黃博聞，李亞楠，史云雅，劉 珊，雷園園，郭永軍，劉金蘭

(天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384)

四種消毒劑對搖蚊幼蟲殺菌效果研究

黃博聞，李亞楠，史云雅，劉 珊，雷園園，郭永軍，劉金蘭

(天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384)

為篩選四種魚用消毒劑對搖蚊幼蟲(Chironomidlarvae)最適消毒條件，在單因素試驗基礎(chǔ)上，以消毒劑對搖蚊幼蟲攜帶細(xì)菌相對滅菌率為考察指標(biāo)進(jìn)行正交試驗；以消毒后搖蚊幼蟲相對存活率、稀有鯽(Gobiocyprisrarus)對搖蚊幼蟲平均攝食時間、消毒后未殺滅細(xì)菌種類為指標(biāo)，綜合評價消毒蟲體質(zhì)量。結(jié)果顯示：濃度因子對聚維酮碘、新潔爾滅、高錳酸鉀的相對滅菌率有極顯著影響；時間因子對聚維酮碘的相對滅菌率影響極顯著；溫度因子對聚維酮碘的相對滅菌率影響極顯著，對新潔爾滅影響顯著；濃度、時間和溫度因子均對戊二醛的相對滅菌率無顯著影響；在實驗室條件下，根據(jù)消毒劑對相對滅菌率的各影響因子主次順序得到了四種消毒劑消毒搖蚊幼蟲的最佳因子參數(shù)，其中高錳酸鉀：消毒劑濃度60 mg/L，消毒溫度28 ℃，消毒時間1.5 h；聚維酮碘：消毒溫度24 ℃，消毒劑濃度150 mg/L，消毒時間1 h；新潔爾滅：消毒劑濃度3 200 mg/L，消毒溫度24 ℃，消毒時間1 h；戊二醛：消毒溫度28 ℃，消毒時間1.5 h，消毒劑濃度20 000 mg/L。四種消毒劑最佳消毒條件對搖蚊幼蟲相對存活率及對稀有鯽攝食效果影響不大；消毒后從不同來源的四份蟲體樣品共分離出未殺滅的細(xì)菌16種，主要隸屬于氣單胞菌屬和不動桿菌屬。

搖蚊幼蟲(Chironomidlarvae)；稀有鯽(Gobiocyprisrarus)；高錳酸鉀；聚維酮碘；新潔爾滅；戊二醛；相對滅菌率

搖蚊幼蟲(Chironomidlarvae)又名紅蟲，隸屬于節(jié)肢動物門(Arthropoda)昆蟲綱(Insecta)雙翅目(Diptera)搖蚊科(Chironomidae)，廣泛分布于各類水體，生物量常占底棲生物總量的50%以上，其營養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量占干物重的41%～62%，脂肪占2%～8%，是多種經(jīng)濟(jì)水生動物的優(yōu)良天然餌料[1-4]。搖蚊幼蟲營底棲生活并有筑巢習(xí)性，通常以細(xì)沙、淤泥、腐屑、藻類等筑巢，以有機(jī)碎屑、細(xì)菌、藻類等為食，不可避免地攜帶著細(xì)菌等病原體[5-7]。目前關(guān)于對鮮活餌料的消毒主要集中于水蚯蚓、豐年蟲、輪蟲、大瀧六線魚等種類上[8-10]，對搖蚊幼蟲的消毒方法研究還未見報道。本試驗旨在通過四種漁用消毒劑對搖蚊幼蟲消毒方法的研究，篩選搖蚊幼蟲最佳消毒條件，以降低養(yǎng)殖水生動物因攝食搖蚊幼蟲引發(fā)疾病的風(fēng)險。

1 材料與方法

1.1 試劑與實驗動物

聚維酮碘(北京百靈威科技有限公司，有效碘含量10.62%)、戊二醛、新潔爾滅、高錳酸鉀、氯化鈉均為國產(chǎn)分析純(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)。

