安翠紅，陳寶寶，呂 文，聶守民，范鎖平，孫養(yǎng)信

陜西省鼠疫耶爾森菌差異區(qū)段分型及其流行病學(xué)特征分析

安翠紅，陳寶寶，呂 文，聶守民，范鎖平，孫養(yǎng)信

目的分析陜西省鼠疫耶爾森菌差異區(qū)段分型及流行病學(xué)特征。方法對分離自陜西省鼠疫疫區(qū)獲得的48株鼠疫菌應(yīng)用23個DFR(差異區(qū)段)和PMT1(質(zhì)粒驗證)PCR擴(kuò)增，進(jìn)行鼠疫菌DFR基因組分型及流行病學(xué)特征分析。結(jié)果相同年份，不同染疫動物、媒介蚤分離的鼠疫菌基因組型基本一致。陜西鼠疫耶爾森菌DFR基因組型有Genomovar11、17、20共3種。1987-1988年份、2000-2001年份DFR基因組型以Genomovar17為主，2006年份以Genomovar20為主。結(jié)論不同年份疫情主導(dǎo)的基因組型不同，隨著時間的變化，鼠疫菌DFR基因組型從Genomovar17基因缺失微進(jìn)化到Genomovar20。

陜西；鼠疫菌；DFR分型；流行病學(xué)

鼠疫是一種自然疫源性疾病，其病原體為鼠疫耶爾森氏菌(以下簡稱鼠疫菌)。根據(jù)對甘油、亞硝酸鹽和阿拉伯糖的代謝能力，將鼠疫菌分為古典、中世紀(jì)、東方和田鼠4個生物變種[1]。1987年紀(jì)樹立等將鼠疫菌分為17個生態(tài)型[2]。1997年和2005年青藏高原青海田鼠和準(zhǔn)格爾盆地大沙鼠疫源地的發(fā)現(xiàn)，豐富了我國鼠疫菌生態(tài)型，其數(shù)目增加到21個[1]。21個生態(tài)型鼠疫菌各有特定的地理位置，對人的侵襲力、致病力各不相同。差異區(qū)段分析(Different region，DFR)是指在一些菌株基因組中存在，而在另外一些菌株的基因組中缺失的基因區(qū)[3]，DFR的缺失和獲得反映了鼠疫菌在自然界適應(yīng)性演化的遺傳基礎(chǔ)[4]。周冬生和Li 等[5-6]將DFR應(yīng)用于鼠疫菌的分子分型，提出了主要基因組型和次要基因組型的概念，主要基因組型與鼠疫菌在自然疫源地中的演化密切相關(guān)。

陜西省榆林市定邊縣1987年5月被判定為鼠疫疫源地，為鄂爾多斯高原長爪沙鼠鼠疫疫源地的一部分。1987-1988年、2000-2001年、2006年發(fā)生3次動物鼠疫流行，鼠疫菌生物變種為中世紀(jì)變種，生態(tài)型為鄂爾多斯高原型。為探究鼠疫菌在陜西省鼠疫疫源地的進(jìn)化及其與生態(tài)適應(yīng)的關(guān)系，本文運用23個差異區(qū)段和PMT1對陜西鼠疫疫源地定邊縣三起動物鼠疫流行期間分離到的48株鼠疫菌進(jìn)行DFR基因組分型，并分析流行特征。

1 菌株來源

三起鼠間鼠疫流行期間分離到48株菌。其中1987-1988年8株，2000-2001年30株，2006年10株。菌株分離于自斃動物及自斃動物寄生蚤，其中長爪沙鼠35株，黑線倉鼠1株，荒漠毛足鼠1株，五趾跳鼠1株，禿病蚤5株，同型客蚤4株，二齒新蚤1株。

2 方 法

2.1鼠疫菌DNA的提取 DNA提取按照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行。

2.2DFR分型 用23對分型引物DFR01～DFR23和質(zhì)粒驗證引物PMT1對被試菌株DNA進(jìn)行分型，實驗設(shè)置陰性、陽性對照，以91001、620024菌株DNA的等量混合物為陽性對照，結(jié)果分析按照文獻(xiàn)[6]進(jìn)行。

