楊麗平,常會會,李 杰,張智斌,黃 原

陜西師范大學生命科學學院,西安 710062

基于DNA復合條形碼技術的蝗蟲腸道共生真菌多樣性研究

楊麗平,常會會,李 杰,張智斌,黃 原*

陜西師范大學生命科學學院,西安 710062

利用DNA復合條形碼技術,研究了11個樣本的蝗蟲腸道共生真菌的多樣性。結果顯示：ITS在所研究的物種中鑒定了5門16綱29目40屬2786 OTU真菌。腸道真菌群落組成分析結果顯示：所有物種腸道真菌類群中含量最高的是木耳菌目和銀耳目,其中斑翅蝗科的真菌類群多樣性相對最高,斑腿蝗科的真菌類群多樣性相對最低,表明各蝗蟲腸道之間存在著明顯的菌群多樣性變化。α多樣性分析結果顯示：斑翅蝗科的共生真菌群落豐富度和多樣性最高,斑腿蝗科的則最低。β多樣性分析結果顯示：(1)同科的各個種的腸道真菌群落結構差異性較小,不同科的種的腸道真菌群落結構差異性較大；(2)劍角蝗科的腸道真菌群落結構與其他物種的相似性均相對較低,而且在兩個不同取樣地得到的中華劍角蝗的真菌群落結構相似性也相對較低。聚類分析結果顯示：(1)同科的蝗蟲腸道真菌首先聚到一起,且群落相似性也相對較高；(2)布勒擲孢酵母屬、內疣衣屬和外瓶霉屬3個屬在蝗蟲腸道真菌中是優(yōu)勢菌屬。

DNA復合條形碼；蝗蟲；腸道共生真菌；真菌多樣性

DNA復合條形碼是指利用高通量測序技術同時獲得很多物種的條形碼序列以進行群落分類單元組成的鑒定方法[1]。該技術可以對大量混合樣本快速地進行物種鑒定,避免了單物種DNA條形碼鑒定的低效率,其快速、可重復、高效等特點讓更多的科研人員和項目管理者能夠輕松進行生物多樣性評估。隨著高通量測序技術的發(fā)展、條形碼數據庫的完善和生物信息學軟件的開發(fā),DNA復合條形碼技術已成為微生物多樣性檢測的常用技術。

DNA復合條形碼從誕生以來已普遍應用于微生物群落的多樣性研究,在共生真菌多樣性研究方面,Schmidt[2]通過對德國弗勒斯海姆的16個土壤樣本的真菌進行內轉錄間隔區(qū)ITS1(internal transcribed spacer)區(qū)域的PCR擴增,將擴增產物進行高通量第二代測序,結果得到3320個操作分類單元OTU(operational taxonomic units),同時表明群落相似性隨著地理位置的疏遠逐漸降低；Siddique[3]采用復合條形碼技術,對3個不同地區(qū)設有梯度海拔的歐洲樺木樹葉的真菌群落多樣性進行了分析,總結出一個關于真菌全長ITS的雙末端測序的準確且有效的數據處理流程；燕勇等[4]通過對3株真菌的rDNA-ITS序列進行分析,探討基于ITS多態(tài)性的序列分析在真菌鑒定中的應用；隋心等[5]利用Tiangen DP330土壤提取試劑盒對土壤總DNA進行提取并對真菌的ITS-PCR體系進行優(yōu)化,建立了最佳ITS-PCR擴增體系。此外,DNA復合條形碼在動物多樣性[6]、植物多樣性[7]、動物食性分析和排泄物[8]等方面都有廣泛的應用。

蝗蟲是世界性的農業(yè)害蟲,在我國分布范圍廣、種群數量大。近年來,受異常氣候及生態(tài)環(huán)境惡化等因素的影響,我國蝗蟲災害的發(fā)生逐年加重,嚴重影響農業(yè)、畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展和農田、草原生態(tài)環(huán)境質量[9]。了解蝗蟲腸道內共生真菌,掌握共生菌與宿主的關系以及腸道真菌群落組成,對于利用寄生真菌或真菌代謝產生的有機物防治蝗蟲有潛在的應用價值。