4份4齡期搖蚊幼蟲樣品購自天津中環(huán)花鳥魚蟲市場，暫養(yǎng)溫度為(25±1)℃，光照周期為16∶8(光∶暗)。稀有鯽(Gobiocyprisrarus)由中科院水生生物研究所提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 蟲體吐臟

參考樊海平等[10]的方法適當(dāng)修改。稱取濾干搖蚊幼蟲100 g，在28 ℃條件下，分別于不同濃度食鹽水中浸泡不同時間后，清水沖洗干凈，于60 ℃干燥箱烘48 h稱重，計算吐臟量。

吐臟量計算公式:吐臟量(g/100g)=G對照-G試驗

式中，G對照、G試驗分別為對照組與試驗組搖蚊幼蟲干重。

1.2.2 蟲體消毒

試驗在(20±1)℃水溶液中進(jìn)行，每組3個平行。試驗時，在無菌離心管內(nèi)加入1 g經(jīng)吐臟處理后的搖蚊幼蟲，再加入10 mL消毒劑，作用至設(shè)定時間，使用無菌PBS沖洗三次。從每組分別稱取0.1 g蟲體經(jīng)搗碎機(jī)(4 500 r/min)搗碎2 min，取原漿0.2 mL，10倍管外梯度稀釋，吸取0.1 mL稀釋液涂布于牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)36 h后進(jìn)行活菌計數(shù)，并計算相對滅菌率。

相對滅菌率=(對照組活菌數(shù)-試驗組活菌數(shù))/對照組活菌數(shù)×100%

1.2.3 消毒劑對搖蚊幼蟲消毒效果的條件優(yōu)化

為得到優(yōu)化方法，根據(jù)單因素實驗結(jié)果設(shè)計正交實驗，以藥物濃度(A)、藥物作用時間(B)、作用溫度(C)為3個因素，每個因素3個水平，采用L9(34)正交表進(jìn)行正交試驗，因素與水平見表1。相對滅菌率計算方法同1.2.2。

表1 正交試驗因子與水平Tab.1 Orthogonal experimental factors and levels

1.2.4 驗證試驗

在正交試驗得到的四種消毒劑對搖蚊幼蟲的最佳消毒條件下進(jìn)行驗證試驗，試驗方法同1.2.2，每種消毒劑設(shè)3個平行組。

1.2.5 四種消毒劑消毒對搖蚊幼蟲相對存活率的影響

采用正交實驗最優(yōu)結(jié)果對搖蚊幼蟲進(jìn)行消毒處理，置于1 000 mL燒杯中，每杯50蟲，試驗期間每24 h連續(xù)7 d計數(shù)各消毒組搖蚊幼蟲存活情況，及時取出死亡個體。以玻璃棒輕壓搖蚊幼蟲尾部3次后不做“8”字形運動為死亡標(biāo)準(zhǔn)[13]，計算蟲體相對存活率。

試驗在1 000 mL燒杯中進(jìn)行。將75尾(平均體重0.84 g±0.1 g)健康稀有鯽隨機(jī)分配到4個試驗組和一個對照組，每組設(shè)3個平行，每平行5尾，每組共15尾。試驗前將魚饑餓1 d至排空糞便，每日按魚體重5%的投喂量，試驗組分別投喂在正交實驗最優(yōu)條件下由高錳酸鉀、聚維酮碘、新潔爾滅、戊二醛消毒過的規(guī)格相對均一的搖蚊幼蟲，對照組投喂未經(jīng)消毒的搖蚊幼蟲，每天2次(9∶00、17∶00)，計時攝食時間，以5 min為攝食終點。如5 min后有餌料剩余，收集殘餌吸干稱重，計算攝食率；5 min內(nèi)攝食完成，則記錄攝食時間。試驗時間為7 d，投喂期間自然光照，水溫為(28±1)℃，pH(7.7±0.17)，水深12 cm，24 h氣泵增氧，每日換水量為1/3。