3 結(jié) 果

采用PCR技術(shù)對分離48株鼠疫菌23個DFR和PMT1進(jìn)行了驗證，獲得了每株菌的DFR圖譜，共發(fā)現(xiàn)DFR基因組型有3種，分別為11、17、20。見表1。1987-1988年份、2000-2001年份DFR基因組型以17為主，2006年份以20為主。相同年份，不同染疫動物、媒介蚤分離的鼠疫菌基因組型基本一致。不同年份、不同宿主、媒介來源菌株基因組型見表2、表3。疫源鄉(xiāng)鎮(zhèn)分布見圖1。

表1 48株鼠疫菌的DFR基因組型
Tab.1 Genomovars of 48 Yersinia pestis based on DFR profiling

基因組型Genomovars菌株數(shù)numbersofstrainsDFR位點Locus1234567891011121314151617181920212223PMT1Genomovar114011110011111010001111101Genomovar1733011110011111010000111101Genomovar2011011110011110010000111101

注：表頭中1～23代表DFR1～DFR23位點.“1”表示基因組組中存在該DFR；“0”表示該DFR在基因組組中缺失。

Note: the 1～23 in the header represents the DFR1～DFR23 locus. The number 1 and 0 indicate the presence and absence of the DFR locus in the genome.

表2 不同年份鼠疫菌分離株的DFR基因組型
Tab.2 Genomovars of Yersinia pestis isolates from different years

年份years菌株數(shù)Amountofstrains基因組型Genomovars1987-19887Genomovar171Genomovar202000-200126Genomovar174Genomovar11200610Genomovar20菌株合計total48

圖1 定邊縣疫源鄉(xiāng)鎮(zhèn)分布Fig.1 Epidemic villages and towns in Dingbian County

表3 不同宿主、媒介來源菌株的DFR基因組型
Tab.3 DFR genomovar of Yersinia pestis isolates from different host and media

年份years宿主動物hosts媒介vector菌株數(shù)No．ofstrains基因組型Genomovars1987-1988長爪沙鼠Merionesunguiculatus4Genomovar17禿病蚤蒙冀亞種Nosopsylluslaevicepskuzenkovi1Genomovar20禿病蚤蒙冀亞種N．laevicepskuzenkovi1Genomovar17同形客蚤Xenopsyllaconformisconformis2Genomovar172000-2001長爪沙鼠M．unguiculatus21Genomovar17長爪沙鼠M．unguiculatus4Genomovar11荒漠毛足鼠Phodopusroborovskii1Genomovar17黑線倉鼠Cricetulusbarabensis1Genomovar17五趾跳鼠Allactagasibirica1Genomovar17禿病蚤蒙冀亞種N．laevicepskuzenkovi2Genomovar172006長爪沙鼠M．unguiculatus7Genomovar20同形客蚤X．conformisconformis2Genomovar20禿病蚤蒙冀亞種N．laevicepskuzenkovi1Genomovar20菌株合計total48

4 討 論

陜西省疫源地僅分布于定邊縣。該縣隸屬于榆林市，地處陜西省西北角、榆林市的最西端，是黃土高原與內(nèi)蒙古鄂爾多斯荒漠草原過渡地帶，位于東經(jīng)107°15′至108°22′，北緯36°49′至37°53 ′。東至東南與本省靖邊縣、吳起縣相連；南至西南與甘肅省華池縣、環(huán)縣相接；西與寧夏回族自治區(qū)鹽池縣毗鄰，北至東北與內(nèi)蒙古鄂托克前旗、烏審旗相鄰，系陜、甘、寧、蒙四省區(qū)交界地。1987-1988年份、2000-2001年份鼠間疫情是在獲悉內(nèi)蒙寧夏發(fā)生鼠疫后，擴(kuò)大檢索，發(fā)現(xiàn)疫情的。疫情是否受到兩地的波及，從DFR基因組型分型結(jié)果來看，陜西發(fā)現(xiàn)的3個基因組型，為內(nèi)蒙古高原長爪沙鼠鼠疫疫源地的主要基因組型[8]，且Genomovar20型僅分布于長爪沙鼠鼠疫疫源地，從分子分型角度證實了陜西鼠疫疫源地為鄂爾多斯高原長爪沙鼠鼠疫疫源地的一部分，據(jù)此推測陜西疫情與兩地疫情關(guān)聯(lián)，因內(nèi)蒙古、寧夏接壤區(qū)域?qū)?yīng)流行年代菌株尚無文獻(xiàn)可查，這一點還有待于以后驗證。