目前對昆蟲腸道共生真菌的研究有限。國內有文獻報道了取食不同品種茶葉的茶尺蠖幼蟲腸道真菌[10]和黑翅土白蟻(Odontotermesformosanus)腸道中分離得到了一株產漆酶內生真菌[11]；國外有文獻報道了在哥斯達黎加的熱帶雨林中以木質為生的甲蟲腸道中的細菌和真菌,得到真菌3門16目24科40屬,且木霉屬是最豐富的真菌屬[12]。關于蝗蟲腸道共生真菌多樣性的研究就比較少。

本文選擇真菌核糖體RNA基因簇的內轉錄間隔區(qū)(ITS)作為條形碼標記,用DNA復合條形碼技術對蝗蟲腸道共生真菌組成和群落結構進行了初步研究,用α和β多樣性以及聚類分析比較了不同蝗蟲腸道中真菌多樣性組成的差別,初步揭示了蝗蟲腸道真菌的多樣性。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

研究使用的蝗蟲標本于2015年9—11月間采自秦嶺南五臺山和陜西師范大學校園﹙表1)。實驗前使蝗蟲饑餓過夜,排空體內食物殘渣,用已滅菌的鑷子從蝗蟲的頭胸部背間膜將腸道輕輕取出并立即浸泡在提前已裝2/3無水乙醇的50 mL的離心管中,同時將蟲體一并放入管中等待鑒定,保存于-20℃ 冰箱中用于DNA的提取。

1.2 總DNA的提取

將浸泡在無水乙醇中的蝗蟲腸道用已滅菌過的鑷子取出,輕放在吸水紙上,此過程需在無菌操作臺進行,待無水乙醇揮發(fā)干凈后,采用酚-氯仿方法[13]對其進行總DNA提取,得到11個DNA樣品,樣品標號如表1所示：

表1 研究標本信息和真菌鑒定結果

1.3 PCR擴增以及測序

根據White[14]等類似研究所采用的引物,實驗擴增真菌ITS的正向引物為ITS5：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG- 3′,反向引物為ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATAT GC- 3′,擴增長度約為750bp。為了能夠同時對多個樣品進行測序,以及在后續(xù)分析中區(qū)分每個樣品序列,在每個樣品的5′端都加了一個7bp的標簽序列。

實驗中PCR體系為20 μL,包括10 μL的2×Taq PCR StarMix with Loading Dye,1.0 μL的DNA模版,上游引物(10 μM)和下游引物(10 μM)各1 μL,7 μL的雙蒸水。ITS的擴增循環(huán)程序是：98℃ 5 min預熱,27個循環(huán)：98℃ 30 s,47.6℃ 45 s,72℃ 60 s,72℃ 5 min延伸,4℃保溫。

PCR產物送往上海派森諾生物科技有限公司進行高通量測序,ITS采用454 FLX+平臺進行測序。

2 數據處理和分析

2.1 原始序列處理：質量過濾和嵌合體的去除

首先,將測序得到的原始數據以sff格式保存,sff文件是一種二進制文件,用mothur[15]軟件中的sffinfo命令從中提取fasta序列文件和qual質量文件,這一過程就已經對原始數據進行了初步的質量過濾。然后,根據序列中用于區(qū)分樣品的一段堿基序列信息提取每個樣品的有效序列。

由于PCR擴增可能會產生嵌合體序列,測序過程中會產生點突變等測序錯誤,為了保證結果的準確性,需要對有效序列進一步的過濾和去除嵌合體。實驗用Qiime[16]軟件進行序列過濾,用mothur軟件去除嵌合體序列。

2.2 OTU分類和注釋

使用Qiime軟件中的uclust[17]對所得到的優(yōu)質序列按照0.97的相似度進行OTU聚類,選取每個OTU中最長序列為代表序列；將ITS的代表序列與數據庫Unite比對,獲得每個OTU分類學信息。然后,根據注釋得到的精簡OTU列表,用excel和mothur軟件做目水平上的群落百分比堆積圖和樣品間Venn圖。