攝食率=(每次投喂量-每次殘餌量)/每次投喂量×100%

1.2.7 消毒后存活細(xì)菌分離鑒定

對用四種消毒劑最佳消毒方案消毒過的4份不同水體來源搖蚊幼蟲樣品存活細(xì)菌分離并連續(xù)純化3次。采用16S rDNA序列分析進(jìn)行細(xì)菌鑒定：引物序列為27F：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′，1492R：5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACTT-3′(北京生工生物工程有限公司合成)，細(xì)菌DNA提取使用DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測并送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行序列測定，將序列與GenBank中序列進(jìn)行比對分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 吐臟實驗結(jié)果

不同鹽度刺激搖蚊幼蟲吐臟后的吐臟量結(jié)果見表2。表2顯示，各鹽度組隨刺激時間增加吐臟量顯著升高。當(dāng)刺激時間為0.5 h時，各鹽度組吐臟量均差異顯著，隨鹽度的升高吐臟量增加；1.0 h時各鹽度組吐臟量差異不顯著。因此，選定在3‰鹽度下刺激吐臟1.0 h為搖蚊幼蟲吐臟條件。

表2 搖蚊幼蟲吐臟量 Tab.2 Excretion amount from C.larvae (g/100g)

注：肩標(biāo)不同小寫字母表示同行數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示同列數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。

2.2 四種消毒劑消毒搖蚊幼蟲后細(xì)菌相對滅菌率

不同藥物濃度與消毒時間下四種消毒劑對搖蚊幼蟲攜帶菌殺滅效果見圖1。由圖1可見，四種消毒劑相同濃度組消毒蟲體短時間(10 min和20 min)與長時間(60 min和90 min)間相對滅菌率差異顯著；同一時間高濃度組相對滅菌率顯著高于低濃度組，120 mg/L和150 mg/L聚維酮碘相對滅菌率顯著高于30 mg/L和60 mg/L組；40 mg/L和60 mg/L高錳酸鉀組相對滅菌率顯著高于5 mg/L和10 mg/L組；15 000 mg/L和20 000 mg/L戊二醛組相對滅菌率顯著高于1 000 mg/L和5 000 mg/L組；1 600 mg/L和3 200 mg/L新潔爾滅相對滅菌率顯著高于200 mg/L和400 mg/L濃度組。由圖2還可得到，隨著藥物濃度增加和消毒時間延長，四種消毒劑對蟲體相對滅菌率顯著上升，聚維酮碘、高錳酸鉀、戊二醛、新潔爾滅最高相對滅菌率分別達(dá)到85.64%、91.59%、90.88%、88.47%。

2.3 消毒劑消毒搖蚊幼蟲消毒條件的優(yōu)化

通過正交實驗并方差分析得到，聚維酮碘、新潔爾滅、高錳酸鉀濃度對相對滅菌率有極顯著影響，戊二醛濃度對相對滅菌率影響不顯著；聚維酮碘消毒時間對相對滅菌率影響極顯著，其余三種消毒劑消毒時間對相對滅菌率無顯著影響；溫度對聚維酮碘殺滅率影響極顯著，對新潔爾滅影響顯著，而對高錳酸鉀、戊二醛相對滅菌率影響不顯著。

注：a.聚維酮碘 b.高錳酸鉀 c.戊二醛 d.新潔爾滅

由表3可知，影響高錳酸鉀對相對滅菌率的因素主次順序為：消毒劑濃度>消毒溫度>消毒時間，最優(yōu)條件為：消毒劑濃度為60 mg/L，消毒溫度為28 ℃，消毒時間為1.5 h；影響聚維酮碘的因素主次順序為：消毒溫度>消毒劑濃度>消毒時間，最優(yōu)條件為：消毒溫度為24 ℃，消毒劑濃度為150 mg/L，消毒時間為1 h；影響新潔爾滅的因素主次順序為：消毒劑濃度>消毒溫度>消毒時間，最優(yōu)條件為：消毒劑濃度為3 200 mg/L，消毒溫度為24 ℃，消毒時間為1.0 h；影響戊二醛的因素主次順序為：消毒溫度>消毒時間>消毒劑濃度，最優(yōu)條件為：消毒溫度為28 ℃，消毒時間為1.5 h，消毒劑濃度為20 000 mg/L。

