6] Visea P, Seifert H, Towner KJ.Aeinetobaeterinketion-an emerging threat to human health[J]. IUBMB Life, 2011, 63(12):1048-1054.

[7] Hauser AR, Meesas J, Moir DT. Beyond antibiotics new therapeutic approaches for bacterial infections[J]. Clin Infect Dis, 2016, 63(1): 89-95.

[8] Kutter EM, Kuhl SJ, Ahedon ST. Re-establishing a place for phage therapy in western medicine[J]. Future Mierobiol, 2015, 10(5): 685-688.

[9] Long Z, Zhou YF. Research status of antibacterial treatment of non antibiotic substances[J]. Clinical Pediatr, 2015, 33 (6): 592-596.(in Chinese)

龍智，周云芳．非抗生素物質(zhì)抗菌治療的研究現(xiàn)狀[J].臨床兒科雜志, 2015,33(6): 592-596.

[10] Karlowsky A, Draghi DC, Jones ME, et al. Surveillance for antimicrobial susceptibility among clinical isolates ofPseudomonasaeruginosandAcinetobacterbaumanniifrom hospitalized patients in the United States, 1998 to 2001[J]. Antimicrob A gents Chemother, 2003, 47: 1681-1688.

[11] Hu B, Jing W, Yan Q, et al. Study of bacteriophage treatment of imipenem resistantPseudomonasaeruginosain mice[J]. Chin J Micro and Immun, 2006, 26 (5): 438-441.(in Chinese)

胡北, 王晶, 嚴(yán)群,等. 噬菌體治療實(shí)驗(yàn)性小鼠耐亞胺培南銅綠假單胞菌感染的研究[J]. 中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志, 2006, 26(5): 438-441.

[12] Aslanov BI, Iafaev RK, Zueva LP. Mode of the rational use ofPseudomonasaeruginosabacteriophages in therapeutic and epidemic control practice[J].Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol, 2003, (5): 72-76.

[13] Smiths HW, Huggine MB. Successful treatment of phageEscherichiacoliinfections in mice using phages: its general superiority over antibiotics[J]. Gen Microbiol, 1982, 128(2): 307-318.

[14] Alexander S, Zemphira A, Glenn J. Bacteriophage therapy[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2001, 45(3): 649.

ThetreatmentofsevereinfectionofmicecausedbypandrugresistantAcinetobacterbaumanniiwithbacteriophages

YAN Li-xia1, HUANG Zhi-cheng1, REN Ying-pen1, LI Ke-mei2, CHEN Bao-wen2,WANG Guo-zhi2

(1.TaizhouCityfristHospitalofZhengjianProvince,Taizhou318020,China;2.InstitutefortheControlofPharmaceuticalandBiologicalProductsBeijing100050,China)

We explored the effect of therapy with bacteriophages for pandrug resistantAcinetobacterbaumanniiinfections. Kunming mice (Specific Pathogen Free) were divided into two groups: experimental group (severe infection caused by pandrug resistantAcinetobacterbaumannii) and the control group. The mice of experimental group were treated with Phages AB46 while the mice of control group were treated with broth. The survival rate was compared with statistical method and the spleen bacteria count was analyzed. Results showed that there were statistical difference between the experimental group and control group of Pandrug resistantAcinetobacterbaumanniigroups of 1∶10 dilution,P=0.020<0.05. There were no statistical difference between each two groups of 1∶2 (P=0.650) and 1∶5 (P=0.170) dilution, both were>0.05. There were no dead mice in groups of 1∶50 dilution with statistical difference of spleen bacteria count,P=0.026. Therapy with phages was an effective method to control infection caused by Pandrug resistantAcinetobacterbaumanniiwhich could increase the survival rate and decrease spleen bacteria count of the mice with light infection.

bacteriophage; treatment;Acinetobacterbaumannii; infection

Wang guo-zhi，Email: tbtestlab@126.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.10.014

王國(guó)治，Email：tbtestlab@126.com

1.浙江省臺(tái)州市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，臺(tái)州 318020；

2.中國(guó)藥品生物制品檢定研究院，北京 100050

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A

1002-2694(2017)10-0920-03

2017-06-23編輯李友松