2.3 群落多樣性分析

根據物種豐度,用mothur軟件中的summary.single命令,求出每個樣品的Chao1,ACE,Shannon和Simpson指數。其中Chao1和ACE指數是群落豐富度指數,二者的值越大,說明群落豐富度越高；Shannon和Simpson指數是群落多樣性指數,Simpson指數越大,說明群落多樣性越低,Shannon指數越大,說明群落多樣性越高。

用Qiime軟件,根據各樣品的物種進化和豐度信息,進行Unifrac[18- 19]分析,得到樣品間差異距離矩陣,然后進行非度量多維尺度法NMDS(non-metric multi-dimensional scaling)分析。

2.4 聚類分析

根據精簡后的OTU列表,用R軟件中的pheatmap程序包進行屬水平上的聚類分析,并繪制出heatmap[20- 21]圖。

3 結果

3.1 測序質量評價

經最初的質量過濾與拼接后真菌ITS得到的有效序列有131207條,根據序列質量控制標準,經優(yōu)化處理后共獲得130600條序列,優(yōu)質序列所占比例為99.54%。各個樣本的序列數及所占比例見下表2。

表2 各個樣本的序列及其比例結果

3.2 類群組成和群落結構

將ITS鑒定所得的優(yōu)質序列與數據庫比對,共鑒定了5門16綱29目40屬,其中各樣本組成情況見表1。在總層次上OTU的分類情況如圖1所示,ITS鑒定得到N-A和N-B的共有OTU是282,特有OTU分別是478和268；N-C和N-D的共有OTU是6,特有OTU分別是220和85；N-E和N-F的共有OTU是6,特有OTU分別是101和88；N-G和N-H共有OTU是1,特有OTU分別是214和105；X-A和X-B的共有OTU是1,特有OTU分別是933和544；X-B和X-C的共有OTU是19,特有OTU分別是526和186,同時還可以看出,各樣本之間存在著明顯的菌群多樣性變化。

圖1 ITS在總層次上組間OTU的Venn圖 Fig.1 The Venn diagram of interblock for ITS in the administrative level圖中N-A—N-H分別代表南五臺每個樣本的總和,X-A—X-C分別代表學校每個樣本的總和

根據OTU列表,可以用樣品在各分類水平(門、綱、目、科、屬)上的物種組成比例情況,來反應樣品在不同分類水平上的群落結構。對不同樣本的真菌群落組成比較可知(圖2),真菌銀耳目(Tremellales)在N-A、N-B、N-G、N-H、X-A和X-B樣本中微生物群落結構所占比例最高,均約50%,而在N-E、N-F和X-C樣本中所占比例較低,不超過30%；真菌木耳目(Auriculariales)在N-D樣本中群落結構所占比例最高達50%,其余目在各個樣本中所占比例相對較少。由此可見,真菌中銀耳目和木耳菌目在蝗蟲腸道中微生物群落結構最豐富。

圖2 不同蝗蟲腸道真菌在目水平上的群落結構組成Fig.2 The community composition of Fungi at the Order level among different grasshopper species

3.3 α多樣性分析

根據OTU聚類分析結果, 采用Chao1,ACE,Simpson, Shannon評估指數分別對樣本進行多樣性分析[22]。Chao1和ACE指數表明N-A和X-A的群落豐富度相對最高,N-E、N-F和N-H的群落豐富度則相對最低；Simpson和Shannon指數表明N-A和X-A的群落多樣性相對最高,而N-D、N-E和N-F的則相對最低。綜合以上可以得出：N-A和X-A的群落豐富度和群落多樣性相對最高,而N-E和N-F的則相對最低。各樣本多樣性指數見表3。

3.4 群落相似性分析

用樣品之間物種進化和豐度信息,進行Unifrac分析,得到樣品間差異距離矩陣,然后用差異距離矩陣進行NMDS分析,得到NMDS圖,如圖3所示,圖中兩點之間的距離越近說明兩者之間的微生物群落差異性越小,即二者的相似性越大。NMDS圖顯示：群落差異較小的組別為N-A (-1.04)和X-A (-1.05),其次為N-B(0.97)和X-B (0.90)、N-E(-0.80)和N-F (-0.76)、N-D(-0.24)和N-G(-0.06),群落差異較大的組別為X-C(0.39)和N-C(0.27)。