2.4 驗證試驗結(jié)果

根據(jù)正交試驗優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行驗證實驗，每種藥物設(shè)3平行，驗證實驗得到高錳酸鉀、聚維酮碘、新潔爾滅、戊二醛平均相對滅菌率分別為92.23%、93.12%、95.21%、92.87%，其結(jié)果均略高于正交實驗結(jié)果，表明正交實驗的優(yōu)化結(jié)果可信。

2.5 消毒劑消毒對搖蚊幼蟲相對存活率的影響

由表4可知，四種消毒劑處理均對搖蚊幼蟲相對存活率具有一定影響。高錳酸鉀、戊二醛消毒處理后一周內(nèi)搖蚊幼蟲相對存活率與對照組相對存活率均無顯著差異；而聚維酮碘、新潔爾滅對搖蚊幼蟲消毒處理后的第3、6、7 d，其相對存活率顯著低于對照組相對存活率。

由圖2可知，四種消毒劑在最佳消毒方案下消毒的搖蚊幼蟲對稀有鯽平均攝食時間有一定影響，但各消毒劑處理組均在1 min內(nèi)完成攝食，故其5 min內(nèi)攝食率為100%。試驗第1～6天，各消毒劑處理組平均攝食時間與對照組差異顯著；試驗第7天，聚維酮碘、新潔爾滅處理組平均攝食時間與對照組無顯著差異，試驗組平均攝食時間隨投喂天數(shù)的增加與對照組平均攝食時間差異逐漸減小。

表3 正交試驗設(shè)計及結(jié)果Tab.3 The orthogonal experiment design and result

注：a、b、c、d分別代表高錳酸鉀、聚維酮碘、新潔爾滅、戊二醛殺滅率；A、B、C分別為消毒藥物濃度、消毒時間、消毒溫度。

表4 四種消毒劑消毒后搖蚊幼蟲相對存活率Tab.4 Relative survival percent of disinfected C.larvae

注：表中數(shù)值為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，*表示與對照組差異顯著(P<0.05)。

圖2 四種消毒劑消毒的搖蚊幼蟲對稀有鯽平均攝食時間的影響Fig.2 Effect of C.Larvae disinfected by four kinds of disinfectants on feeding time of Gobiocypris rarus

2.7 搖蚊幼蟲消毒后未殺滅細(xì)菌鑒定結(jié)果

采用四種消毒劑最佳消毒方案對不同水體來源的四份搖蚊幼蟲樣品進(jìn)行消毒處理后，通過細(xì)菌分離鑒定共得到16種未殺滅細(xì)菌，以氣單胞菌屬及不動桿菌屬為主(見表5)。其中氣單胞菌屬中，嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌、水生氣單胞菌為水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見致病菌。

3 討論

搖蚊幼蟲除極少種類外，普遍具有四齡[11]，研究表明搖蚊幼蟲隨齡期增加對藥物耐受能力增強(qiáng)[12,13]。本試驗搖蚊幼蟲為第4齡期，在實際生產(chǎn)中應(yīng)根據(jù)生產(chǎn)條件、搖蚊幼蟲齡期及待投喂魚類品種，選擇適當(dāng)消毒劑及消毒劑濃度。

表5 消毒后未殺滅細(xì)菌分離鑒定結(jié)果Tab.5 Strains of survival bacterial from disinfected Chironomid Larvae by isolation and identification