陜西自1987年被判定為鼠疫疫源地以來，共發(fā)生了3起鼠間疫情，從DFR基因組分型看，1987-1988年份、2000-2001年份前流行主要基因組型一致，三起疫情流行的主導(dǎo)組型不一致，2006年份流行的主導(dǎo)組型在2000-2001年份尚未檢測到，說明鼠間疫情不受前兩次的影響，有自身的規(guī)律。從表3可以看出，同一塊鼠疫疫源地主要基因組型與菌株來源宿主、媒介無關(guān)聯(lián)。

查閱資料1987-1988年資料，參考馬國柱[9]、岳永杰[10]對2000-2001、2006年菌株分析，三起鼠間疫情鼠疫耶爾森菌脫氮陰性，甘油+，鼠李糖-，麥芽糖-，阿膠糖+(1987年有2株不發(fā)酵)，根據(jù)紀(jì)樹立分型標(biāo)準(zhǔn)屬于鄂爾多斯高原生態(tài)型[2]。尤其是2000-2001、2006年份，菌株生化特性完全一致。但本研究發(fā)現(xiàn)這兩次疫情發(fā)生期間，菌株DFR基因組型卻不一致。說明傳統(tǒng)的生態(tài)分型不夠細(xì)致，而分子分型不僅可以把不同的菌株分開，還能把相似的菌株分開。

鼠疫耶爾森菌的基因組型均局限于特定的地理區(qū)域, 通常是完整的鼠疫自然疫源地或是部分地域, 每個地理區(qū)域都有其獨特的環(huán)境、宿主、鼠疫耶爾森菌組合[11]。決定鼠疫耶爾森菌存在及其型別的因素可看作是一個由自然環(huán)境、貯存宿主、傳播媒介、病原體相互作用的復(fù)合體(宿主生態(tài)位)，在不同的地理區(qū)域中,起主要作用的因素各有不同。本研究發(fā)現(xiàn)陜西鼠疫菌DFR基因組型為Genomovar 11、17、20，1987-1988年份、2000-2001年份DFR基因組型以17為主，2006年份以20為主，表明引起陜西省鼠疫疫源地鼠間鼠疫流行的菌株已經(jīng)發(fā)生了變化?；蛐虶20與G11相比，缺失了DFR12和18 位點，與G17相比，缺失了DFR12位點，說明鼠疫菌種內(nèi)正經(jīng)歷著典型的基因組平行微進(jìn)化過程,基因缺失不斷發(fā)生，推動了鼠疫菌基因組的簡約進(jìn)化[12]。這與其地理生態(tài)環(huán)境密切相關(guān)，一定程度上反應(yīng)了鼠疫菌適應(yīng)自然選擇的結(jié)果。

陜西鼠疫耶爾森菌DFR基因組型有Genomovar11、17、20共3種。17型多分布在定邊的周臺子鄉(xiāng)、定邊鎮(zhèn)疫點及鹽場堡狼塘疫點，20型分布在紅柳溝鎮(zhèn)黃沙窩疫點及鹽場堡的馬圈村。這3個基因組型為內(nèi)蒙古高原長爪沙鼠鼠疫自然疫源地主要基因組型，文獻(xiàn)[8]將3044株鼠疫菌分為52個基因組型，其中Genomovar20有73株，全分布于該疫源地。據(jù)了解，所有疫點生境植被差別不是太大，從圖1可以看出，4個疫源鄉(xiāng)鎮(zhèn)連成一片，中間沒有特殊屏障隔開，分析不同疫點基因組型不同是鼠疫菌適應(yīng)疫源地大環(huán)境改變的結(jié)果。這一說法有待以后驗證。

[1] Cong XB,Yin WW. Emergency Handbook of plague control and prevention[M] ．Beijing：Peking University Medical Press．2009：13．(in Chinese)

叢顯斌, 殷文武.北京：鼠疫防控應(yīng)急手冊[M].北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2009：13.

[2] Ji SL，Zhang HJ，Liu YP，et al．The typing and ecology，epidemioiogical significance of Chinese Yersinia pestis [J]．Chin J Endemiol，1987，6(5)：257-263．(in Chinese)

紀(jì)樹立，張海峻，劉云鵬，等．中國鼠疫菌分型及其生態(tài)學(xué)流行病學(xué)意義[J]．中國地方病學(xué)雜志，1987，6(5)：257-263．

[3] Zhou DS，Yang RF. Strategies on the evolutionary for Bacterial Genomes[J]．J Micro, 2004，24(1):34-41. (in Chinese)

周冬生，楊瑞馥．細(xì)菌基因組進(jìn)化的分子策略[J].微生物學(xué)雜志，2004，24(1):34-41.