表3 各樣本真菌多樣性指數

圖3 各樣品在對群落結構影響最大兩因素下的NMDS圖 Fig.3 The NMDS diagram for each sample in the two most important factors that affect the community structure

3.5 聚類分析

在屬水平上對11個樣本OTU分類進行聚類,如圖4所示。由圖可知,N-B和X-B聚為一類,說明不同環(huán)境下短額負蝗腸道共生真菌在屬水平上群落相似性較高；而N-D和N-F聚為另一類,表明中華雛蝗和峨眉腹露蝗兩物種的腸道共生真菌群落相似性較高。從屬的豐富度分布來看,布勒擲孢酵母屬(Bullera)、鐵艾酵母屬(Tilletiopsis)、油脂酵母屬(Lipomyces)、內疣衣屬(Ochrolechia)、外瓶霉屬(Exophiala)在11個樣本間所占比例較高,相對豐度在2—3之間,為優(yōu)勢菌屬；而青霉菌屬(Penicilliumo)和鐮刀菌屬(Fusarium)這兩個屬是劣勢菌屬。從青霉菌屬中可以篩選到對昆蟲有明顯殺蟲活性的物質,如桔青霉素、紅青霉素和青霉酸等；從鐮刀菌屬中也可篩選到對昆蟲有明顯殺蟲活性的物質,如T- 2霉素、玉米赤霉烯酮和單端孢素等。但是這兩種劣勢菌屬在用傳統培養(yǎng)法研究結果中卻是優(yōu)勢菌屬[23],其主要原因可能是蝗蟲腸道中的真菌很多不能以常規(guī)培養(yǎng)方法所培養(yǎng),或者因為豐度太低或生長太慢沒有被分離純化,從而使得培養(yǎng)法所獲得的種類遠低于高通量方法獲得的種類。

圖4 各樣品腸道真菌在屬水平上的熱圖Fig.4 The heatmap diagram for Fungi at the Genera level

4 分析與討論

目前,對昆蟲腸道微生物區(qū)系的研究大多是針對細菌多樣性研究,而對腸道真菌多樣性的研究報道還比較少[24]。本文以復合條形碼方法研究了蝗蟲成蟲腸道真菌多樣性,從以下幾方面來進行結果分析與討論。

(1)腸道微生物與蝗蟲生活環(huán)境的關系

從類群組成和群落結構來看,校園中的疣蝗、短額負蝗和中華劍角蝗要比分布在南五臺山的相應蝗蟲的真菌類群多些；且斑翅蝗科的真菌類群要比錐頭蝗科及劍角蝗科類群多,從總層次上也可以得出相似的結論。這表明環(huán)境的變化會對同種蝗蟲的真菌多樣性造成一定影響。有研究表示,根據棲息地多樣性與昆蟲的腸道微生物以及昆蟲本身的多樣性呈正相關。這說明昆蟲腸道內的微生物多樣性以及它們的功能與昆蟲所生活的棲息地有密切關系,這些結果對如何減少棲息地生物多樣性可能會影響生活的物種可以發(fā)揮的生態(tài)功能具有重要意義[25]。

(2)腸道微生物與蝗蟲食性的關系

α多樣性是在一個特定區(qū)域或生態(tài)系統內的多樣性,常用微生物的群落豐富度(物種數)和多樣性(均勻度)來度量,也就是估計所鑒定的微生物類群中物種的數量以及各樣本的均勻度。在α多樣性分析中,兩地的疣蝗的腸道微生物群落豐富度和多樣性最高,秦嶺小蹦蝗和峨眉腹露蝗的腸道微生物群落豐富度和多樣性最低,這可能是由于它們的食性差異造成的。研究表明,食性對昆蟲腸道微生物的影響是復雜的[26],每個蝗蟲都有屬于自身的攝食特性,不同種蝗蟲就會由于食性的不同而導致腸道真菌群落豐富度和多樣性有所差異。