注：*表示革蘭氏陽性菌。

本實驗中采用四種消毒劑最佳處理方案對4份搖蚊幼蟲樣品進(jìn)行消毒處理后，分離細(xì)菌以不動桿菌屬及氣單胞菌屬為主。氣單胞菌普遍存在于淡水、淤泥和污水中[14]，張涵等[15]報道不動桿菌屬為三角帆蚌腸道優(yōu)勢菌，搖蚊幼蟲與三角帆蚌生活環(huán)境、食性相似，故二者攜帶細(xì)菌組成相似。有研究表明，細(xì)菌可通過水產(chǎn)動物的攝食進(jìn)入其體內(nèi)[16,17]，當(dāng)氣單胞菌等重要條件致病菌在魚類消化道內(nèi)達(dá)到一定的優(yōu)勢度時會體現(xiàn)其致病性[18]。

實驗結(jié)果表明，實驗室條件下四種消毒劑最佳消毒方法均對搖蚊幼蟲攜帶的細(xì)菌具有較好的殺滅效果，但不能完全滅菌。有研究表明氟苯尼考、喹諾酮類藥物對氣單胞菌具有較好的抑制效果[19]；吳雅麗等[20]研究發(fā)現(xiàn)，嗜水氣單胞菌對喹諾酮類、第二、三代頭孢類等敏感；維氏氣單胞菌對氟苯尼考、阿洛西林、卡那霉素、鏈霉素等藥物敏感[21]。根據(jù)實驗結(jié)果，可篩選具有針對性的抗生素，采用消毒劑抗生素聯(lián)合殺菌，以提高消毒效果。

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StudyonbactericidaleffectoffourkindsofdisinfectantsonChironomidlarvae

HUANG Bo-wen，LI Ya-nan，SHI Yun-ya，LIU Shan，LEI Yuan-yuan，GUO Yong-jun，LIU Jin-lan

(CollegeofFishery，TianjinAgricultureUniversity，TianjinKeyLaboratoryofAqua-EcologyandAquaculture，Tianjin300384，China)

The orthogonal experiment based on single factor experimental results was conducted to select optimal disinfection conditions of four kinds of disinfectant forChironomidLarvae with the relative percent of bactericide (RPB).Furthermore，the relative survival percent (RSP) of disinfectedChironomidLarvae，average feeding time ofGobiocyprisrarusforChironomidLarvae and identified survival bacterial species were used to evaluate comprehensively the quality of disinfectedChironomidLarvae.The result showed that all of povidone iodine，benzalkonium bromide and potassium permanganate in concentration factor and only povidone iodine in disinfection time factor as well as both povidone iodine and benzalkonium bromide in disinfection temperature factor affected significantly the RPB，glutaraldehyde in all of concentration，disinfection time and temperature factors had no significant effect on RPB.The optimum parameters of the four kinds of disinfectant were：60 mg/L of concentration，28 ℃ of disinfection temperature and 1.5 h of disinfection time for potassium permanganate；24 ℃ of disinfection temperature，150 mg/L of concentration and 1 h of disinfection time for povidone iodine；3 200 mg/L of concentration，24 ℃ of disinfection temperature and 1 h of disinfection time for benzalkonium bromide；28 ℃ of disinfection temperature，1.5 h of disinfection time and 20 000 mg/L of concentration for glutaraldehyde.Four kinds of disinfectant under optimal disinfection conditions had showed no effects on RSP ofChironomidLarvae and average feeding time ofGobiocyprisrarusforChironomidLarvae.16 strains of survival bacteria isolated from disinfectedChironomidLarvae belong mainly to Aeromonas and Acinetobacter according to phylogenetic analysis.

Chironomidlarvae；Gobiocyprisrarus；potassium permanganate；povidone iodine；benzalkonium bromide；glutaraldehyde；relative percent of bactericide(RPB)

2017-06-11；

2017-08-23

天津市科技幫扶工程項目“淡水新品種引進(jìn)及養(yǎng)殖關(guān)鍵技術(shù)集成與應(yīng)用”(15ZXBFNC00330)

黃博聞(1992- )，男，碩士研究生，專業(yè)方向為水生動物疾病與免疫。E-mail:huangbwn@163.com

劉金蘭。E-mail：ljlan1115@163.com

S942.2+3

A

1000-6907-(2017)06-0074-07