[4] Li YJ.Study of genomic polymorphism inYersiniapestisand construction of the rapid source—tracking pipeline[D]．Beijing: Academy of Military Medical Sciences，2009.(in Chinese)

李艷君．鼠疫耶爾森氏菌基因組多態(tài)性研究及快速鑒定溯源系統(tǒng)的建立[D]．北京：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，2009.

[5] Zhou DS，Han YP，Song YJ，et a1．DNA microarray analysis of genome dynamics inYersiniapestis：insight into bacterial genome microevolution and niche adaptation[J]．Med J Chin PLA，2004, 29(3)：204-210．(in Chinese)

周冬生, 韓延平, 宋亞軍，等. 鼠疫耶爾森氏菌基因組進(jìn)化與生態(tài)位適應(yīng)研究[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2004，29(3):204-210.

[6] Li Y, Dai E, Cui Y, et al. Different region analysis for genotypingYersiniapestisisolates from China[J]. PLoS One, 2008, 3(5): e2166. DOI：10.1371/journal.pone.0002166

[7] Achtman M, Zurth K, Morelli G, et al.Yersiniapestis, the cause of plague, is a recently emerged clone ofYersiniapseudotuberculosis[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1999, 96: 14043-14048.

[8] Yang XY,Wei BQ,Jin J, et al. Regional genotyping and the geographical distribution regardingYersiniapestisisolates in China[J]． Chin J Epidemiol, 2014，35(8)，943-948. (in Chinese)

楊曉艷，魏柏青，靳娟，等. 中國鼠疫耶爾森菌差異區(qū)段分型及其地理分布特征[J].中華流行病學(xué)雜志，2014，35(8)，943-948.

[9] Ma GZ,Zhang FL,Wang L,et al, Identification and analysis of the biological characteristics ofY.pestisstrains isolated from Shaanxi Province 2000 to 2001 [J]． China Endem, 2003,18(3):163-164. (in Chinese)

馬國柱,張福利,王麗,等.陜西省2000-2001年分離鼠疫菌株特性及分析[J].中國地方病防治雜志,2003,18(3):163-164.

[10] Yue YJ,An CH,Sun YX.Identification and analysis of the biological characteristics ofYersiniapestisstrains isolated in Shaanxi in 2006[J]． China Endem, 2003,18(3):163-164. (in Chinese)

岳永杰,安翠紅,孫養(yǎng)信.陜西省2006年鼠疫菌生物學(xué)特性及分析[J].中國地方病防治雜志，2009,24(3):204-206.

[11] Rang RF,Huang PT.Comparative and evolutionary genomics of Yersinia pestis[J]．Med J Chin PLA,2004，29(3):189-191.(in Chinese)

楊瑞馥，黃培堂. 鼠疫耶爾森菌比較和進(jìn)化基因組學(xué)研究[J] .解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2004，29(3):189-191.

RegionalgenotypingandepidemiologicalcharacteristicsregardingYersiniapestisisolatesinShaanxiProvince,China

AN Cui-hong, CHEN Bao-bao, LYU Wen, NIE Shou-min, FAN Suo-ping, SUN Yang-xin

(ShaanxiCenterforDiseaseControlandPrevention,Xi’an710054,China)

We typedYersiniapestisisolated from plague foci of Shaanxi Province using different region (DFR) and analyzed epidemiological characteristics. Twenty-three DFRs primers and PMT1 (plasmid) primer were used to verify the DFR genomovars and 48Yersiniapestiswere involved to analyze DFR profiles and epidemiological characteristics. In the same year, the genotypes ofYersiniapestisisolated from different infected vector and animals were basically the same. Three genomovars named Genomovar 11, 17, and 20 were verified in 48Yersiniapestisstrains in Shaanxi Province. The main genotypes were different in different epidemic years. In 1987-1988 and 2000-2001 years, genomovar 17 was major genomovar and genomovar 20 in 2006 year. In conclusion, the dominant genotypes were different in different epidemic years. As time goes on, DFR genomovars ofYersiniapestisundergone the evolution of gene deletion, which changes genomovar 17 into genomovar 20.

Shaanxi Province;Yersiniapestis; DFR genotyping; epidemiological characteristics

Sun Yang-xin，Email: sxpco@126.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.10.013

孫養(yǎng)信, Email: sxpco@126.com

陜西省疾病預(yù)防控制中心，西安 710054

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A

1002-2694(2017)10-0916-04

2017-05-10編輯李友松