(3)腸道微生物組成與分類系統的關系

β多樣性是不同生態(tài)系統之間的多樣性比較,是物種組成在不同環(huán)境或群落間的變化,它是生物多樣性的重要組成部分,與許多生態(tài)學和進化生物學問題密切相關,常用相似性來度量。在此,主要是用來說明不同科和不同取樣地的蝗蟲腸道微生物群落組成的差異,群落差異越小即越相似,說明β多樣性越低；反之,差異越大即越不相似,說明β多樣性越高。從各樣本之間的NMDS圖來看,疣蝗和短額負蝗兩個物種在不同環(huán)境下,其腸道內共生真菌群落結構組成相似,不以取樣地的改變而變化。中華雛蝗和素色異爪蝗、秦嶺小蹦蝗和峨眉腹露蝗的真菌群落結構組成也很相似,但是中華劍角蝗卻因為環(huán)境的不同兩者之間的真菌群落組成相似性較低,且中華劍角蝗的真菌群落組成與其他物種的相似性也較低。由此可見,同科的蝗蟲腸道真菌群落結構相似,不同科的則不相似,中華劍角蝗除外。對于以上這個結論,同科的蝗蟲攝食習慣可能相近,而不同科的蝗蟲攝食習慣則不同,因此,會造成同科的蝗蟲腸道真菌群落組成相似,不同科的則不相似。

DNA 復合條形碼技術擴大了微生物多樣性的研究范圍,為水體和土壤環(huán)境中的微生物多樣性研究打開了一扇大門,尤其可以更加快速高效的用于研究動物腸道微生物多樣性。如Christian Milani等[27]通過擴增16SrDNA序列用Ion Torrent PGM技術研究人類腸道微生物多樣性,結果顯示通過設計PCR引物組可以很好地檢測雙歧桿菌以及人類腸道微生物群落的其他菌群,并且表明復條形碼技術是一個快速、準確、便宜的方法,適合于調查人類腸道微生物群落組成；Shelomi等[28]第一次將高通量測序技術和條形碼相結合用于研究兩類竹節(jié)蟲的脂肪體、唾液腺、前腸和后中腸的微生物多樣性,結果顯示大多數細菌屬于螺旋體屬(厚壁菌門)的菌株,并且主要在孤雌生殖物種竹節(jié)蟲的后中腸,在R. artemis中腸段和Peruphasmaschultei(Pseudophasmatidae)之間沒有顯著性差異；Zhu等[29]通過對大熊貓新鮮糞便的16S rRNA基因序列分析,發(fā)現梭菌屬(Clostridium)的13個OTU中有7個是大熊貓腸道特有的菌群,宏基因組分析結果進一步證實了梭菌能降解纖維素與半纖維素。這些研究都表明DNA復合條形碼技術在腸道微生物鑒定的可行性和有效性,期望此方法以后更廣泛的應用到蝗蟲腸道微生物的研究當中,有助于我們了解蝗蟲腸道內真菌群落的差異、共生真菌的功能作用和對蝗蟲的生長發(fā)育和代謝造成的影響,找到蝗蟲生物防治的新方法,達到預防和控制的目的。

5 結論

(1)從類群組成可知,ITS共鑒定了5門16綱29目40屬2786 OTU真菌。

(2)從群落組成分析可知,在南五臺和校園兩個地區(qū)銀耳目和木耳菌目屬于侵入蝗蟲體內的兩種主要蟲生真菌。

(3)α多樣性分析結果可知斑翅蝗科的真菌群落豐富度和多樣性最高,斑腿蝗科的真菌群落豐富度和多樣性最低。

(4)β多樣性分析結果可知同科的蝗蟲腸道真菌群落結構相似,不同科的則不相似,中華劍角蝗除外。

(5)聚類分析結果可知兩地的短額負蝗聚集到一起,網翅蝗科的中華雛蝗和斑腿蝗科的峨眉腹露蝗聚集到了一起,表明它們兩兩之間的真菌群落相似性較高。在此分析中發(fā)現布勒擲孢酵母屬(Bullera)、內疣衣屬(Ochrolechia)和 外瓶霉屬(Exophiala)3個屬是優(yōu)勢菌屬；而青霉菌屬(Penicilliumo)和鐮刀菌屬(Fusarium)這2個屬是劣勢菌屬。

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StudyofthebiodiversityinintestinalsymbioticfungiingrasshoppersspeciesbyusingDNAmeta-barcoding

YANG Liping, CHANG Huihui, LI Jie, ZHANG Zhibin, HUANG Yuan*

CollegeofLifeScience,ShaanxiNormalUniversity,Xi′an710062,China

DNA meta-barcoding technology, which is a combination of DNA barcoding and high-throughput sequencing, is a highly efficient method for monitoring microbial diversity. In this study, we investigated symbiotic fungi in the gut of 8 grasshopper species collected from Qinling Mountain and campus of Shaanxi Normal University with respects of alpha diversity, beta diversity, and cluster analyses, and evaluated the differences in the microbial diversity of the samples collected from the two locations. A total of 8 individuals from 8 species collected from Qinling Mountain (namely,Trilophidiaannulata,Atractomorphasinensis,Acridacinerea,Chorthippuschinensis,Pedopodismatsinlingensis,Fruhstorferiolaomei,Euchorthippusunicolor, andXenocatantopsbrachycerus) and 3 individuals from 3 species collected from the campus of Shaanxi Normal University (namely,Trilophidiaannulata,AtractomorphasinensisandAcridacinerea) were sampled. The grasshoppers were starved overnight and dissected, and the intestinal gut was fixed in 100% ethanol for DNA extraction. Internal transcribed spacers (ITS) were selected as barcoding sequences. After DNA extraction and PCR amplification using fungus ITS universal primers, the amplicons were sequenced using the 454 FLX+ platform. Two software, Qiime and Mothur, were used to analyze the raw data, and to obtain an operational taxonomic unit (OTU) list. Ecological analysis was subsequently performed using Excel, R, and Qiime software. Analysis of the fungal species composition revealed a total of 2786 OTUs, 40 genera, 29 orders, 16 classes, and 5 phyla. With respect to community composition, analysis of the ITS sequences revealed that the orders Tremellales and Auriculariales contained the highest number of species, and fungus diversity was the highest in Oedipodidae and lowest in Catantopidae. These findings indicated that the diversity of fungi in the gut of the grasshoppers was significantly different. Moreover, the alpha diversity analysis showed that Oedipodidae had relatively high values of community richness and diversity when compared with the other families. The beta diversity analysis demonstrated that the intestinal fungal community structure of the grasshoppers showed no significant difference within a family; in contrast, exhibited more differences among species of different families. However, the gut fungal community structure ofAcridacinereain different environments showed a relatively low similarity. Finally, the cluster analysis showed that grasshoppers from the same family primarily clustered together and their community similarity was relatively high.Bullera,Ochrolechia, andExophialawere the dominant genera among the grasshoppers′ intestinal fungi. This also showed that the fungal populations in the intestines of the grasshoppers were highly diverse in terms of the number of species and their community structure composition, although the differences in the fungal communities varied with the grasshopper host species and surrounding environment.

DNA meta-barcoding; grasshoppers; intestinal symbiotic fungus; fungus diversity

國家自然科學基金(31372192)

2016- 06- 21; < class="emphasis_bold">網絡出版日期

日期:2017- 06- 01

*通訊作者Corresponding author.E-mail: yuanh@snnu.edu.cn

10.5846/stxb201606211216

楊麗平,常會會,李杰,張智斌,黃原.基于DNA復合條形碼技術的蝗蟲腸道共生真菌多樣性研究.生態(tài)學報,2017,37(20):6905- 6913.

Yang L P, Chang H H, Li J, Zhang Z B, Huang Y.Study of the biodiversity in intestinal symbiotic fungi in grasshoppers species by using DNA meta-barcoding.Acta Ecologica Sinica,2017,37(20):6905- 6913.